2018, Vol. 39
2. 河南省新乡华星制药厂, 新乡 453731
, GUO Xia-li1 , LU A-qian1 , ZHANG Qian-qian1 , GUO Xiao-ying1 , WANG Yan1
, WANG Lian-zhong2 , ZHANG Bao-bao2
2. Henan Xinxiang Huaxing Pharmaceutical Factory, Xinxiang 453731, China
我国是世界上最大的抗生素生产大国.据统计2013年我国抗生素产量高达24.8万t[1], 按照生产1t抗生素产生8~10t湿菌渣估算, 2013年我国抗生素菌渣产量高达200万t以上[2].依据2008年修改后的《国家危险废物名录》, 抗生素菌渣因有抗生素残留, 属于化学危险废物.因此, 如若处理不当, 不仅会造成极大的环境污染而且有可能诱导产生超级耐药菌等, 最终威胁人类健康[3~6].同时, 抗生素菌渣营养丰富, 有机质极高, 资源化再利用价值也极大[7], 而传统的焚烧和填埋方式既污染环境又不能实现其资源化利用[8, 9].因此, 针对这些具有极大资源化利用价值的抗生素菌渣, 开发出新的利用方式, 使其既能有效地去除抗生素残留、消除其对环境与生态的污染和破坏风险, 又能实现其资源化利用已成为了当前研究的热点.
好氧堆肥是在通气好的条件下, 利用数量庞大、种类繁多的好氧微生物对有机固体废弃物中可降解有机物包括有毒有害有机物进行吸收、转化和分解的过程[10, 11].由于堆肥处理无害化程度高, 运行成本低、速度快, 长久以来被国内外广泛应用于固体废弃物的无害化处理.大量研究表明, 好氧堆肥对于大部分抗生素菌渣或其他固体废弃物中的抗生素残留均具有很好的降解效果[12~14].
本文利用好氧堆肥工艺对林可霉素菌渣进行无害化处理、去除残留抗生素的同时, 研究好氧堆肥过程中微生物数量、种类和群落结构的变化, 以期为正确评价抗生素菌渣无害化处理效果、处理后堆肥利用的生态安全性等提供理论参考.
1 材料与方法 1.1 堆肥材料试验用林可霉素菌渣取自河南省新乡华星制药厂; 辅料为风干猪粪堆肥, 取自河南省新乡县刘庄村猪场, 用于林可霉素菌渣和污泥的水分含量和通气性调节; 污泥取自河南省新乡刘庄生活污水处理厂.
试验材料理化性质如表 1所示.
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表 1 堆肥材料理化性状 Table 1 Physical and chemical properties of composting raw materials |
1.2 试验处理
处理(T):林可霉素500 kg+辅料300 kg, 混合材料的水分约50%.对照(CK):污泥500 kg+辅料300 kg, 混合材料的水分约48%.
1.3 试验方法样品采集:堆肥过程中每3 d人工翻堆搅拌一次, 翻堆并搅拌均匀后从堆体的前后左右和中心5个点取样, 混匀为一个样品.分两部分分别保存于-20℃和4℃.初始样、高温期和腐熟期样品分别自堆肥的第0、15和33 d, 样品命名处理样分别为: T0、T15、T33;对照样分别为CK0、CK15和CK33.送上海生工进行16S rDNA和18S rDNA多样性测序, 其余进行抗生素残留测定.
温度测定:堆肥期间将温度探头插入堆体30~40 cm深处, 于每天17:00在堆体前后左右和中心这5个点测温, 取平均值记为当日温度, 同时记录环境温度.
抗生素残留测定:取相当于堆肥干重10 g的堆肥鲜样, 超纯水50 mL, 涡轮振荡5 min.超声萃取60 min, 过滤, 以3000 r·min-1的转速离心30min, 取上清液过0.45 μm微孔滤膜后于HPLC上测定.色谱仪器型号为Agilent1200LC, 仪器生产厂家为Supelco, 色谱柱为Discovery C18柱, 柱温30℃, 检测器为紫外检测器, 检测波长为214 nm, 流动相为0.05 mol·L-1硼砂溶液(85%磷酸调节pH=6):甲醇=50:50;流速为1 mL·min-1, 样品进样量为20 μL.
堆肥DNA提取、PCR扩增、高通量测序:采用Omega D5625-01试剂盒(Omega Bio-Tek, USA)进行核酸提取.
PCR:细菌通用引物正向引物为341F(5′-CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN-3′); 反向引物为805R(5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAA TTCCA-3′); 真菌采用正向引物为SSU0817F(5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′); 反向引物为1196R(5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′).
