2018, Vol. 39
2. 中国科学院南京土壤研究所, 土壤与农业可持续发展国家重点实验室, 南京 210008
2. State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China
根际真菌在植物-土壤生态系统中发挥重要的作用, 影响植物的生长和健康状态[1].植物种类、生长状况、根系分泌物等植物自身因素和CO2浓度、重金属与化学物质、施肥等外界因素都可以对根际真菌造成影响[2].生物炭常被作为土壤改良剂, 用于吸附土壤污染物质, 改善土壤环境, 提高土壤肥力.生物炭可通过直接或间接的方式影响土壤真菌的群落结构、功能、酶活性等方面.直接影响机制包括：①生物炭可为真菌提供栖息地[3]; ②生物炭本身含有丰富的营养物质, 可促进真菌生长[4].间接影响机制包括：①生物炭通过影响物理化学环境来改变土壤养分的可用性, 从而间接地影响土壤真菌[5]; ②生物炭通过改变其他微生物种群(例如菌根促生细菌和溶磷菌)的活性, 进而间接地影响真菌的生长[5].然而, 生物炭的应用对根际真菌群落演替的影响还有待进一步的研究.
在复杂的生态系统中, 相比于群落的丰度和多样性, 群落之间的相互作用对生态系统的功能更加重要[6].因此, 共生网络在探索微生物群落之间的联系、了解微生物群落的基本原理和确定群落中可能的关键物种的研究中起到至关重要的作用[7].例如, Toju等[8]将生态网络分析应用到植物根系的真菌群落中, 重点突出了在精细组装过程中真菌的种间相互作用关系的重要性.此外, 这种群落规模的分析可以帮助人们推断出不同分类或不同功能群的真菌是如何构建潜在的相互作用关系的, 以及这些网络是如何被分割成一些紧密关联的“模块”的[9].一个生态网络可被分成多个模块, 每个模块的内连接程度很高, 具有相似的生态学特征.网络分析可将微生物之间的积极、消极的相互作用关系可视化[10].迄今为止, 关于生物炭对根际土壤真菌群落间的相互作用的研究还比较少.
本研究利用高通量测序技术的Illumina MiSeq测序平台, 通过对添加生物炭处理和不添加生物炭的对照处理下的施粪肥土壤根际真菌进行ITS2区测序, 研究了生物炭对土壤根际真菌的群落结构与分子生态网络的影响机制, 建立了土壤微生态环境与真菌群落变化的关系.
1 材料与方法 1.1 试验设计及采样分析土壤样品采自中国江苏省常州市(119.75°E, 31.73°N)某畜禽养殖公司的水稻试验田(其土壤中不含抗生素), 样品取自土壤表层10 cm以内.粪肥来自该畜禽养殖公司的生猪养殖场.将水稻田土壤和粪肥风干, 分别过2 cm筛, 然后粉碎, 取均质的土壤和粪肥按100:1的比例(质量比)搅拌均匀混合, 混合后静置24 h, 之后再次搅拌均匀混合, 再静置24 h后将土壤移入盆栽中.供试黑麦草种子购自江苏省农业科学院牧草研究所.生物炭样品由小麦秸秆在650℃缺氧条件下热解炭化而成.
本试验共设置54盆黑麦草盆栽.对照组(不添加生物炭)、生物炭组(生物炭按2%的比例均匀添加到黑麦草盆栽土质中)分别为27盆(每盆1 kg土壤), 其中每个取样天数分别设置3个重复样, 将对应的盆栽做好编号.每盆播种30粒大小均匀饱满的种子, 在种苗发芽后的第0、5、10、15、20、25、30、35、40 d分别将黑麦草从对应盆栽中取出, 采用抖落方法将每盆土壤(对应各取样天数)的根际土壤收集好(若土样量无法达到测试要求, 则使用小型铁锹刮取根系周围 < 1 cm范围的土壤), 用于土壤理化性质和根际真菌的测定.保留其中第10、20、25、35 d对应盆栽的黑麦草, 用于测定黑麦草根系体表形态学参数.由于施粪肥土壤中含有大量残留抗生素, 会对土壤真菌产生一定影响[11], 同时也利用固相萃取, HPLC-MS-MS测定了3类8种抗生素(四环素、金霉素、强力霉素、磺胺二甲基嘧啶、恩诺沙星、洛美沙星、环丙沙星、诺氟沙星)[12].
1.2 土壤微生物总DNA提取称取2 g土壤样品, 经过液氮冷冻研磨后, 采用Power Soil DNA isolation kit(MoBio Laboratories, Inc., Carlsbad, CA, U.S.A)提取试剂盒提取土壤总DNA.具体操作步骤参照试剂盒说明书.采用Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, U.S.A)测定DNA浓度和纯度(D260/D280和D260/D230).提取后的DNA样品在-80℃条件下低温保存.
