2018, Vol. 39
随着全球经济的迅猛发展、工业的快速进步以及化肥、农药种类的增加与过度使用, 土壤重金属污染日益严重.其中, 砷污染广泛存在于世界各国家地区, 已成为全球共同面临的环境问题[1, 2].与砷相关的土壤质量与人类健康问题也受到了越来越多关注[3, 4].砷是一种致癌物质, 长期饮用高砷水会导致慢性砷中毒和癌症.天然过程以及人类活动(如:化石燃料的燃烧, 含砷农药的使用, 工业尾矿、废水的排放等)都会导致砷污染的形成.由于岩浆活动, 全球每年自然排放的砷量为8000 t, 人类活动导致的砷排放量为每年23000 t[5].微量的砷可以促进人体的新陈代谢, 但是摄入量过多, 砷就会在人体内积累, 导致砷中毒, 很多地方病的出现也都与砷相关.长期饮用高砷地下水会引起肝癌、肺癌、皮肤癌以及一些其他的非癌症病变, 如神经系统疾病、儿童发育障碍等[6, 7].鉴于砷的高危害性, 联合国卫生组织于1993年把饮用水标准中砷的浓度由50 μg·L-1降低为10 μg·L-1[8].土壤中的砷主要以无机态的砷酸盐[As(Ⅴ)]和亚砷酸盐[As(Ⅲ)][9, 10]赋存.由于土壤中含有大量的矿物质及有机质, 砷很容易与这些矿物质及有机质发生吸附、络合等作用, 导致砷赋存形态的转变[11, 12].砷的赋存形态是影响其毒性、生物有效性和迁移、转化等环境行为的重要因素, 因此, 研究砷在土壤中形态转变是十分重要的.
砷在环境中的迁移、转化和归趋受多种过程和因素的影响, 有研究表明, 微生物的作用是控制砷存在形态改变的重要因素之一[13~16].作为土壤中的主要成分, 腐殖质对重金属的吸附和络合作用具有重要的环境作用和地球化学意义[17].胡敏酸(HA)作为腐殖质的主要组成部分, 可以与As发生络合作用以降低砷的迁移转化, 从而可以降低有毒物质的扩散[10, 18~22].已经有学者研究过砷与胡敏酸的络合[23, 24].但研究微生物对胡敏酸络合砷的作用较少, 本研究在制备出HA-As(Ⅲ)络合态砷的基础上, 利用已筛出的砷氧化菌(HN-2)[15]与该络合态砷进行作用, 探究氧化菌对砷的转化, 并通过分析液相及固相中砷的形态和含量, 探讨砷在固液两相之间的分配, 以期为探讨砷的生物地球化学循环提供相关依据.
1 材料与方法 1.1 胡敏酸络合三价砷HA-As(Ⅲ)的制备称取1 g胡敏酸于50 mL离心管中, 溶于25 mL 0.1mol·L-1的NaOH溶液(超纯水配置)中, 摇匀至胡敏酸完全溶解.将离心管置于恒温空气浴恒温振荡器中, 25℃, 振荡8 h.然后4000 r·min-1离心30 min, 将上清液移出, 加入5 mL 1000 mg·L-1的亚砷酸钠溶液, 25℃条件下250 r·min-1振荡24 h.随后4000 r·min-1离心30 min后将上清液取出, 用浓度为6 mol·L-1的盐酸溶液调节pH为2, 离心去除上清液.最后将固相物质用pH=2的超纯水洗5遍以保证未络合到胡敏酸上的As(Ⅲ)被清洗掉.最终得到HA-As(Ⅲ)络合物, HA-As(Ⅲ)络合物占加入As(Ⅲ)总量约32 mg·g-1.为了验证胡敏酸络合三价砷[HA-As(Ⅲ)]的制备结果, 将合成样品稀释过0.22 μm滤膜后用SEC-ICP-MS(尺寸排阻色谱-电感耦合等离子体质谱)进行测定, 样品的测定结果与混标的测定结果对比发现, 前者出现了HA-As(Ⅲ)的特征峰, 这一结果与文献[25, 26]的报道结果相吻合.
1.2 砷氧化菌株的活化及培养砷氧化菌HN-2是从我国湖南省株洲市的砷污染土壤中培养出的[15].
