2018, Vol. 39
2. 中国科学院沈阳应用生态研究所, 中国科学院污染生态与环境工程重点实验室, 沈阳 110016
, YUAN Mei-yu1,2 , SHI Rong-jiu2
, YAN Peng-ju1,2 , ZHAO Feng2 , HAN Si-qin2 , ZHANG Ying2
2. Key Laboratory of Pollution Ecology and Environmental Engineering, Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, China
硫酸盐还原菌(sulfate-reducing prokaryotes, SRP)是一大类能够利用硫酸盐为电子受体进行厌氧呼吸产生硫化氢(H2S)的微生物生理类群. SRP广泛分布于诸如油田的地下油藏[1, 2]、海洋沉积物[3, 4]等厌氧环境中, 并在这些生境中对碳、硫等元素的循环周转发挥着重要作用[5, 6].早在1926年, Bastin等[7]首次报道了油田采出水中栖息着SRP; 近几十年来, 越来越多的SRP种类在油田环境中被发现[8~11].这些微生物可利用随注入水进入油藏的SO42-或其他含硫化合物进行生长代谢, 并产生大量的H2S, 该过程也称油田的微生物酸化(microbial souring)[1, 12].由SRP引发的油藏酸化给油田开发带来一系列重大的生产和环境问题[13]: ①SRP的生长代谢过程及其产物H2S可引发并促进金属管线等设施发生腐蚀, 从而造成潜在的巨大经济损失和生产事故[14]; ②SRP产生的H2S会降低原油和天然气质量和经济价值, 增加后续处理成本; ③采出水和天然气中的H2S会对油田工人身体健康甚至生命产生危害; ④SRP生长代谢过程中产生的S2-可与其他离子形成硫化物沉淀(如FeS等), 进而降低油藏渗透率, 甚至堵塞油藏地层, 从而增加原油开采难度和开发成本.因此, 如何有效地控制油藏环境中SRP的生长及代谢活性, 降低或消除微生物酸化危害是石油工业面临的一项重要挑战[1, 12~14].
向注入水中投加化学杀菌剂是油田企业目前最为常用的用于控制SRP生长繁殖的方法[15].常用的杀菌剂包括戊二醛、四羟甲基硫酸磷(THPS)、季铵盐类化合物等[16, 17].化学杀菌剂化学结构多样, 可供选择的种类较多, 且在控制油田采出水及管线中SRP的生长繁殖的效果起效快[12].尽管如此, 化学杀菌剂也有其局限性:一方面, 长期使用一种化学杀菌剂, SRP会产生耐药性[18], 致使杀菌效果变差, 而提高杀菌剂的使用剂量又会进一步增加油田企业的成本; 另一方面, 绝大多数化学杀菌剂均具有较大的环境毒性, 这些杀菌剂在运输、存储和使用过程中对于人身健康和生态环境均存在潜在危害[1, 12].随着世界各国对于环境保护意识的逐渐增强, 日趋严苛的环境质量保护标准会进一步限制化学杀菌剂的应用.进一步优选低成本、有效、低毒性的化学杀菌剂或研发抑制SRP活性的其他方法对于油田微生物酸化控制具有重要意义.
渤海湾海域油田是我国第二大产油区, 年产原油3000万t以上[19].向油藏中注入海水是海域油田开采石油的常规技术手段.与陆地油田相比, 海水中含有的高浓度的SO42-(约28 mmol·L-1)会引发更为严重的油田酸化问题[20], 部分采出井的采出水中SRP的数量可高达106 MPN·mL-1数量级水平, 采出井端天然气中次生H2S浓度超过1000 mg·L-1.遗憾的是, 尽管目前已有一些研究者采用了不依赖于纯培养技术的方法揭示了油田环境中存在多种SRP, 但是对于我国海域高温油田环境中SRP的分离筛选、鉴定及生理活性的研究工作严重滞后, 这不但极大地限制了人们对海域油藏SRP微生物多样性、生理活性和油田酸化机理的科学认识, 同时也为油田企业有针对性地研发油田酸化控制技术带来了挑战.本研究从我国渤海湾海域某高温油田酸化严重的采出井的采出水样品中分离筛选到1株优势硫酸盐还原菌, 进一步研究了该菌株的生理特性, 并重点评价了几种化学杀菌剂和硫酸盐还原活性抑制剂对该优势SRP菌株产H2S活性的抑制效果.本研究结果有助于拓展我国海域高温油田环境中硫酸盐还原菌微生物多样性的认识, 并可为我国渤海湾海域高温油田微生物酸化机制及控制研究提供借鉴.