1.3 根际土壤真菌高通量测序将土壤总DNA送上海天昊遗传分析中心进行高通量测序.土壤真菌测序引物为ITS3F(5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和ITS4R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′).对样本进行ITS2区的PCR扩增, 设置3个重复试验, 以标准的真菌基因组DNA Mix作为阳性对照.利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增后的产物, 通过核酸纯化磁珠对扩增产物进行纯化, 得到一个样本的原始文库.然后, 对文库进行定量混合以及质量检测.本研究采用MiSeq平台, 2×250 bp的双端测序策略对文库进行测序.使用TrimGalore、FLASH2、Mothur和Usearch软件对原始下机数据进行质量控制和过滤.按照97%的相似性对序列进行OTU聚类分析.使用Mothur软件的classify.seqs命令以及UNITE比对数据库, 找出与OTU序列相似度最高且可信度达80%以上的物种信息完成OTU的分类学注释.
1.4 数据分析本研究中采用的α多样性指数用Shannon指数进行表征.方差分析是在R(3.2.5)中使用multcomp软件包完成的.通过使用Cytoscape(3.4.0)软件中CoNet插件构建微生物生态网络研究土壤真菌群落间的相互作用.分析步骤和网络参数选择参照顾静馨[13]提供的操作指南.网络分析中, 选择4种相关分析方法, 即Pearson correlation、Spearman correlation、Bray-Curtis dissimilarity和Kullback-Leibler dissimilarity, 并设置1000的起始连接数.然后, 采用Benjamini-Hochberg方法进行标准化处理相关系数, 即对原有假设检验得到的显著性P值(P-value)进行校正, 并最终采用校正后的P值, 保留P < 0.05的相关OTU构建关联网络.同时, 利用NetworkAnalyzer分析所得到的网络, 获得网络拓扑参数(网络节点数、连接数、聚集系数、网络直径、特征路径长度和网络密度等)表征真菌群落的分子生态网络结构的特征.采用Mantel检验分析方法评估植物根系、土壤环境条件、抗生素等因子对土壤真菌群落的影响, Mantel检验在R(3.2.5)中使用ecodist软件包完成.
2 结果与分析 2.1 土壤真菌群落多样性分析本研究共对54个样本进行真菌ITS2区高通量测序分析, 每个样本获得的序列数范围为44941~98438 reads.各样品文库的覆盖率均达到98%以上, 所以样本中绝大多数序列均可被测出, 因此本次测序结果可以代表样本的真实情况.通过计算土壤真菌α多样性指数(图 1), 比较发现, 同一采样时间不添加生物炭的对照组与添加生物炭处理之间差异并不大, 除第10 d外, 其余处理之间均无显著性差异.整体的变化趋势呈现出后期(30~40 d)的真菌α多样性显著高于前期(0~10 d, P < 0.05).
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不同小写字母表示同一采样时间不同处理间差异显著(P < 0.05), 不同大写字母表示同一处理不同采样时间差异显著(P < 0.05) 图 1 土壤真菌群落Shannon指数 Fig. 1 Shannon index of the soil fungal communities |
门类级别下不同处理间土壤真菌类群分布如图 2所示, 主要类群为子囊菌门(Ascomycota, 59.64%~84.80%)、担子菌门(Basidiomycota, 1.90%~5.87%)和接合菌门(Zygomycota, 4.34%~16.11%).在土壤中添加生物炭之后, 真菌类群分布明显改变, 子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)的相对丰度分别在采样的第35 d和第30 d显著降低(P < 0.05).
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图 2 门类级别下土壤真菌类群分布 Fig. 2 Taxonomic composition of soil fungal communities by different treatments at phylum level |
为了进一步探究土壤真菌群落种间的相互作用, 基于显著相关性构建添加生物炭处理和不添加生物炭的对照处理的土壤真菌群落的分子生态网络(图 3), 并对真菌网络的基本拓扑性质进行了分析(表 1).结果表明, 节点之间的连接主要是正相关的连接.与不添加生物炭的对照组相比, 施加生物炭之后的网络结构更为复杂, 节点数、连接数、聚集系数和网络密度均增加.尤为重要的是, 添加生物炭相比于不添加生物炭的对照处理显著增加了群落之间的积极联系(P < 0.05).