1.3 实验方法本实验过程中, 所有器皿都要经过10%硝酸溶液浸泡24 h.然后经过高压蒸汽灭菌处理.所有操作均在超净台中实现.先在锥形瓶中加入不含乳酸钠的CDM(chemically defined medium)[27]培养基98 mL, 取1.2节所得菌株(由细胞密度为107 CFU·mL-1的25 mL菌液离心所得)加入培养基中, 然后将制得的HA-As(Ⅲ)加入锥形瓶中.将锥形瓶中溶液用2 mol·L-1 HCl分别调节到pH为5、6、7、8.设置转速150 r·min-1, 30℃在振荡器中进行振荡.分别在0、1、2、5、10、15、24、48、96 h时间点进行取样, 每个处理设置3个平行样.将所取的样品过0.22 μm的滤膜, 滤液用3%~5%硝酸溶液进行稀释, 储存.最后用HPLC-ICP-MS测定溶液中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的含量, 用ICP-OES测定溶液中砷的总量, 用SEC-ICP-MS定性分析液相中络合态HA-As(Ⅲ)与游离态As(Ⅲ).用Origin软件进行不同pH值实验结果显著性分析.得到液相中样品测定结果并经过分析后, 选取pH=7的固相样品进行冻干, 然后采用同步辐射分析其中砷的形态.
1.4 试剂和仪器Aldrich Humic Acid (HA, Sigmar)、NaAsO2、NaOH、HCl、H2SO4以及LB和CDM培养基[27]等所需试剂均是分析纯及以上纯度. As(Ⅲ)溶液是将一定量亚砷酸钠(NaAsO2)溶解于超纯水中作为母液, 逐级稀释得到所使用的浓度.
高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS, 7500a; Agilent Technologies), 色谱柱来自Hamilton.流动相由10 mmol·L-1磷酸氢二铵[(NH4)2HPO4]、10 mmol·L-1硝酸铵(NH4NO3)构成.尺寸排阻色谱-电感耦合等离子体质谱(SEC-ICP-MS), 流动相由0.02 mol·L-1的乳酸钠配置而成, 流动相以1 mL·min-1的流速泵入色谱柱.同步辐射(XANES, 北京, 中国科学院高能物理研究所). pH计(METTLER TOLEDO SG, CH)等.
2 结果与分析 2.1 不同pH条件下, 液相中砷形态变化不同pH体系中, HN-2砷氧化菌与HA-As(Ⅲ)互存时, 液相中As(Ⅲ)和As(Ⅴ)浓度随时间变化的结果见图 1.当体系为酸性条件(pH为5, 6)时, 反应达到平衡后, 液相中As(Ⅲ)和As(Ⅴ)浓度差异性不显著.并且在酸性条件下, 反应0~10 h时, 不含砷氧化菌氧化的体系中, HA对As(Ⅲ)缓慢, 同时含砷氧化菌体系中, HN-2对As(Ⅲ)的氧化率也较低.当pH为7时, 含有砷氧化菌体系中As(Ⅲ)的氧化率最高, 可以达到95%以上.而在偏酸或偏碱的环境中, HN-2砷氧化菌As(Ⅲ)的氧化均受到抑制[15].对比图 1 (a)与图 1(d)的结果, 可以看出, 在不含有氧化菌的体系中, 随着pH的升高, As(Ⅲ)的氧化率逐渐升高.其中反应96 h时, pH为5的不含砷氧化菌体系中As(Ⅲ)浓度为400 μg·L-1, 而pH为8的不含砷氧化菌体系中As(Ⅲ)浓度仅为60 μg·L-1, As(Ⅲ)的氧化率可以达到80%左右.因此, 在不含菌株的体系中, 碱性条件更有利于As(Ⅲ)的氧化.
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Bac-As(Ⅲ)和Bac-As(Ⅴ)分别表示含菌体系中As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的浓度变化, No Bac-As(Ⅲ)和No Bac-As(Ⅴ)分别表示不含菌体系中As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的浓度变化 图 1 不同pH条件下液相中As(Ⅲ)和As(Ⅴ)浓度变化情况 Fig. 1 Concentration change of As(Ⅲ) and As(Ⅴ) with time in the liquid phase at different pH |
综合胡敏酸和HN-2砷氧化菌的作用, 可以发现在pH=7时, As(Ⅲ)被氧化为As(Ⅴ)的效率最高.