1 材料与方法 1.1 油井采出水的采集用于SRP筛选的油藏采出水取自我国渤海湾海域某高温油田的一个已发生微生物酸化的采出井.采用预先除菌的2.5 L聚乙烯材质塑料桶从采油井端采集采出液(原油与采出水的混合物), 然后迅速加盖密封.该采出液样品在7 d内运抵实验室.该采出井及其采出水的基本理化性质如表 1所示.
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表 1 渤海湾海域某高温油藏酸化采出井及采出水的基本理化性质 Table 1 Basic physicochemical characteristics of a producing well and the production water from an offshore high-temperature oilfield at Bohai Bay, China |
1.2 培养基
硫酸盐还原菌富集与筛选培养基M[21](g·L-1):乳酸钠(50%)1.25, Na2SO4 1.0, NH4Cl 1.0, C2H4KNaO6·4H2O 1.0, K2HPO4·3H2O 0.655, MgSO4·7H2O 0.5, Na2S2O3 0.2, NaCl 7.0, 巯基乙酸钠0.1, 酵母膏0.5, 柠檬酸铁铵0.2;固体培养基按1.8%加入琼脂粉.培养基的终pH为7.0~7.5.
简化培养基N(g·L-1):乳酸钠(50%)2.5, 酵母膏1, MgSO4·7H2O 1, NaCl 7.0, KH2PO4 0.5, 维生素C 0.1.培养基的终pH为7.0~7.5.该简化培养基用于硫酸盐还原菌纯菌株的生理活性评价与抑制性实验.在使用简化培养基评价硫酸盐还原菌菌株在不同盐度或pH条件下的生长特性时, 适当调整培养基中的NaCl浓度和pH梯度(见1.3.3节).培养基的配制、分装等过程均按照厌氧微生物培养基制备方法完成[22].厌氧管或厌氧瓶顶空气体为高纯N2(99.99%).
1.3 SRP分离筛选、优势菌株的生理特性及初步鉴定 1.3.1 SRP富集与菌株分离筛选用无菌注射器取采出水10 mL转接至含90 mL液体培养基M的厌氧瓶中, 然后将培养瓶置于60℃生化培养箱中恒温静置培养.待瓶内培养基变黑(4 d; 产生的H2S与Fe2+形成FeS黑色沉淀)后, 取瓶内富集培养液用液体培养基M进行10倍梯度稀释(最低稀释度为10-9), 然后采用Hungate滚管法[23]分离硫酸盐还原菌.挑取硫酸盐还原菌菌落后, 再重复液体培养、梯度稀释、滚管分离等步骤至少3次, 直至获得纯菌株(通过显微镜镜检与16S rRNA基因测序判定).
1.3.2 SRP菌株16S rRNA基因序列分析使用天跟生化科技有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)提取SRP菌株的基因组DNA.采用NanoDrop 2000(Thermo, USA)测定提取到的DNA浓度与纯度.采用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增近全长的16S rRNA基因片段. PCR扩增条件为: 95℃预变性5 min; 94℃变性1 min, 55℃退火30 s, 72℃延伸2 min, 35个循环后再在72℃延伸10 min.使用琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化获得的PCR扩增产物, 然后采用限制性内切酶HaeⅢ和MspⅠ(宝生物工程有限公司, 大连)对PCR扩增产物进行酶切.使用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物, 根据16S rRNA基因酶切产物的电泳谱带类型区分不同SRP菌株, 即不同的电泳谱带类型视为不同的“种”(可分类操作单元, OTU)选取不同OTU对应菌株的PCR扩增产物送至北京六合华大基因科技股份有限公司经TA克隆后测序.获得的序列经拼接、去除载体序列等处理, 然后通过BLASTn程序在GenBank数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行序列相似性比对分析.选取近缘序列后, 采用MEGA 7.0软件的Neighbor-Joining方法构建系统发育树, Bootstrap值设为1000.