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每个节点表示一个真菌的OTU, 每个节点的大小与度数成正比; 蓝色连线表示节点间的正相互作用, 红色连线表示节点间的负相互作用 图 3 对照和生物炭处理下土壤真菌的网络相互作用 Fig. 3 Network interactions of fungal OTUs in the control and biochar soil samples |
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表 1 对照和生物炭处理下土壤真菌群落的分子生态网络的拓扑性质 Table 1 Topological parameters of the fungal networks from the control and biochar soil treatments |
为了评估主要的真菌门类之间的潜在相互作用, 计算了真菌门类相互之间的连接数(图 4).不添加生物炭的对照处理中, 子囊菌门(Ascomycota)丰度主要与担子菌门(Basidiomycota)和壶菌门(Chytridiomycota)丰度呈显著负相关关系(P < 0.05).然而, 施加生物炭的处理中, 子囊菌门(Ascomycota)丰度倾向于与壶菌门(Chytridiomycota)(共6个连接数中占5个正连接数)和接合菌门(Zygomycota)(共5个连接数中占4个正连接数)存在显著的积极联系(P < 0.05).总之, 在土壤中施加生物炭之后, 真菌门类之间积极的相互作用更加显著.
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蓝色表示正相互作用，红色表示负相互作用，白色表示无显著关联 图 4 对照和生物炭处理下真菌网络中门类之间联系的饼状图 Fig. 4 Number of associations among fungal phyla in the networks |
为了确定在添加生物炭的处理和不添加生物炭的对照处理中植物根系、土壤pH、土壤微量元素、土壤物理结构和抗生素这5种环境因素对真菌丰度和真菌间相互作用(网络正连接数/负连接数)的影响以及植物根系与其他环境因子之间的相关性, 进行了Mantel检验分析(表 2和表 3).分析结果显示, 植物根系显著影响真菌丰度和真菌间的相互作用, 特别是在施加生物炭的处理中影响尤为强烈(r=0.402, P=0.001; r=0.265, P=0.001).相比于不添加生物炭的对照处理, 施加生物炭之后, 植物根系对土壤微量元素(r=0.179, P=0.001)、土壤物理结构(r=0.466, P=0.001)和抗生素(r=0.120, P=0.009)的影响稍弱, 但对土壤pH(r=0.169, P=0.002)的影响显著增强.土壤pH对真菌间相互作用的影响显著增强(r=0.310, P=0.001), 但对真菌丰度的影响显著降低(r=0.136, P=0.008).此外, 随着生物炭的添加, 土壤物理结构对真菌丰度(r=0.198, P=0.002)和真菌间相互作用(r=0.086, P=0.049)的影响变得显著了.在笔者的前期研究中发现, 添加生物炭后, 土壤中抗生素消减速率显著提高[12].在本研究中, 添加生物炭前后, 土壤中抗生素的消减对真菌丰度变化影响均不显著.而添加生物炭后, 由于抗生素消减速率明显提高, 真菌间相互作用会显著增强(r=0.138, P=0.041).
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表 2 环境因子与真菌丰度和相互作用的Mantel检验分析1) Table 2 Mantel test results to discern the correlation between environmental factors and fungal abundance and interaction |
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表 3 植物根系与环境因子之间相关性的Mantel检验分析1) Table 3 Mantel test results to discern the correlation between plant root and environmental factors |
3 讨论 3.1 真菌网络结构的变化
在本研究中, 通过构建分子生态网络, 探讨了添加生物炭处理和不添加生物炭的对照处理下土壤真菌之间的相互作用(图 3).一般来说, 随着生态系统中可用资源的增多, 生态系统的结构也会变得更为复杂[14], 这与本研究的结果是一致的, 相比不添加生物炭的对照组, 在施加生物炭处理中真菌之间的联系更多(图 3和表 1).这可能与生物炭的添加促进了植物根系的生长有关.生物炭能够改变根际间的微生物与植物之间的联系, 影响土壤有益微生物与土壤传播的病原菌之间的竞争, 并触发植物系统对土壤传播的病原菌进行防御, 从而有益于植物的生长[15].在添加了生物炭之后, 植物根系是影响真菌间相互作用的主要因素(r=0.265, P=0.001, 表 2).植物根系带来了根际真菌数量的增加, 增加的这些根际真菌可能通过改变养分循环和有机物质的分解重新分配资源, 进而改变了网络关系[16].另外, 真菌之间的联系变多也可能是由于生物炭的添加一定程度上改善了土壤物理结构, 使得土壤孔隙度要优于不添加生物炭的对照组, 从而导致了养分矿化速度加快[17], 土壤中真菌的活性增强.而土壤物理结构的改善显著影响了真菌间的相互作用(r=0.086, P=0.049, 表 2).同时, 生物炭可以通过吸附在生物炭颗粒上的营养物质和离子为土壤真菌的生长提供养分来源[15]. Zhang等[18]的研究表明, 真菌能够定植含有较高的有机碳, 碳氮比和总氮的土壤大团聚体(>200 μm).生物炭的应用, 能够促进大团聚体的形成, 因而有利于真菌的生长. Gibson等[19]发现老化生物炭中表面官能团的变化改变了酶和底物的吸附能力, 从而影响酶的活性.例如, 在生物炭非生物老化过程中, 芳香炭的氧化和脂肪族碳氢基团的引入, 改善了漆酶和过氧化物酶的活性, 增强了真菌的呼吸, 提高了真菌的活性, 从而影响真菌群落间的关系.
