2018, Vol. 39
氮素是我国水体污染物的主要控制指标之一, 我国废水中氮元素严重危害环境安全和人体健康.目前, 含氮废水处理的主要方法之一是传统的硝化-反硝化生物脱氮工艺, 但是其引发的高能耗、高运行成本、高温室气体N2O排放等问题受到广泛关注[1].近年来出现了一系列污水生物脱氮革新工艺, 如同步硝化反硝化(simultaneous nitrification and denitrification, SND)工艺[2]、短程硝化-厌氧氨氧化(partial nitrification-anaerobic ammonium oxidation, PN-ANAMMOX)工艺[3]等, 不仅大大节约了运行成本, 还可减少N2O的排放.但是, 现有的污水脱氮新技术大多将碳氮转化割裂开来, 存在污水处理路线复杂、能量利用效率低等问题.亚硝酸盐依赖型反硝化型甲烷厌氧氧化(nitrite-dependent anaerobic methane oxidation, N-DAMO)是近年来新发现的脱氮途径, 耦合了亚硝酸盐的还原和甲烷的厌氧氧化, 是环境科学和微生物学领域中最重要的发现之一, 引起了广泛的关注. Raghoebarsing等[4]和Ettwig等[5, 6]均对N-DAMO的反应机制进行了阐述, 其反应式见式(1).
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(1) |
催化N-DAMO反应的主体为Candidatus Methylomirabilish oxyfera (M. oxyfera)细菌, 由于其倍增时间长达1~2周, 反应速率慢[7, 8], 是现如今N-DAMO研究应用的最重要限制因素之一[9], 因此近年来关于N-DAMO过程的研究多集中在其启动速率优化和反应条件的探索上.蔡琛[10]总结出水稻土壤和人工培养基是启动N-DAMO反应的较优条件; Hu等[11]的研究发现了磁力搅拌反应器中的N-DAMO反应最大体积除氮速率(以NO2--N计)可达76.9 mg·(L·d)-1; Bhattacharjee等[12]的研究发现甲烷鼓泡的膜生物反应器能够促进N-DAMO反应的启动; 而赵荣等[13]在探究出最佳的pH、温度和盐度综合的培养条件下, 用时13个月后达到(7.350±1.768)μmol·h-1的N-DAMO反应速率(以NO2-计), 仍离实际应用的要求有较大差距.
值得注意的是, 目前涉及到N-DAMO反应的研究大多是在常压条件下进行的, 而实际上N-DAMO微生物大多分布于存在静压的沟渠沉积物[14]、河床沉积物或深层土壤中[15].有研究表明, 静压条件对微生物生长繁殖与代谢有重要的影响. He等[16]对湿地中N-DAMO菌的垂直分布进行了分析测试, 发现深层土壤中N-DAMO菌的丰度明显大于浅层土壤[17]; Deusner等[18]对与N-DAMO反应十分类似的硫酸盐型甲烷厌氧氧化(sulphate-dependent anaerobic methane oxidation, SAMO)反应进行了静压实验, 单位SAMO的反应速率较传统条件下提升了6倍; 乔长晟等[19]的研究证明, 适当的静压能够显著优化同样是厌氧细菌的蓝色犁头霉菌的代谢情况; 因此, 可以假设, 适当提高静压能够强化N-DAMO反应的启动.
本研究采用静压SBR启动N-DAMO反应, 通过对启动时间、脱氮性能、污泥性状、N-DAOM反应相关菌的数量等进行对比分析, 探究静压对N-DAMO反应启动过程的影响, 以期为N-DAMO过程的工艺优化和实际应用提供依据和参考.
1 材料与方法 1.1 反应器设计与运行实验过程中平行运行了两套圆柱SBR, 有效容积均为2.5 L, 结构如图 1所示.对照组(R1)采用有机玻璃制造, 在常压条件(0.1 MPa)下运行, 以2 mL·min-1的速率连续通入99.9%的CH4作为碳源; 实验组(R2)为不锈钢反应釜, 在每次进水后利用99.9%的CH4加压至0.3 MPa进行反应.尽管不同的静压可能导致不同的甲烷分压, 但本研究中甲烷的分压均高于其限制阈值25.33 kPa[20], 另外有研究表明, 在有水合物存在的情况下, 压力不是影响甲烷溶解度的重要因素[21].因此在本研究中甲烷分压并不是N-DAMO反应的限制因素.为了尽可能降低NO2-对N-DAMO微生物的毒害作用, 采用阶段性提升NO2--N浓度的进水方式进行富集启动.