1.3.3 优势SRP菌细胞形态与生理生化特性评价选取1.3.2节中出现频率最高的OTU所对应的菌株, 进行形态学观察和生理生化测定.取适量体积的对数期菌液, 在10000×g离心15 min, 用生理盐水重悬润洗菌体, 重复离心、洗涤步骤3次; 然后使用2.5%戊二醛磷酸钠缓冲液固定4 h, 使用0.5%戊二醛磷酸钠缓冲液重悬清洗菌体, 并依次用40%、70%、90%、100%乙醇溶液进行脱水处理, 最后使用冷冻保护剂叔丁醇处理, 于12000×g条件下离心15 min后, 将菌体沉淀在-80℃条件下冷冻干燥, 并经镀膜处理后通过扫描电镜(Quanta 250, Holland, 荷兰飞利浦公司)拍照.扫描电镜拍照在中国科学院沈阳应用生态所分析检测中心完成.
参照文献[24, 25]中的相关方法完成优势SRP菌株生理生化特性的测定.待评测的碳源(唯一电子供体)包括甲酸钠、果糖、葡萄糖、甘油、乳糖、蔗糖、乳酸钠、乙酸钠、丙酸钠、乙醇、丙酮酸钠; 待评测的唯一电子受体包括Na2SO4、Na2SO3、Na2S2O3、巯基乙酸钠、单质硫、NaNO3、NaNO2.此外, 使用培养基N考察温度、pH、盐度对优势SRP菌株生长及产H2S的代谢活性的影响.共设7个温度梯度, 分别为4、14、25、37、45、60、70℃; 使用HCl或NaOH调节培养基初始pH, 梯度为3.0、5.0、7.0、9.0、11.0;调整培养基中NaCl浓度为0%、0.7%、1%、3%、5%、10%、12%和15%, 考察菌株的耐盐性.上述实验中, 所有接菌处理的接种量为5%, 同时设“不接菌”和“接菌但不添加待评测碳源或硫源”的对照处理, 所有处理均设3个重复.除了温度影响评价实验外, 所有处理均置于60℃恒温静置培养.在30 d的观测期内定期取样测定菌株产生的H2S浓度.
1.4 不同杀菌剂及硝酸盐、亚硝酸盐添加对优势SRP菌株产H2S活性及数量的影响选取5种化学杀菌剂, 即分别为戊二醛、次氯酸钠、苄基三甲基氯化铵(benzyl trimethyl ammoniumchloride, BTAC)、溴硝醇和二氧化氯, 评价不同使用剂量对筛选到的优势SRP菌株产H2S活性的影响; 此外, 考察硝酸盐和亚硝酸盐添加对优势SRP产H2S活性的影响.厌氧瓶内杀菌剂、硝酸盐、亚硝酸盐的初始浓度梯度如表 2所示.取对数生长期优势SRP菌液, 按照5%的比例接种(接种后瓶内SRP初始数量为106 MPN·mL-1数量级水平).所有厌氧瓶置于60℃恒温静置培养30 d, 定期取水样测定H2S浓度变化, 选取代表性实验组, 测定特定时间节点水样中SRP数量及SO42-、NO3-、NO2-浓度变化.所有实验处理均设置3个平行.
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表 2 可能抑制优势SRP菌株产H2S活性的不同杀菌剂及硝酸盐、亚硝酸盐的添加剂量/mg·L-1 Table 2 Various concentration of biocides, nitrate, or nitrite used for evaluating the potential inhibition on H2S-producing activity of the predominant SRP isolate/mg·L-1 |
1.5 分析测定
H2S浓度的测定采用亚甲基蓝分光光度法(GB 13801-1992)完成; SO42-、NO3-、NO2-含量的测定采用离子色谱仪(ICS-900, 戴安中国有限公司)完成.所用的色谱柱为AS22分析柱, 淋洗液为4.5 mmol·L-1 Na2CO3和1.4 mmol·L-1 NaHCO3, 流速为1.2 mL·min-1, 温度为30℃.使用培养基M, 采用最大可能计数法(MPN)测定采出水或培养实验样品中硫酸盐还原菌的数量.采用重复测量单因素方差分析的方法评估杀菌剂或抑制剂添加实验中各处理组间差异的显著性.