所有PCR产物, 质控后进入上海生工高通量测序平台Illumina MiSeq进行样本多样性测定.
数据采用SPSS软件进行统计分析, 使用Excel、Origin进行作图.
2 结果与讨论 2.1 堆肥过程中温度的变化和抗生素残留变化情况堆肥过程中温度变化是直接反映堆体能否顺利进行的直接体现.堆肥过程中温度上升快、温度高则反映发酵条件较为适宜、微生物活动强烈等[15].从图 1(a)可以看出, 林可霉素菌渣堆体第3 d即进入50℃以上的高温期, 高温期持续了22 d, 最高温达到65℃; 而污泥堆体第12 d才进入高温期, 高温维持6 d即进入降温期.这表明与污泥相比, 林可霉素菌渣含有更多的易降解有机质(表 1), 更有利于微生物快速生长繁殖.图 1(b)为林可霉素堆体残留林可霉素随着堆肥时间的变化情况, 可以看出经过堆肥处理后残留的林可霉素显著降低, 至堆肥高温期时, 降解率高达70%, 经过堆肥处理后残留的林可霉素含量降解到483 mg·kg-1, 最终降解率为73%.大量研究表明抗生素降解跟温度有直接关系, 高温是抗生素降解的重要因素. Ho等[16]研究鸡粪堆肥过程中甲氧苄氨嘧啶、替米考星、泰乐菌素、红霉素、恩氟沙星、氟甲喹、诺氟沙星、磺胺嘧啶和多西环素等9种抗生素和孕激素的变化情况, 结果表明经过40 d堆肥后, 所有抗生素和激素降解率均在99%以上, 相关性分析表明高温是抗生素及激素降解的重要物理因素. Kakimoto等[17]研究了猪粪堆肥中羟氨苄青霉素的降解情况, 表明羟氨苄青霉素的降解主要受高温和pH影响. Ezzariai等[18]研究了堆肥过程中四环素类、大环内酯类、氟喹诺酮类对污泥堆肥过程中温度和化学参数的变化情况, 结果表明高温条件是抗生素降解的重要因素. Selvam等[19]以猪粪和锯末为原料, 研究了持续高温期四环素和磺胺类的去除情况, 结果表明, 高温是抗生素降解的主要因素, 经过连续6周55℃以上的高温, 磺胺类已检测不到, 四环素降解92%. Kim等[20]研究了用活性污泥、伽马射线、紫外线这3种处理下抗生素类物质林可霉素、四环素、磺胺二甲基嘧啶的去除情况, 结果发现相比于四环素和磺胺二甲基嘧啶, 林可霉素最稳定, 不易降解, 特别是活性污泥法处理情况下, 降解率仅为38.8%.
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图 1 堆肥过程中温度和林可霉素残留变化 Fig. 1 Changes of temperature and lincomycin residue during the composting process |
本研究用高效液相色谱法进行林可霉素残留的测定, 对照中污泥-猪粪堆肥整个堆肥过程中均没有检测到林可霉素残留.林可霉素菌渣-猪粪堆肥中林可霉素的起始浓度高达1800 mg·kg-1, 远高于自然环境中的抗生素残留[21].随着堆肥进程, 堆肥进入高温期, 林可霉素残留大幅度降解.然而随着堆肥继续进行, 堆肥降温进入腐熟期, 林可霉素降解明显减慢.表明高温可能是林可霉素降解的主要因素.最终堆肥中林可霉素浓度降至483 mg·kg-1, 降解率高达70%.因此, 为了进一步提高林可霉素的降解率, 需要采取措施以改变堆肥条件如延长高温期和提高温期温度等有可能有助于林可霉素残留的进一步降解.
2.2 堆肥高温期和腐熟期细菌和真菌丰度及多样性的变化研究群落生态学中微生物多样性, 通过研究样本的α多样性分析可以反映微生物群落的丰度和多样性.一般α多样性分析指标由以下指数组成.
(1) 覆盖度
覆盖度数值越高, 则样本中序列没有被测出的概率越低.该指数实际反映了测序结果是否代表了样本的真实情况.
(2) 群落分布丰度指数(Chao1和ACE)
群落丰度指数有Chao1指数和ACE指数. Chao1指数和ACE指数用来估算样本实际OUT数目, Chao1指数和ACE指数越大, 表明样本微生物群落丰度越高.
(3) 群落分布多样性指数(Shannon)
群落多样性指数有Shannon指数. Shannon指数越大, 表明群落多样性越高; 反之, 说明群落多样性越低.
