2018, Vol. 39
2. 中国环境科学研究院, 国家环境保护地下水污染模拟与控制重点实验室, 北京 100012;
3. 长安大学环境科学与工程学院, 西安 710054
2. State Environmental Protection Key Laboratory of Simulation and Control of Groundwater Pollution, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China;
3. School of Environmental Science and Engineering, Chang'an University, Xi'an 710054, China
地下水硝酸盐污染已成为近40年来国际上普遍关注的问题[1].包气带作为防控地下水硝酸盐污染的主要屏障[2], 反硝化作用是有效阻控和消散硝酸盐的主要机制, 可使因淋溶而进入地下水的硝酸盐减少, 削减硝酸盐积累对生物的毒害作用[3].
包气带反硝化强度作为防护地下水硝酸盐污染能力的定量表征, 是目前包气带反硝化作用研究的热点和难点[4~6].反硝化作用强度可由反硝化速率或反硝化潜力表征, 区别在于反硝化潜力是指在添加外源硝酸盐条件下, 单位时间内硝酸盐的净减量[7].为探究包气带反硝化作用, 众多学者就反硝化强度的测定与影响因素的识别展开了一系列的研究.目前, 常采用硝酸根消耗量法[8, 9]、乙炔抑制法[10, 11]和15N同位素示踪法[12]测定包气带反硝化强度, 也有学者通过对包气带反硝化强度与环境因素的相关性分析, 发现其主要影响因素包括：有效氮、有机质、Eh、含水率、pH和温度等[13, 14].目前来看, 包气带反硝化强度测定集中在0~0.5 m的土壤表层, 深部包气带(尤其是2 m以下)研究相对匮乏[8, 13, 15], 反硝化强度垂向空间分布研究较少; 包气带反硝化影响因素的研究主要集中在物理化学指标, 对于反硝化微生物的相关研究相对较少.
潮白河冲洪积扇区域是北京市最大的地下水供水水源地[16], 2012年“水源八厂”附近地下水硝酸盐采样超标率为22%[17].目前暂未见到潮白河冲洪积扇区域包气带反硝化作用对地下水硝酸盐污染防护研究的报道.因此, 本文选取北京市潮白河冲洪积扇区域两处典型剖面(S6和S8), 分别采集0~10 m和0~5 m不同深度的包气带样品作为对象, 测试分析其理化参数、环境指标以及反硝化微生物特征, 并通过硝酸根消耗量测定法计算包气带反硝化潜力, 将其作为包气带反硝化强度, 对比分析两个包气带剖面中反硝化强度的异同, 探讨形成机制, 识别反硝化强度在包气带垂向空间的分布规律及影响因素, 以期为硝酸盐在包气带中的迁移转化过程, 及包气带对地下水硝酸盐污染防护能力的研究提供一定的基础支撑和理论依据.
1 材料与方法 1.1 研究区概况及采样点布设潮白河冲洪积扇位于北京市东北部, 涉及密云、怀柔、顺义和通州这4个区县的部分地区.该区是北京市密云、怀柔、顺义等地区主要的供水水源地, 地下水水位埋深由上游至下游由深变浅, 上游密云地区平均埋深为15~30 m, 中下游的怀柔和顺义区为5~15 m[16].研究区地下水主要接受大气降水补给、地表水系及农业灌溉入渗补给、基岩裂隙侧向补给.地下水流向大致由东北流向西南; 研究区浅层地下水的排泄途径主要为人工开采, 其次为自然排泄, 包括潜水蒸发以及地下径流[18].
由于S6和S8剖面具有潮白河冲洪积扇中下部包气带典型结构, 且位于“水源八厂”地下水补给区, 因此本文选取S6和S8作为典型剖面进行研究(图 1).