2 结果与分析 2.1 渤海湾海域高温酸化油田采出水中的优势SRP菌筛选采用Hungate纯培养技术, 成功从采出水样品中分离筛选得到了55株SRP.这些菌株的16S rRNA基因的双酶切产物的电泳图谱仅展现了2种OTU类型(电泳结果未展示), 分别包含50个和5个菌株.该结果提示筛选获得的菌株可能属于两种不同的SRP.本实验从包含菌株数量最多OTU组别中挑取菌株作为优势菌进行后续研究, 优势菌株编号为BQ1.
2.2 菌株BQ1的细胞形态、系统发育关系及生理生化特性BQ1在固体M培养基上生长时形成圆形黑色菌落, 菌落表面略凸起; 扫描电镜结果显示, BQ1细胞呈短杆状且稍有弯曲, 两端钝圆, 菌体长度约在1.2~2.5 μm之间, 宽度约在0.5~0.8 μm之间(图 1).
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图 1 扫描电镜下硫酸盐还原菌菌株BQ1细胞形态 Fig. 1 Scanning electron micrograph of cells of sulfate reducer isolate BQ1 |
基于16S rRNA基因构建的系统发育树如图 2所示. BQ1与普通脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris Hildenborough)的16S rRNA基因序列相似性最高, 达99%, 提示两者的亲缘关系最近.
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图 2 菌株BQ1基于16S rRNA基因序列的系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree of isolate BQ1 based on the 16S rRNA gene sequence alignment |
菌株BQ1能利用本试验中评价的11种碳源进行生长(表 3), 最适碳源为甲酸钠. BQ1能利用Na2SO4、Na2SO3、Na2S2O3、单质硫产H2S, 而不能利用巯基乙酸钠、硝酸盐和亚硝酸盐为唯一电子受体进行生长代谢.菌株BQ1具有运动性, 胞内氧化酶阴性, 过氧化氢酶阳性.
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表 3 硫酸盐还原菌菌株BQ1的基本生理生化特性1) Table 3 Basic physio-biochemical features of the sulfate-reducing isolate BQ1 |
2.3 温度、pH及盐度对BQ1生长及产H2S活性的影响
如图 3所示, 菌株BQ1在14~70℃条件下均能生长, 显示该菌具有适应较宽泛环境温度条件的能力, 是一种耐高温菌.第10 d时, BQ1在30℃培养的厌氧瓶内H2S的累积浓度最大, 提示该菌的最适生长温度为30℃.在4℃条件时, BQ1生长十分缓慢, 第10 d时在瓶内几乎检测不到H2S产生, 第60 d时, 瓶内的H2S依然小于1.0 mg·L-1.在70℃条件下, 菌株可以生长, 且产生H2S.在pH为6.0~9.0时, 菌株可生长且能产H2S, 最适pH为7.0; BQ1在NaCl浓度为0%~10%条件下均可生长且产H2S, 但在NaCl浓度为15%条件下不生长.
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图 3 温度、pH及盐度对菌株BQ1产H2S活性的影响 Fig. 3 Effects of temperature, pH, and salinity on the sulfidogenic activity of isolate BQ1 |
添加不同浓度硝酸盐的各处理的厌氧瓶内不同时间节点的H2S累积浓度无显著差异(P>0.05).为简便起见, 仅以添加800 mg·L-1硝酸盐的处理组和不添加硝酸盐的对照组数据为例进行作图展示.如图 4(a)所示, 添加浓度高达800 mg·L-1的NO3-仍无法抑制BQ1的硫酸盐还原活性, 处理组瓶内H2S累积浓度与不添加硝酸盐的对照无显著差异(P>0.05).本研究测定了添加80 mg·L-1硝酸盐处理组瓶内各阴离子的浓度[图 4(b)], 结果显示瓶内硫酸盐在第2 d时已被BQ1完全还原生成了H2S, 而所加入的硝酸盐未被利用, 未检测到亚硝酸盐的产生.该结果再次说明, 菌株BQ1无利用硝酸盐的能力, 而单独加入硝酸盐无法有效抑制菌株BQ1产H2S的代谢活性.