图 2(a)可以看出, 污泥-猪粪堆肥和林可霉素菌渣-猪粪堆肥两者覆盖度均在0.8以上, 表明样本测序结果可以反映样本实际情况[22].图 2(b)显示两者堆肥开始、升温和降温过程中微生物丰度指数ACE和Chao1指数均表现出先升高后降低的趋势.同一时期对于细菌丰度来说, T处理始终低于CK, 可能是因为林可霉素残留的影响.林可霉素主要对细菌起作用, 林可霉素主要作用于敏感细菌核糖体的50S亚基, 阻止肽链的延长, 从而抑制细菌细胞的蛋白质合成以达到杀菌的目的[23].而对于真菌丰度来说, 同一时期T处理始终高于CK, 这是由于与污泥相比, 林可霉素菌渣中含有更多含量的有机质和蛋白(表 1), 从而更有利于真菌的生长.图 2(c)显示两者堆肥Shannon指数均表现出一直升高的趋势, 表明堆肥有利于微生物多样性的增加.比较细菌和真菌的多样性指数和丰度指数发现, 堆肥过程中细菌多样性和丰度远远高于真菌, 特别是堆肥高温期, 细菌丰度和多样性急剧增加.可能原因是细菌更耐高温, 而真菌不耐高温[24].
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图 2 堆肥过程不同处理条件下覆盖度、群落分布丰度和多样性指数 Fig. 2 Coverage, Chao1, ACE, and Shannon diversity indices applied to different treatments during the composting process |
图 3反映了林可霉素菌渣堆肥和污泥堆肥初始期、高温期和腐熟期细菌属水平的群落结构变化.其中, 林可霉素菌渣堆肥初始期和高温期主要以Paucisalibacillus、Cerasibacillus、Bacillus、Ureibacillus、Paenibacillus、Anaerococcus、Sinibacillus属为主, 群落结构单一.进入腐熟期后, Brackiella、Virgibacillus、Cerasibacillus和Pseudosphingobacterium属比例均有所增加, 分别由初始期的1.35%、0.50%、5.90%和0.1%增至7.31%、10.74%、11.29%和2.74%.除这些菌属外, 腐熟期林可霉素菌渣堆肥中Nubsella、Natronobacillus、Haloactinobacterium、Paenalcaligenes、Alcanivorax、Pseudosphingobacterium、Ornithinibacillus、Enteractinococcus等菌属均有不同程度的增加, 说明堆肥进入腐熟期后细菌属类更加丰富, 各属所占比例更加均衡, 表明经过堆肥处理后, 林可霉素菌渣堆肥多样性明显提高.张庆宁等[25]研究了生态养猪模式下发酵床优势细菌微生物学的性质, 发现猪粪中优势细菌为不同属类芽孢杆菌, 这些芽孢杆菌在猪粪和垫料混合堆肥过程中生长优势强, 耐发酵高温, 并且能产生多种降解淀粉、纤维素、蛋白质等有关的酶类, 除臭效果明显.刘国红等[26]通过研究养猪场微生物发酵床垫料微生物分布情况, 发现其中优势细菌为芽孢杆菌, 种类总含量高达4.41×108 cfu·g-1. Marina等[27]研究含有磺胺类抗生素的猪粪施入农田后的抗生素降解情况, 结果发现降解抗生素的主要菌属为Bacillus.推测林可霉素菌渣堆肥过程中由于高温、高含量林可霉素有毒物质等环境胁迫, 导致各类芽孢杆菌属占据主要地位.
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图 3 堆肥过程中优势细菌的相对丰度 Fig. 3 Relative abundance of dominant bacteria during the composting process |
污泥堆肥初始期、高温期和腐熟期优势菌属不明显, 优势菌属种类较多, 优势菌属相对丰度在1.01%~5.67%, 各属类之间更加均衡, 也从侧面表明污泥堆肥群落多样性较高.其中在初始期和高温期富集的属有Pseudomonas、Paracoccus、Bacillus、Gemmatimonas、Pseudosphingobacterium、Clostridium sensustricto.在腐熟期富集的属有Actinomadura、Truepera、Luteimonas、Streptomyces和Exiguobacterium. Su等[28]研究了下水道污泥混合稻糠堆肥过程中微生物群落结构的变化情况, 结果发现堆肥进入腐熟期, Actinomadura急剧增加, 与本文结果相似. Awasthi等[29]研究了生物质碳添加量对污泥堆肥高温期细菌微生物群落多样性的影响, 结果表明生物质碳影响了污泥堆肥过程中群落结构变化, 所有添加生物质碳堆肥样本中主要门类均为Proteobacteria、Firmicutes和Chloroflexi, 主要优势菌属为Pseudomonas、Acinomadura和Ureibacillus.