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图 1 实验装置示意 Fig. 1 Sketch of the experimental setup |
本实验过程中, 系统温度控制在(31±1)℃, 每个运行周期均为48 h.其中进水期为0.5 h, 反应期为46 h, 沉淀期为1 h, 排水期为0.5 h.排水比为0.5, 每个周期结束后向反应器中加入1.25 L经氩气充分曝气的脱氧模拟废水, 水力停留时间为96 h.
1.2 接种污泥和配水方案反应器中的接种物是将山东省济南市光大水务厌氧池污泥和济南市黄河南岸旱稻田深层土按照1:1的比例混合得到的种泥, 实验过程中, 维持两个反应器内污泥浓度为10 g·L-1.
模拟污水(用99%Ar饱和, 排除O2)参考Raghoebarsing等[4]的报道, 组成成分为：KHCO3, 0.25 g·L-1; KH2PO4, 0.05 g·L-1; CaCl2, 0.225 g·L-1; MgSO4·7H2O, 0.2 g·L-1; pH控制在7.0~7.3, 酸性微量元素母液0.1 mL·L-1, 碱性微量元素母液0.05 mL·L-1, 微量元素母液成分见表 1.
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表 1 微量元素母液成分 Table 1 Composition of the microelement mother liquor |
1.3 N-DAMO活性测试
自R1、R2中各取适量污泥, 使用无氧水洗涤3次.取0.6 g洗涤后污泥转移至血清瓶, 添加NO2--N浓度为0.5 mmol·L-1的模拟污水至瓶中, 定容至300 mL.每种污泥设置一个平行和一个对照, 其中对照组的介质为纯水.每个血清瓶用氩气吹脱氧气后加入适量CH4, 控制CH4浓度约为9 mmol·L-1.将血清瓶置于30℃水浴中并利用磁力搅拌器进行搅拌, 与R2同步运行48 h.每隔4 h取血清瓶和反应器中水样分析其中NO2-浓度, 取血清瓶中气样分析其中CH4浓度.
1.4 测定项目和方法每个周期结束后, 分别取一定量上清液, 分别采用pH计(pH3210, WTW)和溶解氧(dissolved oxygen, DO)仪(Multi3420, WTW)测定pH和DO; 另取一定量上清液, 采用文献[22]中的方法分析NO3-、NO2-的浓度.
在每次提升NO2--N负荷前(即两个反应器的NO2--N去除率均稳定高于95%后)和实验末期, 自两个反应器中分别取适量悬浊液, 离心弃去上清液, 固体保存至-20℃用于后续DNA提取和微生物分析.采用实时定量基因扩增荧光监测系统(qPCR)实验进行M. oxyfera菌16S rRNA的基因扩增.使用装有序列检测软件(Applied Biosystems, USA)的qPCR扩增仪LightCycler@480Ⅱ(Roche, 瑞士), 通过SYBR染料法(SYBR® Premix Ex TaqTM, TaKaRa, 日本)对NC10门细菌的16S rRNA基因定量分析.选用引物为qP1F/qP1R[23], 引物序列及扩增程序见表 2.
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表 2 本实验中用到的引物以及相关的程序[23] Table 2 Primers and related thermals used in the present experiment |
在本实验末期, 于R1、R2中各取出10 mL的污泥, 采用激光粒度分布仪(BT-9300H, 百特仪器有限公司)进行分析.另外于R1、R2中各取出适量的污泥, 利用扫描电镜进行观察、拍照.