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图 4 添加硝酸盐对BQ1产H2S活性的影响及瓶内各离子浓度变化 Fig. 4 Effects of nitrate addition on sulfide production by BQ1 and the dynamics of anion concentration |
添加NO2-能够显著抑制BQ1产H2S的代谢活性.初始浓度为70 mg·L-1即可抑制菌株BQ1产H2S的活性超过30 d[图 5(a)].相似地, 在30 d实验周期内, 浓度高于70 mg·L-1 NO2-的处理组均未产生H2S(数据未展示).该结果显示, NO2-具有较好的抑制BQ1产H2S代谢活性的效果.有关离子的测定结果显示, 添加亚硝酸盐后, 培养瓶内的SO42-和NO2-均未发生显著变化, 提示BQ1的生长被亚硝酸盐强烈抑制[图 5(b)].
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图 5 添加亚硝酸盐对BQ1产H2S活性的影响及瓶内各离子浓度变化 Fig. 5 Inhibition of BQ1 by nitrite and the concentrations of various anions within the treatments |
不同浓度的戊二醛对BQ1产H2S活性的抑制效果如图 6(a)所示.初始浓度高于50 mg·L-1的戊二醛能够抑制菌株BQ1产H2S的活性超过30 d.当50 mg·L-1的戊二醛与BQ1作用24 h后, 菌体数量由初始的106 MPN·mL-1数量级水平降低至101 MPN·mL-1(表 4).该结果提示, 菌株BQ1对戊二醛比较敏感, 戊二醛具有高效抑制渤海湾高温油田微生物酸化的潜力.
与戊二醛不同的是, 使用初始浓度高达600 mg·L-1的次氯酸钠仍无法有效抑制BQ1的产H2S活性[图 6(b)], 尽管加入次氯酸钠后不同时间节点培养瓶内H2S浓度值与对照处理组具有显著性差异(P < 0.05).第30 d时, 添加200~600 mg·L-1次氯酸钠的各处理组培养瓶内H2S浓度均在80 mg·L-1左右.加入600 mg·L-1次氯酸钠24 h后, BQ1微生物数量由初始的106 MPN·mL-1数量级水平降低至103 MPN·mL-1(表 4).该结果表明, 菌株BQ1对次氯酸钠呈现出一定的耐受能力.
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图 6 不同杀菌剂对BQ1产H2S活性的抑制 Fig. 6 Inhibitory effects of various biocides on sulfide production by isolate BQ1 |
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表 4 杀菌剂对菌株BQ1数量的杀菌效力 Table 4 Biocidal efficacy of selected biocides against SRP isolate BQ1 |
与次氯酸钠的结果类似, 杀菌剂BTAC在浓度高达300 mg·L-1时仍无法有效抑制BQ1产H2S的代谢活性[图 6(c)].尽管添加BTAC的各处理组瓶内H2S浓度略低于对照组, 但第30 d时瓶内H2S浓度值也超过了80 mg·L-1.加入300 mg·L-1次氯酸钠24 h后, BQ1微生物数量由初始的106 MPN·mL-1数量级水平降低至102 MPN·mL-1(表 4).
初始浓度为10 mg·L-1的溴硝醇在前10 d内能抑制BQ1产生H2S[图 6(d)], 但该处理组瓶内H2S浓度在第20 d时已经超过60 mg·L-1, 提示低浓度的溴硝醇不能长期抑制BQ1的活性; 当溴硝醇的初始质量浓度>30 mg·L-1时, 菌株BQ1在30 d的实验周期内无法产生H2S. 30 mg·L-1溴硝醇在24 h内能将BQ1完全杀死(表 4).该结果表明, 溴硝醇也具有高效抑制渤海湾高温油田微生物酸化的潜力.
添加10~30 mg·L-1二氧化氯的各处理组H2S浓度与对照几乎相同, 约为120 mg·L-1.但浓度为50 mg·L-1的二氧化氯抑制菌株BQ1产H2S的活性超过30 d[图 6(e)]. 50 mg·L-1的二氧化氯在24 h内将BQ1数量从106 MPN·mL-1数量级水平降低至101 MPN·mL-1(表 4)数量级水平.