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图 1 潮白河冲洪积扇包气带采样点分布示意 Fig. 1 Sampling location of vadose zone in Chaobai River alluvial fan |
本次包气带采样工作是在水文地质调查基础上, 于2016年10月27日至2016年11月4日, 在北京市潮白河冲洪积扇区域通过Power Probe钻机(9500-VTR, 美国AMS公司)取样.根据潮白河区域地下水位埋深和现场钻探情况, 采集0~0.2、0.2~0.4、0.4~0.6、0.6~0.8、0.8~1.0、1.0~1.2、2、3、4、5、10 m等各个深度包气带土壤, 共20个样品.将土壤样品装入自封袋, 排空空气, 密封, 标记好采样时间、地点及采样深度, 带回实验室置于4℃环境保存.
参照国家标准测试了各样品的砂粒、粉砂粒和黏粒百分比、pH、含水率、有机质(OM)、氧化还原电位(Eh)、溶解性总固体(TDS)、硝酸盐(NO3-)、亚硝酸盐(NO2-)和铵态氮(NH4+)含量.
宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象, 通过功能基因的筛选和测序分析, 用于分析环境中微生物多样性、功能活性等.本研究通过定量PCR等分子生物学方法测定了包气带反硝化菌亚硝酸盐还原酶基因nirS、nirK和一氧化二氮还原酶基因nosZ的数量, 采用宏基因组学方法测定了微生物α多样性, 并用ACE指数表征群落丰富度, 用Shannon指数表征群落多样性. ACE指数越大, 说明群落丰富度越高; Shannon值越大, 说明群落多样性越高.
1.3 实验原理本实验采用硝酸根消耗量测定法估算S6和S8剖面不同深度反硝化强度.该方法易于操作, 主要根据化学性质相对稳定的硝酸盐的减少进行估算.
将20个待测样品于实验室自然风干(10 d); 按四分法取风干筛选的土样各4 g置于试管中, 每个样品装12份, 并设置两组平行实验; 试管中加入含量约为20 mg·L-1的KNO3(国药, 分析纯)溶液4 mL, 用去离子水加至近满, 之后塞好试管口以保持厌氧条件; 将上述所有样品置于25℃恒温鼓风干燥箱(DHG-9623A, 中国), 在第0、1、2、5、8、11、15、20、25、28、30、33、35 d分别取出3份样品, 于恒温振荡培养箱(BS-1E, 中国)110 r·min-1下振荡30 min, 用离心机(TD 6, 中国)于2800 r·min-1下离心15 min, 取上清液经0.45 μm醋酸纤维滤膜过滤后采用Smart Chem 200(法国Alliance公司)测试硝酸盐浓度.采用零级或一级反应动力学方程[式(1)和式(2)]对反硝化实验数据进行拟合, 获得硝酸盐反硝化过程的零级和一级反应动力学方程[19].
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(1) |
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(2) |
式中, k0和k1分别表示零级和一级反硝化反应强度[mg·(kg·d)-1]; c0和ct分别表示初始时刻和t时刻液相中的硝酸盐浓度(mg·L-1); t表示反应时间(d).
数据分析利用SPSS 24、Origin 8.1和Excel 2010完成, 图片使用ArcGIS 10.2和Origin 8.1制作.其中, 研究包气带反硝化强度过程中的硝酸盐浓度数据采用3次平行样分析结果的平均值.
2 结果与讨论 2.1 包气带土样理化性质和微生物特征测试结果包气带土样11项理化指标及微生物特征统计结果见表 1.
