蓝藻水华暴发, 即水体中营养盐过剩导致的蓝藻过度繁殖和聚集, 引发了一系列的环境问题.尽管近年来对蓝藻水华的研究很多, 但仍然很难对蓝藻水华的发生、持续时间和强度进行有效的预测, 原因之一是对蓝藻成为优势种的过程认识仍然不充分.细菌与蓝藻水华的相互作用在水华暴发和衰亡过程中的重要性已经引起了许多关注.蓝藻与细菌之间的直接相互作用也对蓝藻的生长具有积极或消极的影响[1, 2].蓝藻暴发引起湖泊内细菌群落异质性丧失[3], 微囊藻水华导致了细菌群落多样性的降低[4].随着蓝藻水华的积累, 藻华颗粒周围微环境中的溶解氧(DO)、氧化还原电位(Eh)和有机质浓度剧烈变化, 导致水华暴发的不同时期的相关优势细菌类群的差异[5].细菌与蓝藻之间代谢产物(如碳、氮、氧)的交换[6, 7]对藻类水华的发生和持续有重要影响[8, 9].细菌群落的变化影响营养盐的循环过程, 对蓝藻水华动态变化过程具有反馈效应.例如, 有研究发现高密度蓝藻水华和高营养水平可以加速湖泊中氮的去除过程[10, 11]; 氨氮(NH4+-N)在蓝藻水华期间被硝化细菌转化为亚硝态氮(NO2--N)和硝态氮(NO3--N), 细菌的增殖和氨氮耗尽加速了蓝藻水华的衰亡过程[12].
本研究使用高通量测序和qPCR分析了蓝藻水华形成过程中细菌群落结构和功能类群以及与氮转化有关的功能基因的变化过程, 其结果有助于拓展对蓝藻水华的快速增殖与细菌群落之间相互作用的认识, 以深入了解和控制蓝藻的形成.
1 材料与方法 1.1 样品采集分别于2016年的4月8日、5月6日、6月6日、6月26日在太湖竺山湾(31°27'9.23″N, 120°0'35.22″E)从水面以下0.5m采集水样, 储存在无菌瓶中, 立即送至实验室分析处理. 4次采样分别按月份标记为April、May、June-6、June-26.
1.2 藻类计数和水体理化指标分析于1 L水样加入15 mL鲁戈氏碘液进行固定, 用于藻类的鉴定和计数.使用显微镜对藻类形态进行观察、鉴定藻类种属[13], 并用血球计数板进行计数.
水体中总氮(TN)、NO3--N、NO2--N、NH4+-N、总磷(TP)、正磷酸盐(PO43--P)以及高锰酸盐指数(COD)的测定方法参照国家标准方法[14].
1.3 样品总DNA提取4月、5月样品DNA提取方法:将200 mL充分混匀的水样用0.22 μm孔径的聚碳酸酯膜过滤, 并将滤膜保存在-80℃直至提取DNA.使用E.Z.N.A.® Water DNA Kit(OMEGA, 美国)提取滤膜上的总DNA, 具体步骤参照E.Z.N.A.® Water DNA Kit说明书, 用NanoDrop ND 2000(NanoDrop Technologies, 美国)测定DNA的浓度, 将提取的DNA样品置于-80℃保存. 6月的样品含有大量蓝藻水华颗粒, 故先对水样进行分级过滤处理.具体方法如下:取500 mL水样用150 μm孔径的滤网预先除去较大的浮游生物后, 用3 μm聚碳酸酯滤膜进行过滤, 滤膜上即为水体中蓝藻及其附着细菌部分, 标记为A(attached), 即June-6A和June-26A.将滤液再用0.22 μm聚碳酸酯滤膜进行过滤, 此滤膜上即为水中浮游细菌部分, 标记为F(free-living), 即June-6F和June-26F.后续DNA的提取步骤与4月、5月样品相同.
1.4 qPCR使用SYBR Green染料法qPCR技术在Bio-Rad CFX平台对硝化和反硝化过程中的相关功能基因丰度进行检测, 包括细菌氨单加氧酶(amoA)和亚硝酸盐氧化还原酶(nxrA)、亚硝酸盐还原酶(nirS、nirK)、硝酸盐还原酶(narG、napA)、一氧化氮还原酶(norB)和一氧化二氮还原酶(nosZ).总细菌数以16S rRNA丰度表示. qPCR反应所用引物、反应条件和标准质粒的构建参考Wang等的方法[15].每个样品重复测定3次.
1.5 16S rRNA基因高通量测序及数据分析对16S rRNA基因的V3-V4区进行测序, 所用引物为16S rRNA基因的通用引物338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'). PCR扩增产物用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axgen, 美国)进行纯化后委托上海凌恩生物科技有限公司完成测序.
测序完成后, 对得到的原始数据(raw data)进行拼接、过滤, 得到可供后续分析的有效序列(clean data).然后对序列进行OTUs(operational taxonomic units)的划分及物种分类(RDP classifier).通过MOTHUR程序计算各样品细菌群落的α多样性指数, 包括Chao-1、ACE、Shannon多样性指数.在门、纲、属的系统分类水平上确定各序列的所属类别, 并统计各个类别的序列数量和相对丰度.