图 1(c)中, 在不含砷氧化菌的体系中, 液相中As(Ⅲ)的浓度在1 h内急剧上升, 随后开始缓慢下降, 48 h后趋于平衡, 液相中As(Ⅲ)平衡浓度稳定在约60 μg·L-1. As(Ⅲ)在1 h内大幅上升主要是因为反应体系pH上升, 振荡过程中, 一部分HA-As(Ⅲ)重新分解为胡敏酸和游离态As(Ⅲ). 1~48 h期间, 液相中As(Ⅲ)含量逐渐降低, 主要是因为HA将液相中游离态As(Ⅲ)氧化成As(Ⅴ).由于在材料的合成过程中胡敏酸可以将As(Ⅲ)氧化成As(Ⅴ), 因此液相中As(Ⅴ)的初始浓度约为2.34 mg·L-1.从图 1中可以看出, 随着时间的变化, 液相中As(Ⅴ)含量先快速上升后在24 h时达到平衡状态. As(Ⅴ)增加的量远高于As(Ⅲ)减少的量, 这是由于一部分As(Ⅴ)来源于As(Ⅲ)的氧化, 另一部分来源于pH变化导致的吸附在胡敏酸上的As(Ⅴ)的释放.
反应体系中加入砷氧化菌, 由于菌株可以快速将游离态As(Ⅲ)氧化为As(Ⅴ), 因此As(Ⅲ)的浓度呈现快速下降的状态, 而As(Ⅴ)的含量逐渐上升.反应5 h后接近平衡.最终当含有砷氧化菌与不含砷氧化菌的体系均达到反应平衡时, 含菌株体系中As(Ⅲ)平衡浓度比不含菌株体系低46 μg·L-1, 而含菌株体系中As(Ⅴ)平衡浓度比不含菌株体系高49 μg·L-1, 因此含菌株体系中的约3.3%As(Ⅲ)是砷氧化菌作用的结果.这证明在0~48 h期间, 含菌株体系中, As(Ⅴ)的量一部分来源于胡敏酸的释放与氧化, 一部分来源于砷氧化菌氧化As(Ⅲ).而不含菌株的体系中, 仍有一部分HA-As(Ⅲ)中的As(Ⅲ)未被氧化.
2.2 砷氧化菌与HA-As(Ⅲ)的作用下固相中砷形态变化同步辐射测定砷结果见图 2.图 2(b)中可以得出, 反应10 h时, 含菌株样品所呈现的特征峰并不明显.但反应96 h时, HA-As(Ⅲ)在含有砷氧化菌的条件下出现了As(Ⅴ)的特征峰, 而不含砷氧化菌时, 样品中出现的是As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的特征峰, 其中As(Ⅴ)的特征峰较明显.这证明砷氧化菌可以将络合态As(Ⅲ)释放氧化为As(Ⅴ), 并再吸附或可能直接将As(Ⅲ)氧化.
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SS表示标准物质, HA-As(Ⅲ)-Bac-96 h和HA-As(Ⅲ)-No Bac-96 h是含有砷氧化菌与不含砷氧化菌作用时反应96 h的样品, HA-As(Ⅲ)-Bac-10h是含有砷氧化菌作用时反应10 h的样品 图 2 固相中砷形态变化情况 Fig. 2 Change of arsenic speciation in the solid phase |
反应10 h和96 h时, 含砷氧化菌株体系与不含菌株的体系中固相上各形态的As的变化情况见表 1.从中可以看出, 反应10 h时, 含有砷氧化菌中As(Ⅲ)含量为10.6%, HA-As(Ⅲ)的含量为2.4%.反应96 h时, 含菌株体系与不含菌株体系中As(Ⅴ)比例均为60%左右, HA-As(Ⅴ)比例均为32%左右.但含有砷氧化菌的体系几乎没有HA-As(Ⅲ), 而不含砷氧化菌的体系中仍旧含有1.6%的As(Ⅲ)和3.3%的HA-As(Ⅲ).这说明HN-2砷氧化菌可以将络合态HA-As(Ⅲ)转化为游离态As(Ⅲ)并氧化为As(Ⅴ).
