2018, Vol. 39
2. 中国科学院生态环境研究中心, 北京 100085;
3. 北京城市排水集团有限责任公司, 北京 100044
2. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China;
3. Beijing Drainage Group Co. Ltd., Beijing 100044, China
厌氧消化是污水处理厂产生的剩余污泥最常用的末端处理方式之一[1], 具有减少污泥体积, 削减病原菌微生物, 改善污泥性能, 产生沼气等优点[2].污泥的水解阶段是厌氧消化过程的限速阶段, 污泥微生物细胞中的有机物释放困难则是水解缓慢的主要原因之一[3].预处理可以破坏剩余污泥的细胞结构, 释放细胞内有机物质, 显著增强厌氧消化.在众多预处理方法中, 微波预处理是一种有效的污泥预处理方法, 加热速率高, 可促使污泥溶胞破壁释放大量溶解性有机物, 提高污泥的生物可降解性及厌氧产气效果[4~6].近年来人们也对微波与酸、碱、H2O2等相结合的组合预处理工艺进行了探索[7].本课题组之前的研究表明, 优化后的微波-H2O2-碱组合工艺比单独微波预处理对溶解性有机物的释放及厌氧消化的增强具有更好的效果[8].
污泥性质对预处理过程释放的溶解性有机物及可生物利用性[9], 以及厌氧消化产甲烷效果都起到重要影响作用[10, 11].实际污水厂的剩余污泥性质差别较大, 但目前人们对不同性质的污泥微波组合预处理-厌氧消化的关注较少.产甲烷菌属于古菌, 是厌氧消化过程的重要功能菌群, 然而不同性质剩余污泥的古菌群落结构差异如何, 古菌群落结构在预处理-厌氧消化过程中的演替尚缺乏研究与探讨.因此本文考察了某实际污水处理厂相同进水的A2O工艺、A2O-MBR工艺所产生的剩余污泥, 在微波组合预处理-厌氧消化过程中污泥性质变化与厌氧消化效果, 并对处理过程中古菌群落结构演替进行对比分析, 以期为进一步了解微波预处理强化厌氧消化工艺提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 污泥来源北京某大型城市污水处理厂一期、二期均采用A2O处理工艺, 总处理水量为40万m3·d-1.三期A2O-MBR工艺, 处理水量为15万m3·d-1.一期、二期剩余污泥统一做离心机械脱水, 三期剩余污泥单独做离心机械脱水处理.本研究于2017年7~8月间取该污水厂的一、二期A2O工艺(SRT=20d)脱水污泥, 以及三期的A2O-MBR(SRT=30 d)工艺脱水污泥放置于4℃冷藏库保存备用.采用某污水处理厂卵形消化池出泥(TS=39.2g·L-1, VS/TS=43.5%)做为本研究厌氧消化接种泥.
1.2 实验装置预处理采用JWFY-1T微波反应器(巨龙微波能设备有限公司, 保定), 磁控管Pmax=1 kW, 频率f=2 450 MHz.微波反应器腔体最大容积25 L, 反应器具有可升降搅拌装置和热电偶温度传感器, 可实时监测温度.厌氧消化采用生化产甲烷潜势(biochemical methane potential, BMP)测试系统(AMPTS Ⅱ, bioprocess control, 瑞典)进行厌氧消化.采用650 mL的血清瓶, 有效体积为400 mL, 将接种污泥和预处理污泥以VS比为1: 3的比例进行混合后加入到血清瓶中作为实验组, 同时以接种污泥加入未经预处理的原泥作为对照组, 每组实验分别设置3个平行.