1.6 数据统计与分析统计分析使用IBM SPSS 22.0(SPSS Inc., 美国)进行.应用方差分析评估结果的显著性, P < 0.05为显著性差异. Spearman相关性分析用来检验细菌群落的α多样性指数、水体化学参数和蓝藻密度之间的相关性, P < 0.05被认为具有显著相关性.
2 结果与讨论随着蓝藻密度的增加, TP和COD呈上升趋势, 而NO3--N和NH4+-N的质量浓度则呈下降趋势(表 1). PO43--P、TN和NO2--N的质量浓度从非水华时期(4月和5月)到中度水华时期(微囊藻占绝对优势), 分别由0.11、3.19和0.18 mg ·L-1下降至0.03、2.76和0.05 mg ·L-1(6月6日), 到重度水华时期(6月26日)分别增加到0.05、4.01和0.11 mg ·L-1.结果表明, 蓝藻生物量的积累显著影响了水体的化学组成, 这在以往的研究中也有报道[16, 17].蓝藻生物量大量积累导致水体中TOC质量浓度显著高于非水华水体(P < 0.01), 而无机氮、磷的质量浓度显著较低(P < 0.05).尽管水华样品和非水华样品的TN和TP之间没有显著差异, 但TN和TP的质量浓度在具有大量蓝藻生物量的重度水华样品中最高.
2.1 水华形成过程中细菌群落多样性变化
16S rRNA基因高通量测序结果显示, 浮游细菌和附着细菌的OTUs数量、ACE和香农指数(表 2)与蓝藻密度均呈负相关关系(P < 0.05), 表明蓝藻水华的发生会导致细菌群落α-多样性的降低, 这与以往大量的研究结果是一致的.水华造成淡水湖泊中植物和动物的生物多样性降低及食物网状结构的简化[18], 较高密度蓝藻导致细菌多样性的降低[19].蓝藻释放的有机质具有较高的C/N比和C/P比(例如多糖)[20], 因此, 细菌在水华暴发时可能处于氮磷限制状态.此外, 碳源丰富的环境能够促进微生物的呼吸作用, 消耗大量的溶解氧, 从而抑制好氧细菌的生长和存活, 进而造成细菌多样性的降低.因此, 蓝藻水华造成的C、N、P化学计量关系的不平衡[21]以及微环境的变化对细菌可能具有“过滤”作用并导致细菌群落多样性的减少.
2.2 细菌群落结构的动态变化
除蓝细菌外, 在门水平上, 所有样品中Proteobacteria的丰度均为最高.其次, 附着细菌中Firmicutes, 浮游细菌中Actinobacteria和Bacteriodetes占优势(图 1).在Proteobacteria门中, 浮游细菌群落中β-Proteobacteria占主要优势, 其次是α-Proteobacteria, 而在附着细菌中α-Proteobacteria占主要优势, 其次是γ-Proteobacteria.
为分析优势细菌类群对细菌群落的影响, 从每个样本中选取了除蓝细菌外相对丰度最高的10个OTU进行研究.这些OTUs在各个样品中占总有效序列的比例为56.74%~79.60%(图 2), 其中, 附着细菌部分丰度为前10的OTUs占总丰度的70%以上.
已有研究表明, Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides(CFB)、β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria在附着于蓝藻的细菌组成中占据优势[5], 在水华暴发期β-Proteobacteria总是占主导地位[22].在本研究中, 在水华样品中发现了大量的α-Proteobacteria(Porphyrobacter、Rhodobacter), Firmicutes(Bacillus、Lactococcus)和γ-Proteobacteria(Halomonas), 而在非水华样品中这些细菌的丰度则相对较低, 表明这些细菌适应水华暴发的环境条件并可能在水华形成过程中发挥作用.如Firmicutes门的细菌对有机物具有很强的降解能力, 这使得它们在水华造成的高有机质条件下快速增殖. Porphyrobacter具有较强的胞外多糖(EPS)产生能力和表面定殖能力[23].因此, Porphyrobacter可能通过与蓝藻间的相互作用促进藻华颗粒的形成[19]. Rhodobacter是一种革兰氏阴性紫色非硫细菌, 具有多种代谢途径以适应不同的生长条件, 既能在有光照条件下通过光合色素利用有机质进行光能异养, 又能在黑暗的好氧条件下利用无机物进行化能自养[24].在水华样品中, 特别是附着部分富集了大量的Rhodobacter, 可能是由于其在水华造成的高有机质浓度和富营养环境条件下具有较强的生存能力[25~27].