基于OUT(97%相似性)属水平做了主成分分析图(图 4), 从图 4可知, PCA1和PCA2分别解释了样本72%和16%的方差信息.两者共计解释88%的样本信息, 表明在这两个维度上能够反映样本的实际情况.结果表明林可霉素菌渣堆肥过程中, 细菌群落发生了显著的变化, 特别是堆肥初期和高温期林可霉素菌渣堆肥与污泥堆肥群落结构差异较大; 堆肥进入腐熟期后, 林可霉素菌渣堆肥与污泥堆肥细菌群落聚集, 群落差异减小.可能原因是林可霉素菌渣堆肥中林可霉素残留大幅降解, 细菌胁迫因素解除, 两者微生物群落趋于一致.
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图 4 属水平上细菌群落主成分分析 Fig. 4 Principal components analysis of the bacterial communities at genus level |
图 5可以看出, 林可霉素菌渣堆肥主要门类为Ascomycota门和Basidiomycota门. Ascomycota门包括Aspergillus、Chaetomium、Microascus、Acremonium、Monascus、Candida和Phialosimplex菌属, Basidiomycota门包括Trichosporon菌属.其中林可霉素菌渣初始期和高温期主要以Ascomycota门为主, Aspergillus所占比例由初期的15%猛增至41.16%, 堆体进入腐熟期后, 又以Basidiomycota门的Trichosporon菌属为主, 所占比例为37.62%.污泥堆肥主要以Ascomycota门的Aspergillus、Chaetomium、Microascus、Acremonium、Monascus、Gymnoascus、Yarrowia、Cephaliophora属和Basidiomycota门的Trichosporon菌属为主.初期Chaetomium只有2%, 随着堆体进入高温期, Chaetomium所占比例高达47.35%, 降温期Aspergillus比例高达41.24%. Gu等[30]研究鸡粪静态好氧堆肥过程中堆肥不同深度和时间真菌群落的变化情况, 结果表明堆肥过程中主要真菌门类亦为Ascomycota门和Basidiomycota门, 其中主要真菌属为Aspergillus和Acremonium. Zhang等[31]研究了玉米秸秆堆肥过程中真菌群落变化, 结果表明Ascomycota门高达90%, 其门下Thermomyces lanuginosus属为主要菌属.属水平PCA分析图(图 6)表明, PCA1和PCA2向量上共解释了样本信息的77%, 可以反映样本真菌群落的实际信息.由图 6可以看出经过堆肥化处理林可霉素菌渣堆肥和污泥堆肥真菌群落都发生了较大变化, 特别是进入腐熟期后, 林可霉素菌渣堆肥和污泥堆肥真菌群落结构差异减小, 相似性或趋同性增加.
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图 5 堆肥过程中优势真菌的相对丰度 Fig. 5 Relative abundance of dominant fungi during the composting process |
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图 6 属水平上真菌群落主成分分析 Fig. 6 Principal components analysis of the fungal communities at genus level |
(1) 林可霉素菌渣经过堆肥化处理后残留抗生素降解高达70%.
(2) 林可霉素菌渣堆肥过程中由于残留的林可霉素导致细菌群落丰度和多样性均低于污泥堆肥.
(3) 无论林可霉素菌渣堆肥还是污泥堆肥, 经过堆肥处理后细菌和真菌群落多样性均显著提升.
(4) 林可霉素菌渣堆肥和污泥堆肥堆肥初始期和高温期微生物群落结构差异显著, 堆肥进入腐熟期, 随着林可霉素残留大幅降解, 两者堆肥微生物群落结构逐渐趋同.表明通过堆肥方式可以一定程度上实现林可霉素菌渣的无害化.
(5) 改变堆肥材料进一步提高堆肥温度, 或延长高温时间等, 有可能进一步降解林可霉素残留, 从而彻底实现林可霉素菌渣的无害化和资源化.
致谢: 感谢河南省新乡华星制药厂对本研究的支持.郑州大学环境与生态研究所万俊锋、李顺义、李红丽、孙国平、郭巍巍等在采样和实验方面提供帮助, 在此一并致谢！| [1] | Zhang Q Q, Ying G G, Pan C G, et al. Comprehensive evaluation of antibiotics emission and fate in the river basins of China:source analysis, multimedia modeling, and linkage to bacterial resistance[J]. Environmental Science & Technology, 2015, 49(11): 6772-6782. |
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