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表 1 S6和S8剖面包气带土样理化性质和微生物特征测试结果 Table 1 Physicochemical properties and microbial characteristics test results of S6 and S8 vadose zones |
根据粒径分析结果, 参照美国农业部土壤保持局(USDA-SCS)制定的土壤分类标准可知, S6剖面0.6 m和S8剖面0.4 m以上土壤介质为粉壤, 粉壤下面主要为砂土. pH在7.51~8.84之间, 包气带土样环境为弱碱性.含水率随深度增加逐渐降低, 埋深2 m以下含水率均小于10%.有机质含量S6在1.06~11.60 g·kg-1之间, S8在1.21~9.80 g·kg-1之间, 平均值均为4.70 g·kg-1, 总体呈现随深度增加而降低的趋势. S6和S8两个剖面的包气带以氧化环境(Eh > 400 mV)为主, 仅S6剖面的0.6~1.0 m处于弱度还原环境(Eh：200~400 mV). S6剖面氨氮含量在1.18~9.65 mg·kg-1之间, 平均值2.92 mg·kg-1, 硝酸盐氮含量在0.38~5.41 mg·kg-1之间, 平均值为2.05 mg·kg-1, 亚硝酸盐氮含量在0.20~1.68 mg·kg-1之间, 平均值为0.83 mg·kg-1. S8剖面氨氮含量在0.94~3.82 mg·kg-1之间, 平均值为2.27 mg·kg-1, 硝酸盐氮含量在0.27~1.82 mg·kg-1之间, 平均值0.92 mg·kg-1, 亚硝酸盐氮含量在0.20~1.23 mg·kg-1之间, 平均值为0.78 mg·kg-1. S6剖面三氮含量总体高于S8剖面.
微生物多样性统计结果显示, S6剖面0.4 m、1.2 m和S8剖面0.6 m、3 m处的ACE、Shannon值最大, 表明该深度处的微生物多样性最高.从3种反硝化基因数量随包气带采样深度变化(图 2)可知, nirK、nirS和nosZ在包气带0.8 m以上数量最多, 表明反硝化作用主要发生在土壤上层, 其中S6剖面0.4 m处3种反硝化基因数量最多, nirK、nirS和nosZ分别达到5.0×106、2.0×107和2.2×107 copies·g-1, S8剖面0.2 m处反硝化基因数量最多, nirK、nirS和nosZ分别达到1.9×106、4.0×106和2.3×107 copies·g-1, 表明包气带反硝化功能基因数在垂向深度分布上存在差异.通过微生物群落结构分析发现, nirS、nirK和nosZ这3种反硝化功能基因主要来源于变形菌门和放线菌门中参与氮循环的属, 如固氮菌属和根瘤菌属.
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图 2 3种反硝化功能基因数量随采样深度变化柱状图 Fig. 2 Histogram of the number of three denitrifying functional genes varying with sampling depth |
本研究采用NO3--N浓度变化表示包气带土样的反硝化过程, 图 3显示了S6和S8剖面反硝化过程中NO3--N浓度随时间的变化情况.结果表明, S6和S8剖面不同深度包气带介质的反硝化过程均存在NO3--N浓度下降(1~28 d)、上升(28~30 d)和下降(30~35 d)这3个主要阶段. S6与S8剖面反硝化变化趋势大体相似, 并依据NO3--N最终浓度减少率[最终浓度减少率=(最初浓度-最终浓度)/最初浓度×100%]统计了不同阶段不同深度的反硝化程度.
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图 3 典型剖面不同深度包气带土样的反硝化过程曲线 Fig. 3 Denitrification process curves of soil samples with different depths in a typical section |
结合本实验过程与统计结果, S6和S8剖面表层样品(0~0.2 m)NO3--N浓度均从实验第1 d开始保持下降趋势, 一直降低至低于检出限(0.01 mg·L-1).实验过程中硝化与反硝化相互作用, 交替占据主导地位, 导致某些样品存在多个NO3--N浓度波峰(谷).随实验进行, 氧气被逐渐消耗完, 变为缺氧环境条件, 不适合硝化细菌进行硝化作用, 反硝化作用开始占据生化反应过程的主导地位, 消耗了样品中的硝酸盐.实验28 d以后S6和S8剖面各深度样品的NO3--N浓度再次上升, 推测是因为在长时间缺氧、低碳源条件下, 大部分微生物都已死亡, 反硝化微生物也已经达到衰亡期, 从而导致反硝化作用减弱甚至停止.而此时土壤样品在实验过程中吸附的硝酸盐获得释放而导致NO3--N浓度上升, 之后, 硝酸盐重新达到吸附-解吸平衡, NO3--N浓度缓慢降低直至稳定. S6剖面反硝化程度依次为93.03%(0~0.2 m)、82.37%(0.2~0.6 m)、87.38%(0.6~2 m)、83.94%(2~10 m); S8剖面反硝化程度依次为92.28%(0~0.2 m)、93.16%(0.2~0.6 m)、84.44%(0.6~1 m)、88.79%(1~5 m).通过硝酸盐最终浓度减少率统计结果发现, 包气带反硝化作用对消除硝酸盐起到了一定的作用, 但因包气带介质、环境条件以及微生物多样性差异导致部分硝酸盐仍可以通过包气带进入地下水, 从而造成污染.