2.3 蓝藻水华促进PAOs的增殖在本研究中共检测到7种潜在的PAOs(图 3), 其中附着细菌中PAOs的相对丰度约为浮游细菌中10倍. PAOs在藻华颗粒上的富集可能是由于水华造成的DO和Eh的剧烈变化适宜PAOs的增殖[28].同时在藻华颗粒上大量的Lacotococcus等发酵细菌为PAOs的生长提供小分子有机酸, 促进了PAOs的增殖[29].附着细菌常作为微囊藻生长过程中的磷库[2, 30], PAOs和微囊藻之间的磷代谢内循环可以促进微囊藻的生长, 并改善由于磷的缺乏对微囊藻细胞造成的损伤[31].这也是关于PAOs在微囊藻水华发生过程中出现富集现象的首次报道.
本研究分别检测到4种潜在的硝化细菌和17种反硝化细菌(图 3).与PAOs的分布有所不同, 重度水华样品中硝化细菌所占的百分比(June-26F为0.06%, June-26A为0.02%)低于中度水华样品(June-6F为0.31%, June-6A为0.28%)和非水华样品(April为0.24%, May为0.35%), 表明水华抑制了硝化细菌的生长.对于反硝化细菌来说, 中度水华样品中反硝化细菌的相对丰度(June-6F为9.42%, June-6A为23.25%)显著高于非水华样品(5.60%和3.97%), 而重度水华样品(June-26F为5.75%, June-26A为12.03%)中反硝化细菌的相对丰度也高于非水华样品, 但与中度水华样品相比有所降低, 同时潜在反硝化细菌丰度(OTU的数量)在中度水华样品中也减少了.
功能基因的qPCR结果显示, 附着细菌部分未检测到细菌amoA基因, 而nxrA基因在所有水华样品中均未检测到[图 4(a)].综合高通量测序和qPCR结果, 推测微囊藻水华对硝化细菌具有抑制作用.作为自养微生物, 硝化细菌丰度的下降可能是由于藻华所引起的高浓度DOM造成的[32].
April、May和June-6F的浮游细菌中, napA和narG的丰度没有显著性差异[图 4(b)], 其他样品中narG的丰度为napA的10倍以上.水华样品中narG的丰度显著高于非水华样品, 特别是在中度水华样品附着部分(June-6A)细菌中最高, 这个结果与高通量测序的结果也是一致的(图 3).
nirK和nirS基因的拷贝数分别为2.79×103~9.27×104 copies ·ng-1和1.35×102~1.28×104 copies ·ng-1[图 4(b)].非水华样品和浮游细菌中nirK和nirS基因的丰度比附着细菌中更高.在水华附着细菌中, norB和nosZ基因的拷贝数低于浮游部分和非水华样品中的拷贝数, 并且在June-26A中, 高密度水华的附着部分中的拷贝数最低.此外, norB和nosZ基因的丰度也显著低于narG/napA和nirK/nirS基因.
反硝化过程是水生态系统中氮脱除的重要途径.有研究表明高密度水华可以提高脱氮效率[10, 11, 33], 但所采用的是水华暴发后处于衰亡期的藻华样品.本研究中采集的水华样品处于暴发增殖阶段, 光合作用活性和氮摄入能力较强, 产生的高浓度DO抑制了以硝酸盐/亚硝酸盐作为电子受体进行能量代谢的反硝化细菌的生长[34]、环境条件如DO浓度[34], 有机碳源和硝酸盐浓度[35]都能影响反硝化细菌的生长.虽然水华的发生为微生物提供了足够的碳源, 但硝化作用被高浓度DOM所抑制, 导致硝酸盐的缺乏, 反硝化作用受到抑制.微囊藻作为非固氮蓝藻, 其生长主要依靠外源性氮, 湖泊中的微囊藻在生长过程中常常会遇到氮限制的问题[36, 37], 随着水华程度的加剧, 反硝化细菌多样性和反硝化酶基因丰度下降, 最终可能导致水华状态下水体的反硝化途径发生改变, 减少水体中氮的脱除.因此, 在蓝藻水华形成过程中, 来源于微囊藻的大量有机碳源和氧气能选择性地刺激水体中异养细菌的生长, 作为反馈, 在微囊藻周围PAOs得以富集, 硝化、反硝化作用受到抑制, 使得微囊藻周围的氮、磷营养盐相对富集(图 5), 缓解其生长过程中出现的氮、磷不足问题, 这对于微囊藻优势地位的形成至关重要[38].
本文对太湖微囊藻水华形成过程中细菌群落组成及氮循环相关功能基因进行了研究.结果表明, 水华形成过程中细菌群落多样性降低, 群落组成发生改变.随着蓝藻水华密度的增加, Actinobacteria和Bacteroidetes减少, 而Firmicutes有所增加.随着水华密度的增加, 藻华颗粒上PAOs得以富集, 作为磷库支持微囊藻的生长.硝化和反硝化作用被抑制, 减少了水体中氮的去除, 保证了水华蓝藻快速增殖过程中对氮的需求, 以上氮磷营养盐的循环途径对水华的生长具有正反馈作用.然而, 这种情况在水华的衰亡阶段可能会发生变化, 尚需进一步研究.
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