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表 1 同步辐射拟合结果/% Table 1 Result of XANES/% |
3 讨论
微生物对砷的转化以及对砷的生物地球化学循环起着非常重要的作用.微生物将As(Ⅲ)氧化成As(Ⅴ)的过程, 可以影响砷的迁移性和毒性. Zhang等[15]筛选并讨论了HN-2砷氧化菌对As(Ⅲ)的氧化作用机制, HN-2以乳酸钠作为能量与细胞物质来源, 将细胞膜外As(Ⅲ)转化成毒性较低的As(Ⅴ), 并使之更不易进入细胞内.通过不同pH对HN-2砷氧化菌氧化As(Ⅲ)的探究可以发现HN-2砷氧化菌在酸性和碱性条件时其氧化作用会受到抑制, 在中性条件下氧化作用最强.同时, HN-2砷氧化菌对As(Ⅲ)的氧化效率很高, 可以在反应5 h左右, 将5 mg·L-1 As(Ⅲ)氧化90%左右, 这也进一步解释了在含有HN-2砷氧化菌的体系中, 反应0~1 h期间并不会出现游离态As(Ⅲ)浓度上升的原因.
胡敏酸是土壤中最丰富的有机物质之一, 且胡敏酸对于As的价态转化具有重要作用.同时HA可以促进土壤对As的吸附, 降低土壤中As的迁移, 从而降低毒性的扩散.溶解性有机质还可以通过与As形成络合物DOM-As而影响砷的迁移转化.但是这种络合物可能会由于受到空间位阻、表面电荷等因素的影响而不容易被固相表面吸附, 它可能存在于液相或者胶体相中[22, 28, 29].将HA与As(Ⅲ)络合过程中, 胡敏酸可以将一部分As(Ⅲ)氧化为As(Ⅴ), 这一过程通过减少As(Ⅲ)的迁移和促进As(Ⅲ)的转化降低了砷的毒性, 但实验制备过程中胡敏酸与As(Ⅲ)的络合条件较为严格, 在实际环境中可能不具很好的应用价值.
实际上, 土壤中有机质、铁离子、砷氧化菌以及砷是同时存在的, 并且还会存在其他影响砷转化的因素, 这就会导致砷与溶解性有机物络合将会受到竞争作用的影响.但也有研究表明, 若先使HA与Fe形成复合物, 那这种复合物与砷的络合能力将会大大增强[25], 从而使得在土壤中砷的氧化释放过程将更加复杂.而溶解性有机物的存在可以为几乎所有的微生物反应和电化学反应作电子供体, 这有利于砷氧化菌在含有溶解性有机质的条件下发挥作用, 因此pH为7的条件下, HA与HN-2砷氧化菌共同作用可以将体系中95%以上的As(Ⅲ)的氧化为As(Ⅴ).
4 结论(1) 液相中, HN-2砷氧化菌在pH=7时对HA-As(Ⅲ)作用的氧化效果最明显, 0~10 h期间, 体系在振荡过程中可以释放一部分As(Ⅲ)及As(Ⅴ), 同时砷氧化菌可以快速地将As(Ⅲ)氧化为As(Ⅴ), 而胡敏酸可以较缓慢地将As(Ⅲ)氧化为As(Ⅴ); 反应10~24 h, HN-2砷氧化菌可以将络合态HA-As(Ⅲ)转化为游离态As(Ⅲ)并氧化为As(Ⅴ), 48~96 h反应达到平衡.
(2) 同步辐射结果表明, 反应10 h时, 含菌株体系与不含菌株体系中均有一部分HA-As(Ⅲ)尚未被分解并氧化.反应进行到96 h时, 含有菌株的体系中HA-As(Ⅲ)已被完全分解并氧化为As(Ⅴ), 不含有菌株的体系中, 仍存在HA-As(Ⅲ)未被氧化.同时, 由于As(Ⅴ)与HA更容易结合, 因此在各个时间段均存在30%左右HA-As(Ⅴ).
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