2 结果与讨论 2.1 N-DAMO反应的启动本实验过程中, R1的NO2--N负荷由15 mg·L-1提升至120 mg·L-1, R2由15 mg·L-1提升至150 mg·L-1, NO2--N去除率随时间的变化情况见图 2.在进水浓度提升至30 mg·L-1及以上后, R1在每次NO2--N浓度提升后, NO2--N去除率均出现较为明显的先下降后上升波动, 且去除率达到稳定的耗时随NO2--N浓度的提升而延长; R2除启动前期(0~40 d)去除率轻微波动外, 启动中后期, 浓度提升过程中其去除率均稳定在95%左右, 即在较高的NO2--N浓度条件下, R2更能显示出其优越性, 启动过程快速稳定.在富集启动期结束后, 在R1、R2中的NO2--N浓度最终分别稳定于120 mg·L-1和150 mg·L-1, R2在48 h的运行周期内处理效率比R1高25%. R1的亚硝氮去除速率达到29.8 mg·(L·d)-1, 与文献[24]中报道的28.2 mg·(L·d)-1相近.然而, 在静压条件下的R2, 其平均NO2--N去除速率达到了36.9 mg·(L·d)-1, 是常压条件下的1.2倍, 同时也大幅高于目前文献报道的28.2 mg·(L·d)-1的最大速率[24].这一结果表明, 在0.3 MPa的静压作用下, R2有良好的NO2--N去除效果, 优化了N-DAMO反应的启动性能.
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图 2 N-DAMO反应启动过程中水质变化 Fig. 2 Variation of the NO2--N concentration during the start-up of the N-DAMO process |
在培养启动期结束后进行的活性测试, 结果如表 3中所示, 其中分别为R1污泥和R2污泥在常压条件下活性测试得到的脱氮速率和同步运行R2得到的脱氮速率.对比R1污泥和R2污泥在常压下的平均脱氮速率可知, 后者对NO2--N的处理效果优于前者, 即R2污泥对于NO2--N的处理速度更快; 通过对比R2污泥在常压和0.3 MPa下的脱氮速率可知, 在利用同样的污泥进行处理的情况下, 静压环境下的微生物处理NO2--N的效率更高, 符合快速启动的要求.活性批次实验运行24 h后R2污泥在常压和0.3 MPa的平均脱氮速率相等, 均为0.021 mmol·(L·h)-1, 说明此时两个反应系统中的NO2--N都已经消耗尽; 同理可知, 48 h时3个系统中的NO2--N均已经反应完毕.
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表 3 N-DAMO活性测试平均脱氮速率 Table 3 Average nitrogen removal rate of the N-DAMO activity test |
通过活性测试进行到12 h得到的数据, 计算得到R1污泥在常压条件下反应的N-DANO比活性(以N/VSS计, 下同)为0.17 mg·(g·h)-1, 与之前文献报道中的数值接近[10], 而R2污泥在常压和静压条件下的N-DAMO比活性分别为0.25 mg·(g·h)-1和0.29 mg·(g·h)-1, R2污泥的N-DAMO活性远高于R1污泥, 即相比较而言, R2启动得到的污泥可以在高压条件下实现最佳的NO2--N处理效果, 这一结论与反应器启动阶段NO2--N去除率监测的结果具有一致性.因此静压条件对于N-DAMO相关微生物的富集和代谢均具有促进作用, 进而有助于N-DAMO反应的快速启动.
2.2 静压对污泥性能的影响为了研究静压条件对污泥性能的影响, 进行了粒径分布实验, 结果如图 3所示. R1中污泥的中位粒径为18.31 μm, 体积平均粒径为20.88 μm; R2污泥的中位粒径为32.83 μm, 体积平均粒径为34.16 μm, 这表明在静压条件的作用下, R2的污泥粒径更大, 接近R1中污泥粒径的2倍, 因此R2的污泥具有更好的成团性, 进而有利于污泥内部厌氧环境的形成和维持, 促进目标反应发生和整个N-DAMO反应过程的启动.
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图 3 不同反应器的污泥粒径分布 Fig. 3 Particle size distribution of sludge in different reactors |
图 3中区间质量分数的数据表明, R2中污泥的粒径分布更集中, 90%的污泥粒径集中在11.11~68.58 μm之间. R1和R2污泥的比表面积分别为216.08 m2·kg-1和110.19 m2·kg-1, R2污泥的比表面积小于R1, 这是由于污泥颗粒成团导致的.较小的比表面积进一步优化了污泥内部的厌氧情况.由于厌氧条件是促进N-DAMO微生物富集和N-DAMO反应发生的关键因素, 因此静压条件下得到的污泥具有更好的甲烷厌氧氧化耦合反硝化效果, 能够快速启动N-DAMO反应, 与图 2得到的结论一致.