添加生物炭的处理相比于不添加生物炭的对照处理, 显著增加了真菌群落之间的积极联系(P < 0.05, 表 1).而且, 真菌的主要类群子囊菌门(Ascomycota)分别与壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)也呈现出显著积极的相关性(P < 0.05; 图 4).这一现象可能与生物炭的多孔性和表面特性有关.生物炭的这种性质为土壤真菌生长与繁殖提供了良好的栖息环境, 减少了真菌之间的生存竞争[3]. Quilliam等[20]的研究表明, 生物炭的孔隙能更好地保护真菌免受竞争者的影响. Abel等[21]的研究发现, 生物炭可以通过改善土壤的物理性质来改变微生物的栖息地, 进而促进微生物间的合作关系, 而合作关系可使土壤资源得到更好地利用[9].另外生物炭的添加增加了土壤pH也可能是造成这一结果的原因[12].在生物炭处理中, pH是影响真菌种间关系的关键因素(r=0.310, P=0.001, 表 2), Nielsen等[22]的研究表明, 在添加生物炭后, 土壤pH值增加了0.2~0.3个单位, 土壤pH与土壤中的其他化学变量(如总碳含量、总氮含量、电导率等)相比, 可能是影响土壤微生物群落的主要因素. Shi等[23]发现环境条件的变化(土壤pH和温度等)能够影响微生物生态网络.然而, 生态网络分析技术是一种基于数学模型分析生态系统中内在作用关系的方法, 存在一定的局限性, 未来还需要通过室内试验验证[24].
3.2 影响真菌群落结构的机制本研究通过对添加生物炭的处理和不添加生物炭的对照处理进行Mantel分析(表 2和表 3), 结果显示植物根系通过本身的直接作用以及对土壤pH、土壤微量元素、土壤物理结构、抗生素的间接作用影响真菌的丰度和真菌间的相互作用.植物根系在真菌的丰度和真菌间相互作用中起决定作用.可能与植物根系对根际土壤周围真菌生长的直接或间接的(通过显著影响土壤微量元素、土壤物理结构和抗生素)促进有关.当土壤添加生物炭之后, 植物根系对于真菌的丰度和真菌间相互作用的直接影响显著变强(r=0.402, P=0.001; r=0.265, P=0.001).这可能由于生物炭的添加有利于植物根系的生长.生物炭添加到土壤中可以增加土壤有机碳的含量, 提高土壤有效性营养元素的含量, 从而促进植物生长[25].正如Xu等[26]的报道, 生物炭可以通过改善土壤化学条件和改变营养物质的可用性来提高作物产量.同时, 生物炭可以通过影响土壤中的根际真菌直接影响植物的生长[3].据许多学者研究, 土壤中添加生物炭, 可有效防止病害真菌侵染植物, 从而间接地促进植物的生长发育. Elad等[27]发现, 生物炭的应用成功诱导了辣椒和西红柿植物对两种叶面真菌性病原菌的抗性. Graber等[28]也发现生物炭中的一部分挥发性有机物可以对土壤微生物病原菌产生直接的毒害作用, 对植物的生长发育起到保护作用.这也再次印证了前面所述的生物炭的添加促进了植物根系的生长的假设.此外, 相比于不添加生物炭的对照组, 添加了生物炭的处理中, 土壤物理结构对于真菌的丰度的影响变得显著了(P=0.002), 土壤pH, 土壤物理结构, 抗生素对真菌种间关系的影响变得显著了(P < 0.05).这可能与生物炭对土壤pH及土壤物理结构的改善有关[15].土壤中的抗生素极易被植物吸收积累, 某些植物对土霉素等抗生素的吸收可能涉及主动吸收机理, 但具体的吸收富集机理还有待进一步研究[29].国内外有不少学者研究生物炭施用对土壤中抗生素吸附行为的影响, 结果表明生物炭的应用明显降低了土壤中有效态抗生素含量, 改变了土壤中微生物结构和功能代谢[30, 31]. Liang等[12]发现添加了生物炭的处理相对于不添加生物炭的对照处理对于抗生素的消减效果更好, 因此, 添加生物炭后, 土壤中抗生素的迅速消减显著促进了真菌种间关系的改善, 有利于真菌合作关系的增强.
4 结论利用高通量测序技术, 分析了添加生物炭对施粪肥土壤中真菌群落结构以及种间的相互作用关系的影响.本研究表明生物炭的应用显著影响了植物根系和土壤环境变量, 导致土壤真菌α多样性的轻微变化; 增加了土壤真菌之间的网络相互作用, 显著加强了积极联系.未来需要进一步开展田间试验, 揭示田间条件下生物炭对土壤根际真菌的影响, 并通过模式菌群构建, 验证分子生态网络.
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