2.3 包气带反硝化强度垂向空间的分布规律为计算反硝化强度, 采用零级动力学方程与一级动力学方程对所得不同深度包气带反硝化强度数据进行拟合(表 2).由于研究区内包气带介质中总有机碳含量较低(0.703~6.71 g·kg-1), 且实验过程中并未添加碳源, 故采用一级动力学拟合结果[20].
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表 2 S6和S8剖面反硝化动力学方程拟合结果 Table 2 S6 and S8 kinetics of denitrification fitting results |
从表 2可知, S6剖面反硝化强度一级动力学拟合范围为0.002 6~0.018 5 mg·(kg·d)-1, S8剖面反硝化强度范围为0.001 7~0.023 3 mg·(kg·d)-1.本次实验采集地的土地利用类型为农田, 农田包气带介质主要处于氧化性环境(Eh > 400 mV), 不利于反硝化过程的进行[21], 氧化环境也会影响反硝化菌的分离富集程度等微生物条件[22], 故本次实验所得反硝化强度总体较低.
图 4显示了S6和S8剖面上包气带反硝化强度垂向空间的分布特征, S6和S8剖面包气带反硝化强度在10 m内垂向空间均有“S”型分布趋势. S6剖面反硝化强度在地表附近(0~0.2 m)较高, 由地表到地下0.6 m逐渐降低至最小, 在0.6~2 m范围内逐渐升高, 并达到峰值, 在3~4 m呈上升趋势, 并在地下4 m左右达到另外一个峰值, 之后随深度继续加深(4~10 m)反硝化强度逐渐减小并最终保持较低水平. S8剖面反硝化强度在地表至地下2 m深度范围内呈“S”型变化趋势, 2 m以下到剖面底部(5 m)反硝化强度水平较低且变化程度很小[0.009~0.009 9 mg·(kg·d)-1].
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图 4 典型剖面反硝化强度垂向空间分布图 Fig. 4 Vertical spatial distribution of denitrification strength in typical sections |
S6和S8剖面反硝化强度在地表附近(0~0.2 m)较高, 可能与剖面的土地利用类型为农田有关.农业生产过程中会大量施用有机肥, 从而增加好氧微生物的呼吸作用, 进而消耗了土壤中的氧, 造成土壤局部或暂时的缺氧环境, 在缺氧环境下聚集了大量的反硝化微生物[23].也有研究发现表层土壤根系密度和碳氮含量最高[24], 为反硝化提供了充足的能量以及适宜的环境, 导致地表附近反硝化强度较高.由于包气带表层环境条件复杂、微生物群落丰富多样且微生物作用的各异性[25], 本次研究未能查明0.4~0.6 m处反硝化强度最低的原因.
S6剖面反硝化强度在2 m和4 m左右出现两个峰值, S8剖面反硝化强度在地下1 m左右出现峰值, 推测研究区内地下1~4 m深度范围可能存在活跃的自养反硝化微生物活动.如：脱氮硫杆菌活跃在不同深度范围, 通过氧化硫或硝酸盐获得能量[26], 抬升了反硝化强度水平, 达到反硝化强度峰值.这与Legout等[27]通过室内模拟发现的微生物活性随包气带深度一起下降, 而在有机土壤层1~3.5 m处再度活跃的结论一致.