1.3 实验方法将所取的两种脱水污泥用去离子水稀释到TS为8%~10%, 通过孔径1 mm筛网筛除大颗粒物等杂质后作为原泥, 分别记为A2O原泥(一、二期), MBR原泥(三期).采用课题组前期优化的微波组合工艺(MW-H2O2-OH)作为预处理工艺[8], 即在原泥中加入5 mol·L-1的NaOH溶液调节pH至10, 采用600 W的微波功率辐射污泥样品升温至80℃, 按m(H2O2)/m(TS)=0.2的质量比加入30%的过氧化氢, 升温至100℃立即结束, 累积加热持续时间为5 min, 待污泥温度降至室温, 用5 mol·L-1的HCl将预处理后污泥pH调至7~7.5之间备用, 预处理后污泥样品分别标记为A2O微波泥和MBR微波泥.将厌氧消化接种泥与有/无预处理污泥(即原泥/微波泥)以VS比为1: 3的比例混合后, 采用与接种污泥来源的卵形消化池相同温度进行厌氧消化, 即在38℃±1℃进行25 d厌氧消化, 取第25 d厌氧消化污泥为厌氧出泥用于各项指标检测.
1.4 理化指标分析方法TS、VS按标准方法[12]测定.碱度采用酸碱滴定法, 结果以CaCO3计.污泥经8 000 r·min-1离心30 min后吸取上清液过0.45 μm醋酸纤维膜, 滤液采用DR2800HACH分光光度计(HACH, US)测定溶解性COD(SCOD), 溶解性多糖和蛋白质; 溶解性多糖、蛋白质分别采用Dubois法和Lowry法测定; VFA由Agilent 6890N气相色谱(Agilent, US)检测, 检测器为火焰离子化检测器FID, 色谱柱为HP-FFAP毛细管柱(0.25 mm×25 m).
1.5 DNA提取采用FastDNA Spin Kit for Soil (MP Biomedicals, US)试剂盒, 对A2O及A2O-MBR实验组的原泥、微波泥、厌氧后泥每个取样点的3个平行样品分别提取DNA, 每个取样点的3个平行样品DNA混合后作为该样品的总DNA, 用于后续的PCR扩增.提取的DNA在1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 并采用Nanodrop分光光度计(Nanodrop, US)确定核酸浓度和质量.
1.6 古菌群落结构采用巢式PCR对污泥样品古菌16S rRNA的V3-V4区进行扩增, 第一轮使用340F(CCCTAY GGGGYGCASCAG), 1000R(GGCCATGCACYWCY TCTC)引物, 采用2×Taq master Mix×15 μL扩增体系, 上下游引物各1 μL (10 μmol·L-1), 10~20 ng的DNA模板, 加灭菌dd H2O至30 μL.第一轮反应条件为：94℃ 3 min; 5个循环：94℃ 30 s, 45℃ 20 s, 65℃ 30 s; 20个循环：94℃ 20 s, 55℃ 20 s, 72℃ 30 s; 72℃延伸5 min.第二轮采用引物349F(GYGCASCAGKCGMGAAW), 806R(GGACTACVSG GGTATCTAAT), 用第一轮的扩增产物适当稀释后作为第二轮的模板.扩增体系和反应条件同第一轮.第三轮引入Illumina桥式PCR兼容引物, 扩增体系同前两轮, 反应条件为94℃ 3 min; 5个循环：94℃ 20 s, 55℃ 20 s, 72℃ 30 s; 72℃延伸5 min.由上海生工公司(Sangon, China)通过Illumina MiSeq进行高通量测序, 经过质控后每个样品得到82 006~98 217条序列.所得到的高质量序列以97%的序列相似性阈值处理生成OTUs(操作分类单元), 并利用RDP(核糖体数据库项目)分类器进行分类分析样品中群落结构.
1.7 数据处理与分析采用Canoco 5.0 (Microcomputer Power, US)进行冗余分析(RDA), 考察古菌群落结构演替及其与污泥性质的相关关系. Coverage指数、Chao1指数、Pielou指数、Shannon指数采用Mothur软件(http://www.mothur.org)进行计算[13].
