目前, 活性污泥法已成为城市生活污水和工业废水处理的主流工艺, 良好的泥水分离是保证该系统高效稳定运行的重要前提^{[1, 2]}. Chen等^[3]在研究脱氮系统中缺氧区与好氧区体积比对污泥沉降性及菌群结构影响时, 利用CA分析发现污泥沉降性能与菌群结构存在相关性. Wang等^[4]研究城镇污水处理厂污泥膨胀过程中微生物群落结构的变化时发现, 当污泥沉降性能发生改变时, 细菌群落从变形菌门转向放线菌门.陆鑫等^[5]利用16S rRNA基因克隆文库技术分析城市污水处理厂低温条件污泥膨胀的生物学成因, 研究发现该现象与工艺中Haliscomenobacter(束缚杆菌属)和Trichococcus(毛球菌属)这两类膨胀菌的生长繁殖息息相关.由此可见, 污泥沉降性能的变化与系统中优势菌群的演替密切相关.同时也有研究表明, 胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)对活性污泥的表面电荷、絮凝作用、吸附性能及脱水特性等物化性质有着重要影响, 进而改变活性污泥的沉降性能^{[6, 7]}. Liu等^[8]的研究发现EPS含量的增加有利于改善污泥微生物间的“聚结”性能, 进而提高污泥的沉降性.王浩宇等^[9]的研究表明, 随着EPS中蛋白质含量的增加, 污泥的表面电位逐渐降低, 有助于污泥之间的聚集过程.针对这种以微生物为主体的活性污泥工艺, 菌群结构和代谢产物均是影响沉降性能的重要因素, 而之前的报道鲜见将两者结合, 综合分析影响污泥沉降性能的内在原因.

本研究连续运行了AAO脱氮除磷(Ⅰ阶段)、AO脱氮(Ⅱ阶段)和好氧除碳(Ⅲ阶段)3种具有不同污染物去除功能的系统, 通过分析优势菌群演替规律及代谢产物的相关变化, 以期解释不同的运行方式下污泥沉降性能产生差异的原因.

反应器有效容积为9 L(图 1).整个实验阶段, 系统的pH值控制在6.5~8.5.好氧区溶氧控制为2~3 mg ·L^-1.有机负荷控制(以COD/SS计)在0.30~0.35 kg ·(kg ·d)^-1.反应器温度通过水浴保持在20~25℃. MLSS为3000~3500 mg ·L^-1.回流污泥和进水的流量由蠕动泵控制, 污泥回流比为75%~100%, 进水流量为24 L ·d^-1, 水力停留时间为9 h.污泥龄通过每天从好氧池的末端排出剩余污泥来控制, Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ阶段SRT分别为12~14、18~20、8~10 d.不同阶段反应器的运行方式通过移动格室内的挡板、回流及曝气装置等进行调整.

图 1

Fig. 1

图 1 反应器装置示意 Fig. 1 Schematic of reactor unit

反应器的进水采用模拟废水, 其中碳、氮和磷源分别为CH₃COONa(COD为380~420 mg ·L^-1)、NH₄Cl(TN为20~40 mg ·L^-1)和KH₂PO₄(TP为5~10 mg ·L^-1).矿物质和微量元素的组分为: MgSO₄ ·7H₂O 44 mg ·L^-1; CaCl₂ 26 mg ·L^-1; NaHCO₃ 25 mg ·L^-1; FeSO₄ ·7H₂O 10 mg ·L^-1; KI 60 μg ·L^-1; H₃BO₃ 60 μg ·L^-1; MnSO₄ ·H₂O 300 μg ·L^-1; CoCl₂ ·6H₂O 49.45 μg ·L^-1; (NH₄)₆Mo₇O₂₄ ·4H₂O 105.34 μg ·L^-1; CuSO₄ ·5H₂O 702.99 μg ·L^-1; ZnSO₄ ·7H₂O 379.78 μg ·L^-1.接种污泥取自西安市第四污水处理厂(AAO工艺)曝气池.

污泥特性分析: MLSS和SVI采用标准方法测定^[10]; 活性污泥形态及丝状菌镜检均采用尼康50i显微镜进行.