S6剖面5~10 m以及S8剖面2~5 m深度范围内反硝化强度均较小且变化很小.推测是因为上述两个深度范围的有机质和硝酸盐含量远小于上部(0~1 m)区域.有机质作为反硝化作用的能源, 硝酸盐作为反硝化作用的反应底物, 二者的含量在很大程度上限制了反硝化的发生.由于深层土壤中可供利用的有效碳氮基质含量很低, 促使该深度反硝化酶活性降低, 不利于反硝化的发生[28], 故S6(5~10 m)和S8(2~5 m)剖面深层反硝化强度水平较低.
2.4 包气带反硝化强度垂向空间分布规律的影响因素为探究包气带反硝化强度与环境因素的相关性, 揭示包气带反硝化强度的垂向空间分布规律, 对S6和S8剖面反硝化强度与环境因素进行Spearman非参数相关性分析(表 3).结果表明, S6和S8剖面包气带反硝化强度在显著P < 0.05条件下与黏粒、硝酸盐、亚硝酸盐显著正相关, 与其它环境因素无显著相关性.本研究采用室内模拟实验, 人为添加外源硝酸盐进行反硝化强度测定, 其测定过程中始终保持饱水状态, 故不考虑含水率对本次反硝化强度测定的影响.
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表 3 S6和S8剖面反硝化强度与环境因素的相关性分析1) Table 3 Correlation analysis of denitrification intensity and environmental factors in S6 and S8 |
微生物反硝化作用作为包气带去除硝酸盐的主要机制, 探究反硝化微生物与包气带反硝化强度之间的相关性, 可以加深对包气带反硝化强度的空间分布规律的理解.因此, 对S6和S8剖面反硝化强度与微生物多样性及反硝化功能基因数量的测试结果进行Spearman非参数相关性分析(表 4).
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表 4 硝化强度与微生物多样性、数量之间相关性1) Table 4 Correlation between denitrification intensity and microbial diversity and quantity |
由表 4可知, S6和S8剖面整体深度范围的反硝化强度与微生物多样性及数量之间的相关性不高, 可能是因为微生物聚集在某深度范围, 而非规律性分布[29]. S6剖面反硝化强度在部分深度与微生物多样性相关性显著, 如以ACE和Shannon指数代表的微生物多样性与反硝化强度分别在1~3 m和0.4~2 m显著正相关. S8剖面反硝化强度与nirK反硝化功能基因数量在0.2~0.6 m显著正相关.
3 结论(1) S6和S8剖面除表层(0~0.2 m)深度样品外, 不同深度和介质的包气带土样发生的反硝化过程经历了NO3--N浓度上升、下降、上升这3个主要阶段, 实验末期因反硝化微生物的衰亡以及样品中吸附硝酸盐的解吸释放造成NO3--N浓度上升, 并随硝酸盐重新达到吸附-解吸平衡而平缓下降, 最终趋于稳定.
(2) S6和S8剖面垂向空间的反硝化强度整体水平较低, 一级动力学拟合结果分别为0.002 6~0.018 5 mg·(kg·d)-1和0.001 7~0.023 3 mg·(kg·d)-1.反硝化强度在垂向空间上均有“S”型分布趋势, 包气带1~4 m深度范围可能存在活跃的自养反硝化微生物活动, 使反硝化强度在该深度出现峰值; 深部区域有机质和硝态氮含量较低, 限制了反硝化的发生, 导致S6剖面5~10 m和S8剖面2~5 m反硝化强度水平较低.
(3) 两个剖面包气带反硝化强度的垂向空间分布主要影响因素存在异同.相同的是S6和S8剖面反硝化强度的主控影响因素均包括黏粒、硝酸盐、亚硝酸盐, 且与之成正比.不同的是S6剖面反硝化强度在0~0.6 m与ACE和Shannon指数法代表的微生物多样性显著正相关; S8剖面反硝化强度与nirK反硝化功能基因数量在0.2~0.6 m显著正相关.
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