在培养启动期结束后, 对污泥进行扫描电镜观察, 结果如图 4所示. R1污泥中细菌表面比较光滑, 而R2的污泥中细菌表面更粗糙, 与目标反应物NO2--N和甲烷的接触面积更大, 在静压条件下具有更快的传质速率; 有研究指出, 甲烷的传质速率是影响M. oxyfera细菌所属NC10门细菌培养的重要因素[25], 因此在R2中, 表面粗糙的目标菌可以获得更快的传质速率, 进而促进了整个反应的快速启动.
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(a)对照反应器(R1);(b)静压反应器(R2) 图 4 实验末期污泥扫描电镜图 Fig. 4 SEM images of both SBRs at the end of the study period |
通过对各个阶段R1、R2的污泥进行qPCR实验, 得到表 4中的结果.在进水NO2--N浓度较低的前3个阶段(≤60 mg·L-1), R1和R2中M. oxyfera细菌的丰度随进水浓度的提高而提升, 且R1污泥中M. oxyfera细菌的丰度略高于R2, 这是由于R2中M. oxyfera细菌对静压环境尚未完全适应, 这也解释了启动阶段0~40 d R2出水水质的波动情况.当进水浓度提升至60 mg·L-1时, R2污泥M. oxyfera细菌的丰度略高于R1, 表明这一阶段, M. oxyfera细菌已经适应了反应器中的静压环境, 并且R2初步显现了在静压条件下对M. oxyfera细菌富集作用的优越性.当进水浓度达到90 mg·L-1时, R1污泥中M. oxyfera细菌的丰度较60 mg·L-1的浓度时有一定的增长, 但是和文献中报道的结果类似, 生长速率较慢[5, 26], 仅为同样浓度时R2中M. oxyfera细菌丰度的一半左右, 这也进一步表明静压可以促进目的菌的富集生长.
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表 4 M. oxyfera细菌16S rRNA基因的丰度×109/copies·g-1 Table 4 Abundance of 16S rRNA genes in M. oxyfera bacteria ×109/copies·g-1 |
在进水浓度达到120 mg·L-1时, R1中M. oxyfera细菌丰度较之前出现了大幅的下降, 是由于模拟污水中浓度为120 mg·L-1的NO2--N具有一定的毒性[27], 且其浓度超过了文献所报道的抑制常数[25], 因此对N-DAMO微生物起到了一定的抑制作用.而R2中M. oxyfera细菌的丰度在达到120 mg·L-1后出现了大幅度的提升, 是同期R1中M. oxyfera细菌丰度的9.31倍; 当提升至150 mg·L-1后, 与R1中情况不同, R2中M. oxyfera细菌的丰度较接种初期提高了22.04倍, 即高浓度的NO2--N并未对R2中的M. oxyfera细菌的丰度和活性产生抑制, 反而使得M. oxyfera菌进一步增殖; 也正是由于M. oxyfera细菌的富集, R2在这一阶段的亚硝氮处理效率稳定保持在95%左右.这一结果证实, 静压显著提高了M. oxyfera细菌对NO2--N毒性的耐受性, 进一步优化了反应器中N-DAMO的活性和反应效率.在实验结束时, 静压反应器中M. oxyfera细菌丰度达到2.91×1010copies·g-1, 是蔡琛[10]在现有研究最优条件下富集得到M. oxyfera细菌丰度的2.31倍, 富集增殖效果显著, 且实现了对N-DAMO反应的快速启动.
3 结论(1) 静压条件有利于N-DAMO反应的快速启动, 培养得到的污泥对NO2--N具有良好去除效果.经过120 d阶段性NO2--N浓度提升的培养启动后, 0.3 MPa静压条件下污泥的N-DAMO反应的氮去除速率(以NO2--N计)达到了36.90 mg·(L·d)-1, 是常压条件下的1.24倍.
(2) 在静压SBR中富集得到了较大粒径的污泥, 中位粒径和体积平均粒径约为常压条件下污泥的2倍.静压反应器中富集得到的污泥在具有良好成团性和厌氧情况的同时, 粒径更均匀, 有助于N-DAMO反应的进行.
(3) qPCR实验结果表明, 静压条件下M. oxyfera细菌16S rRNA基因的丰度最终达到了2.91×1010copies·g-1, 较接种初期提高了22.04倍, N-DAMO微生物的大幅增殖提高了反应器对于NO2--N的耐受性.
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