2 结果与讨论 2.1 预处理过程污泥性质变化原泥及微波组合预处理后的污泥性质如图 1所示.由图 1(a)可知, MBR原泥的VS/TS为50.0%, 低于A2O原泥的66.4%, 这是由于A2O-MBR污水处理工艺的污泥龄为30 d, 大于A2O工艺的污泥龄(20 d), 较长的污泥龄导致污泥矿化, 活性有机部分所占比例降低; 此外, A2O-MBR工艺的高污泥浓度以及相应的低F/M会导致部分微生物长期处于贫营养状态下, 在该阶段微生物的内源呼吸导致易降解的SMP被消耗掉, 难降解的部分会持续累积[14], 导致剩余污泥中的溶解性有机质含量偏低, 可生物降解性差, 这也是相同VS条件下MBR原泥的SCOD低于A2O原泥[图 1(b)]的重要原因.两种污泥的有机组分构成有较大差异：A2O原泥的溶解性蛋白质和多糖分别是MBR原泥的2.02和4.85倍, 但MBR原泥的总VFA高于A2O原泥, 分别为4 945 mg·L-1和3 415 mg·L-1, 其中MBR原泥中丙酸占比最高, 为28.0%, 而A2O原泥中乙酸占比最高, 为31.9%.
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图 1 污泥性质在预处理过程的变化 Fig. 1 Variations in sludge characteristics during pretreatment |
微波辐射过程在常压非密闭状态进行, 水分的挥发导致预处理后TS和VS均略有上升[图 1(a)].在起始VS相似的条件下, 预处理对MBR组原泥的SCOD释放效果更佳, 增长了2.69倍, 高于A2O组的2.26倍, SCOD中的重要组分溶解性蛋白质和多糖, 在MBR组分别增长了7.42倍和18.33倍, 高于A2O组的增长量(分别为3.52倍和2.98倍)[图 1(b)]. Carrère等[11]也发现加热预处理对可生物降解性低的溶解性有机物释放效果更佳.虽然MBR原泥溶解性有机物的释放比例更高, 但由于A2O原泥中具有更高的SCOD, 其预处理后SCOD达到28 650 mg·L-1, 比MBR微波泥(26 150 mg·L-1)高出9.6%, 溶解性蛋白质也比MBR微波泥高出8.3%, 达到9 677.62 mg·L-1.此外, A2O和MBR原泥总VFA(以COD计)经过预处理后仅分别增长了15.6%和3.6% [图 1(c)], 且VFA中各种组分的比例变化也较小：不同原泥的乙酸和丙酸在预处理前后变化在2.9%~5.7%之间, 正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸变化小于2.4%.
预处理过程溶解性有机物的显著增加的原因主要有胞内有机物的释放和胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)的溶解性增加.其中的EPS由腐殖酸, 多糖, 蛋白质, 核酸和其他非确定性组分构成[15].本研究预处理工艺为微波、H2O2和碱共同作用的组合工艺, 微波预处理产生的热效应和非热效应可促使细胞破裂和改变细胞膜的通透性, 导致部分溶解性有机物从细胞中溶出[16], 并促进EPS中有机物得到释放、水解, 进而提高后续污泥厌氧消化性能[17].而H2O2的加入也通过强氧化作用提高了污泥的破解效果[18].此外, 碱性pH条件不但可以提高细胞破壁效果[19], 另一方面还可导致EPS中酸性基团的解离和负电荷EPS之间的排斥, 从而增强了蛋白质和碳水化合物的溶解性[20].污泥加热和氧化过程中还会促使部分不饱和脂类物质氧化产生少量VFA[21], 但由于VFA主要是大分子有机物在酸化阶段生物代谢的重要终端产物[22], 微波过程中的生物代谢作用较弱, 所以预处理后VFA的释放效果没有溶解性蛋白质和多糖的释放效果显著.