3 讨论 3.1 菌株BQ1与近缘种Desulfovibrio vulgaris Hildenborough生理活性的差异本文从我国渤海湾海域高温油田酸化采出井的采出水中成功分离了1株优势SRP菌株BQ1. BQ1的16S rDNA序列与D. Hildenborough的相似性最高(99%), 提示两者亲缘关系可能最近.包括D. vulgaris在内的许多脱硫弧菌属微生物种群常见于油田环境中[26, 27], 提示这些微生物类群在油田注水开发过程中很好地适应了油藏环境, 并可能在油田微生物酸化和腐蚀过程中扮演着重要角色.尽管如此, BQ1表现出了耐高温、耐盐等生理特性, 这与脱硫弧菌属内的微生物, 特别是与D. vulgaris Hildenborough的差异明显: ①BQ1的最适温度为30℃左右(图 3), 能够耐受的最高温度为70℃, 而D. vulgaris Hildenborough的最适温度为30~36℃, 最高耐受温度44℃; ②1.5%的NaCl能够抑制D. Hildenborough的生长(细胞浓度降低50%)[28], 但BQ1在10%的NaCl浓度下的生长及代谢活性未受明显影响(图 3); ③BQ1能够以单质硫为唯一电子受体产生H2S, 但是D. vulgaris Hildenborough不能利用单质硫; BQ1能够利用乙酸、丙酸为唯一碳源进行生长, 但是D. vulgaris Hildenborough不能利用小分子的脂肪酸和乙酸盐.这些研究结果提示, 虽然BQ1在形态和系统发育上与D. vulgaris Hildenborough具有较高相似性, 但由于环境的差异(高温高盐)可能造成菌株对不同环境的适应性不同, 造成了菌株在生理生化特征上的一些改变.另有研究表明, 从大庆油田采出水中筛选出的1株硫化氢产生菌, 其16S rRNA基因序列与脱硫弧菌属相似性最高(99%), 但该菌株也能耐受10%的NaCl浓度, 且在pH为6.0~11.0范围内生长[29].这些结果提示, 脱硫弧菌属的微生物种群对油藏环境条件具有较强的适应性.另一方面, 在未来的研究工作中, 非常有必要通过基因组学等多种方法的综合应用进一步揭示硫酸盐还原菌的环境适应性进化机制.本研究结果显示, BQ1的耐高温、耐高盐的生理特性可能对于确保其适应渤海湾油藏内的高温、高盐环境具有重要作用(表 1).
BQ1不能利用硝酸盐为唯一电子受体进行生长代谢, 提示BQ1不具有异化硝酸盐还原成铵的代谢活性[30, 31], 这与D. vulgaris Hildenborough的特性相似[32].添加800 mg·L-1硝酸盐时, 菌株产H2S的代谢活性未受任何影响, 该结果显示BQ1对硝酸盐具有耐受能力, 硝酸盐的添加无法有效抑制由该菌株引发的油藏酸化.另有研究也表明, 单纯补加硝酸盐无法抑制北海高温油田中硫酸盐还原菌(Thermodesulforhabdus norvegicus和Archaeoglobus fulgidus)的代谢活性[33]. Korte等[34]的研究则显示, 尽管高浓度的硝酸盐(6000 mg·L-1)能够短期抑制D. vulgaris Hildenborough菌株生长, 但是胁迫后的子代菌株几乎完全不受该浓度水平硝酸盐的抑制. He等[35]的研究结果也显示, D. vulgaris Hildenborough能够耐受高达12000 mg·L-1的硝酸盐.在本研究中由于重点是考察低剂量的硝酸盐抑制油田酸化的有效性, 因此实验处理中未包含浓度大于800 mg·L-1的处理.未来研究中, 有必要明确菌株BQ1耐受硝酸盐的最高浓度, 这将进一步深化对我国高温油田硫酸盐还原菌生理特性的认识.
亚硝酸盐是硫酸盐还原过程中的亚硫酸盐还原酶的竞争性抑制剂[36], 在细胞内缺乏亚硝酸盐还原酶的硫酸盐还原菌类群中, 低浓度的亚硝酸盐即可有效抑制硫酸盐还原的代谢活性.本研究中, BQ1不能利用亚硝酸盐为唯一电子受体进行生长, 且浓度低至70 mg·L-1的亚硝盐能抑制BQ1产生H2S的代谢活性达30 d以上, 这表明BQ1对亚硝盐的“毒性”更为敏感.尽管如此, 人们仍需要有关BQ1基因组中是否存在亚硝酸盐还原酶基因的直接证据.据报道, 与BQ1亲缘关系较近的D. vulgaris Hildenborough基因组中有编码亚硝酸盐还原酶NirHA的基因[37];最新的研究进一步显示, D. vulgaris Hildenborough能够利用亚硝酸盐为唯一电子受体进行生长代谢[38].在利用亚硝酸盐方面, 菌株BQ1与D. vulgaris Hildenborough间的差异值得进一步研究.另一方面, BQ1对亚硝酸盐的敏感性对于使用亚硝酸盐控制渤海湾海域高温油田微生物酸化是有利的, 源自北海高温油田的有关研究也证明亚硝酸盐抑制硫酸盐还原菌产H2S活性方面比硝酸盐更有效[33].