2.2 厌氧消化过程污泥性质变化及产甲烷效果厌氧消化过程中污泥性质的变化及产甲烷效果分别如图 2和图 3所示.经过与接种污泥混合后, 4组厌氧消化实验组的进泥VS为38.89~40.54 g·L-1之间, 在厌氧消化过程中, A2O和MBR原泥的VS削减率分别为22.9%, 21.2%; A2O和MBR微波泥厌氧过程的VS削减率分别增长到26.3%, 22.8% [图 2(a)].在厌氧起始VS近似的条件下, A2O和MBR预处理污泥的产甲烷量分别提高了19.9%和12.6% [图 2(b)].虽然厌氧起始VS近似相同, 由于A2O组的生物可降解性高于MBR组污泥, A2O原泥和A2O微波泥的产甲烷量均高于对应的MBR原泥和MBR微波泥, 表明污泥可生物降解性影响产甲烷效果[12, 23].
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图 2 污泥性质在厌氧消化过程的变化 Fig. 2 Variations in sludge characteristics during anaerobic digestion |
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图 3 污泥厌氧消化累积产甲烷量 Fig. 3 Cumulative methane production during anaerobic digestion |
A2O原泥厌氧进泥和A2O微波厌氧进泥的SCOD分别比MBR组高出15.6%和8.3%, SCOD经过乙酸化等系列反应后, 可以提供更多的底物, 从而提高产气效果.另外, 产甲烷菌对底物有很强的特异性, 可利用的底物只有H2、CO2、甲酸、甲醇、甲胺、乙酸等, 乙酸是产甲烷菌利用的重要碳源. A2O原泥和A2O微波泥中含有更多的乙酸也对产甲烷效果起到了一定的促进作用：厌氧进泥中A2O原泥的乙酸浓度(742mg·L-1)和在总VFA的占比(32.8%)高于MBR原泥(分别为522 mg·L-1和16.8%), A2O微波泥的乙酸浓度(959 mg·L-1)和占比(37.6%)也高于MBR微波泥(分别为621 mg·L-1和17.7%)[图 2(c)].虽然各组厌氧进泥的总VFA差别较大, 在2 554~3 509 mg·L-1之间, 但厌氧出泥的总VFA差异较小, 均下降到56~62 mg·L-1之间, 且厌氧出泥的VFA组分中均以乙酸和丙酸为主, 二者之和占总VFA的85.5%~92.6%.此外, 厌氧消化后4组污泥的碱度增加了1.79~2.91倍.碱度的增加与污泥蛋白质的降解有关, 蛋白质代谢产生的碱度是厌氧消化阶段产生碱度的主要来源[24].
2.3 预处理及厌氧消化过程古菌群落结构多样性的变化对污泥样品进行古菌群落结构多样性分析, 结果如表 1所示. Coverage指数是指各样品文库的覆盖率, 其数值越接近于1, 代表本次测序结果越接近样本中微生物的实际情况.本研究中各污泥样品的Coverage指数均为0.987以上, 表明测序结果可良好反映古菌群落结构的实际情况. Chao1指数显示菌群种类的丰富度(Richness)[25], Pielou指数代表菌群结构的均匀度(Evenness)[23], Shannon指数则综合考虑菌群结构的均匀度和丰富度.由表 1可知, 预处理过程对古菌的丰富度和均匀度影响较小, Chao1指数和Pielou指数变化幅度在1.7%~8.6%之间, 但厌氧消化对古菌群落结构的多样性影响较大, 在厌氧消化之后, Chao1指数增长了54.0%~68.8%, Pielou指数降低了16.2%~34.6%.以上结果表明, 除接种污泥中微生物带来的菌群结构影响之外, 厌氧过程有利于多种产甲烷菌的生长, 促使古菌种类总量增加, 但同时也导致适应反应环境条件的产甲烷菌增加, 而其他不适应该环境的古菌丰度降低, 造成古菌菌群的均匀度降低.对比A2O和MBR工艺的原泥、微波泥、有/无预处理的厌氧消化污泥, MBR工艺的污泥具有更高Chao1指数, 除微波泥之外的MBR工艺污泥的Pielou指数也高于A2O工艺污泥, 并同时具有更高的Shannon指数, 说明MBR工艺污泥在古菌群落结构多样性上优于A2O工艺.
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表 1 古菌多样性分析 Table 1 Archaeal community diversity analysis |
2.4 污泥预处理及厌氧消化过程古菌群落结构的变化
在菌目级别上[图 4(a)], 所有污泥样品中的古菌均以Methanomicrobiales(甲烷微菌目)、Methanosarcinales(甲烷八叠球菌目)、Methanomassiliicoccales(第七产甲烷古菌目)和Methanobacteriales(甲烷杆菌目)为主, 这4种古菌的总丰度在所有样品中的范围为98.59%~99.96%.从原泥的古菌分布来看, A2O原泥以第七产甲烷古菌目为优势菌, 丰度为52.80%, 而MBR原泥则以甲烷八叠球菌目和甲烷微菌目为优势菌, 丰度分别为35.55%和33.35%.自从2012年人们首次从人类粪便中分离出甲基型和氢型混合营养型的第七产甲烷古菌, 在厌氧反应器也发现了高度富集的第七产甲烷古菌[26, 27].微波预处理及厌氧消化过程对污泥中产甲烷古菌的分布具有较大影响. A2O与MBR原泥经过微波预处理后, 甲烷微菌目和甲烷杆菌目的丰度增加3.71%~22.19%, 第七产甲烷古菌目的丰度却分别下降了33.53%和11.78%.第七产甲烷古菌生长温度为37℃, 而甲烷微菌目和甲烷杆菌目的生长温度范围较广, 分别为0~60℃和15~97℃[27].微波预处理过程污泥温度加热到100℃, 不利于生长温度范围相对较低的第七产甲烷古菌目生长, 是导致其丰度在预处理后显著下降的重要原因.在厌氧消化后, 无论有无预处理的污泥中, 甲烷杆菌目丰度均呈下降趋势(降低7.37%~13.44%), 甲烷微菌目丰度则显著增加并成为优势古菌, 其在消化污泥中的丰度高达54.72%~63.36%.甲烷微菌目是消化污泥中常见的优势菌, Lee等[28]也发现污泥厌氧消化后的产甲烷菌以甲烷微菌目为优势菌.
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图 4 污泥处理过程中古菌丰度变化 Fig. 4 Variations in abundance of archaea during sludge treatment |
在菌属级别上[图 4(b)], MBR原泥中的乙酸型产甲烷菌Methanothrix(甲烷丝菌属)和Methanosarcina (甲烷八叠球菌属)丰度均高于A2O原泥, 前者丰度分别为8.17%和25.23%, 后者丰度分别为4.49%和5.50%. Jang等[29]认为厌氧消化过程中氢型产甲烷菌与乙酸型产甲烷菌比生长速率不同, HRT相对较短的工艺更有利于氢型产甲烷菌富集, HRT相对长的工艺更有利于乙酸型产甲烷菌的生长.由此, MBR工艺污泥龄较长可能是导致MBR原泥中乙酸型产甲烷菌Methanothrix和Methanosarcina丰度相对较高的原因.在预处理后, A2O和MBR组污泥所有古菌中, Methanosphaerula丰度增长幅度最大, 从原泥的7.09%和13.05%增长到23.29%和29.13%, 但在厌氧消化后却降低到0.09%~8.05%. Zhao等[30]在处理脱落酸废水的UASB反应器中发现了丰度较高的Methanosphaerula, 认为是残余的脱落酸和有机溶剂影响了产甲烷菌菌群结构.以上研究结果显示Methanosphaerula对热辐射和碱性条件等恶劣条件耐受性较好, 但在良好厌氧环境中, 其对底物的竞争性能力可能弱于其他产甲烷菌, 从而丰度降低.此外, 氢型产甲烷菌Methanospirillum(甲烷螺菌属)和Methanoculleus(甲烷囊菌属)丰度在预处理后降低了0.34%~4.86%, 但在厌氧消化后达到为12.3%~40.87%, 成为主要优势产甲烷菌.厌氧消化污泥中优势菌属还有Methanothrix和Methanosarcina, 丰度为5.56%~13.88%, 以及Methanomassiliicoccus(第七产甲烷古菌属), 丰度为9.1%~26.61%.厌氧消化后Methanospirillum和Methanoculleus等显著增加, 而Methanosphaerula以及其他古菌如氨氧化古菌Nitrososphaera等丰度降低, 导致古菌菌群多样性的均匀度下降, 即是造成表 1中Pielou指数在厌氧消化后降低的重要原因.