3.2 杀菌剂剂量对于抑制硫酸盐还原菌代谢活性的差异同一种杀菌剂在杀死或抑制不同油田硫酸盐还原菌中的使用剂量和效果存在显著差异.有研究显示[39], 戊二醛、溴硝醇在抑制加拿大Coleville油田中SRP的最低抑制浓度分别为500 mg·L-1和800 mg·L-1.本实验中, 戊二醛、溴硝醇能够有效抑制BQ1的浓度远低于Coleville油田的使用剂量, 仅分别为50 mg·L-1和30 mg·L-1; 对于印度Kathloni油田杀菌剂的研究结果显示[40], 单独使用25 mg·L-1的次氯酸钠、苄基三甲基氯化铵(BTAC)、溴硝醇在2 h内即可全部杀死从该油田采出水中分离到的SRP(初始数量达108 MPN·mL-1).但在本研究中, 能够有效抑制BQ1活性所需的次氯酸钠、BTAC的浓度远高于Kathloni油田杀菌剂使用量.本实验投加50 mg·L-1二氧化氯才能使BQ1得到有效抑制.造成这些差异的原因可能与特定油田中待评测的硫酸盐还原菌种类、杀菌剂应用历史、油藏环境条件有关[15].这些差异再次提示, 控制油田酸化的技术研发需要针对特定油藏的实际环境及SRP物种组成及代谢特点开展深入的分析研究[1, 12].除抑制效果外, 选取的几种杀菌剂相较于其他杀菌剂, 具有相对安全、低毒等特性, 虽部分杀菌剂成品价格高, 但相对于同类型杀菌剂其维护成本、设施造价及管理成本低.本实验结果显示, 溴硝醇和戊二醛可以高效抑制或杀灭渤海湾海域油藏中的SRP优势菌株, 这两种杀菌剂在该区域油藏酸化控制中可能具有较大的应用潜力.尽管如此, 在未来的工作中仍有必要进一步评价这几种杀菌剂在渤海湾海域高温油田中应用的经济可行性及其他油田开发过程的潜在影响(如结垢效应等).
4 结论(1) 通过厌氧Hungate技术获得的渤海湾海域高温油田采出水中可培养的优势硫酸盐还原菌菌株BQ1的16S rRNA基因序列与Desulfovibrio vulgaris Hildenborough相似性达99%.该菌株具有耐高温(70℃)、耐盐(10%的NaCl)的生理特性; 菌株能够利用多种碳源进行生长代谢, 能利用硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐和单质硫为唯一电子受体产生H2S, 但不能利用硝酸盐和亚硝酸盐;
(2) 50 mg·L-1的戊二醛、30 mg·L-1的溴硝醇或50 mg·L-1的二氧化氯可单独抑制BQ1产H2S的代谢活性达30 d以上, 是潜在的高效杀菌剂; 而初始浓度分别为600 mg·L-1和300 mg·L-1的次氯酸钠和BTAC对于BQ1的抑制效果不明显;
(3) 浓度为800 mg·L-1的NO3-无法抑制BQ1的生长和产H2S活性, 而70 mg·L-1的NO2-对BQ1的抑制时间长达30 d以上, 是潜在的有效抑制剂.
致谢: 感谢中国科学院沈阳应用生态研究所、中国科学院污染生态与环境工程重点实验室庄杰研究员、严俊研究员、李秀颖博士对本研究中硫酸盐还原菌筛选等方面的帮助和支持！| [1] | Gieg L M, Jack T R, Foght J M. Biological souring and mitigation in oil reservoirs[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 92(2): 263-282. DOI:10.1007/s00253-011-3542-6 |
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