2.5 污泥处理过程中古菌群落结构演替与污泥性质的关系通过RDA分析考察污泥处理过程中古菌群落结构演替与污泥性质的相关关系, 结果如图 5所示. RDA分析结果对古菌群落结构变化的解释度为98.8%, 轴1的解释度为79.22%, 轴2的解释度为10.49%.原泥、微波泥和厌氧消化污泥分别处于不同象限, 说明预处理及厌氧消化过程古菌群落结构发生较大变化.轴1与总VFA、乙酸、丙酸、SCOD、溶解性蛋白、溶解性多糖具有良好的相关性, 表明古菌菌群结构与污泥有机组分密切相关. Methanoregula、Methanomethylovorans、Methanosphaera与VFA, 以及VFA的主要成分乙酸和丙酸正相关, 而与碱度负相关, 表明这3种产甲烷菌受总VFA、乙酸及丙酸的有机酸类物质的影响较大. Methanobrevibacter、Methanobacterium、Methanos-phaera、Nitrososphaera则与溶解性蛋白质、SCOD正相关; Methanocella则与溶解性多糖正相关; 而Methanospirillum和Methanoculleus受碱度的影响较大.以上结果表明, 污泥有机组分是古菌群落结构演替的重要影响因素, 不同的有机组分构成可促使污泥的古菌群落结构不同.
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蓝色箭头为物种变量(古菌菌属)：1.Methanospirillum; 2.Methanoculleus; 3.Methanosphaerula; 4.Methanolinea; 5.Methanoregula; 6.Methanofollis; 7.Methanothrix; 8.Methanosarcina; 9.Methanomethylovorans; 10.Methanolobus; 11.Methanobrevibacter; 12.Methanobacterium; 13.Methanosphaera; 14.Methanomassiliicoccus; 15.Methanocella; 16.Nitrososphaera; 17.Unclassified; 红色箭头为环境变量：A.SCOD; B.溶解性蛋白; C.溶解性多糖; D.乙酸; E.丙酸; F.VFA; G.碱度 图 5 古菌群落结构与污泥性质的RDA分析 Fig. 5 RDA of archaeal community and sludge characteristics |
(1) 相同进水、不同处理工艺的实际污水厂产生的剩余污泥性质差别较大：A2O污泥比A2O-MBR污泥有更高的有机质含量(VS/TS值分别为66.4%与50.0%), SCOD、溶解性蛋白质和多糖(分别为后者的1.24、2.02和4.85倍), 以及VFA中乙酸占比(31.9%对比13.9%), 具有更好的生物降解性.
(2) 虽然在微波组合预处理对生物降解性差的A2O-MBR污泥有机物释放效果更佳, 但A2O污泥具有更多的SCOD及可生物降解性, 预处理后产气效果高于A2O-MBR污泥26.1%.
(3) A2O原泥与A2O-MBR原泥中古菌群落结构不同, 后者甲烷丝菌属和甲烷八叠球菌属丰度分别高于前者3.68%和19.73%.预处理过程对古菌群落结构的丰富度和均匀度影响相对较小, 厌氧消化则影响较大：在厌氧消化之后, 古菌的丰富度显著增加, 而均匀度降低.污泥中有机组分不同是引起古菌群落结构差异的重要影响因素.
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