菌群结构:采用细菌16S rDNA高通量测序技术分析微生物菌群结构.首先参照OMEGA试剂盒E. Z. N. A^TM Mag-Bind Soil DNA Kit的试剂盒使用说明提取DNA, 利用细菌V3-V4区通用引物341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG)和805(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC)对提取的合格DNA样品进行PCR扩增.之后采用Illumina MiSeq测序平台对采集的样品进行测序, 得到的原始数据采用FASTQ格式保存然后进一步分析处理, 对优质序列进行OTU(operational taxonomic units)的聚类和注释, 基于此结果进行多样性指数分析和群落结构的统计分析. 4个污泥样品取自反应器运行的第1、47、89及126 d, 分别代表接种污泥和3个阶段的稳定运行期污泥样.取样位置均为反应器好氧池末端, 样品编号依次为1~4.

胞外聚合物(EPS): EPS的提取采用超声-阳离子树脂交换法, 将其分为疏松型EPS(loosely bound EPS, LB-EPS)和紧密型EPS(tightly bound EPS, TB-EPS).具体方法:于反应器的好氧池末端取30 mL的污泥混合物置于离心管中, 10000 r ·min^-1、4℃的条件下离心5 min, 弃去上清液, 加入等体积的PBS, 该步骤重复3次以去除污泥中的杂质.放入冰水中进行超声细胞分散(功率5 W, 超声3 s, 间隔3 s, 工作75次).之后10000 r ·min^-1、4℃的条件下离心5 min, 抽滤的上清液即为LB-EPS.剩余的污泥中再次加入等体积的PBS摇匀置于锥形瓶中, 同时加入一定量的阳离子交换树脂(以VSS计, 75 g ·g^-1), 放入恒温振荡器, 150 r ·min^-1、4℃振荡4 h.随后将其转入离心管中, 4℃下10000 r ·min^-1离心25 min, 将其上清液经0.45 μm的滤膜过滤收集得TB-EPS, 总EPS以两者之和计.多糖和蛋白质分别采用蒽酮和福林酚比色法测定.本实验中9个污泥样品分别取自系统运行的第12、30、42、55、62、86、98、106和125 d, 分别代表 3个阶段系统运行的初期、中期和末期.

图 2为系统不同阶段SVI和MLSS的变化情况, 图 3为活性污泥第1、47、89、126 d形态镜检.接种污泥SVI约为150 mL ·g^-1, 絮体较小, 呈分散状分布, 菌体周围大量存在长度较短的丝状菌[图 3(a)].由图 2看出, Ⅰ阶段(0~46 d)运行初期污泥沉降性能发生短暂恶化, 这是由于接种污泥采用模拟废水培养时, 水质条件的变化导致系统菌群产生波动, 丝状菌对环境变化的适应程度优于菌胶团^[11].随着系统持续运行, 菌胶团成团块状聚集[图 3(b)], 沉降性能逐渐改善, 最终SVI稳定在46 mL ·g^-1左右.系统转入Ⅱ阶段(46~90 d)后, 在62 d时系统SVI迅速升至168 mL ·g^-1, 污泥沉降性能逐渐变差, 最终稳定于198mL ·g^-1左右.此时污泥絮体结构松散且密实度下降, 少量丝状菌从菌胶团中呈束状突出生长, 菌丝为长直形[图 3(c)]. Ⅲ阶段(90~128 d)污泥沉降性能略有好转, 推流式反应器中沿程的基质浓度梯度有利于菌胶团的优势生长, 絮体之间的聚结状态致使部分丝状菌被包裹, 丝状菌的数量有所减少[图 3(d)], 第106 d时SVI为95 mL ·g^-1.

图 2

Fig. 2

图 2 不同阶段污泥MLSS和SVI变化情况 Fig. 2 Variations of MLSS and SVI during different processes

图 3

Fig. 3

图 3 不同阶段活性污泥形态镜检(×100) Fig. 3 Morphologies observed results during different process (×100)

单样品的多样性分析(α多样性)可以反映微生物群落的丰度和多样性, 基于相似度水平的差异, 对各样品的所有序列进行OTU划分, 在97%的相似水平下进行生物信息统计分析.通常采用Shannon和Simpson这两个多样性指数来体现α的多样性.由表 1可以看出, 接种污泥的微生物多样性较高, 这是由于实际污水处理厂进水环境复杂, 水质条件多样, 营养物质的种类丰富, 多方位满足了各类微生物的生长所需.而在实验室采用模拟生活配水, 进水组分单一, 营养物质结构简单, 导致微生物种群多样性相对较低.对比3种不同的污染物去除系统, Ⅰ阶段微生物种群多样性最高, 其次为Ⅱ、Ⅲ阶段. Zhao等^[12]的研究发现, 反应器的运行状态及环境条件对微生物的多样性具有影响.缺氧区和厌氧区的引入导致系统功能与环境的复杂度增加, 功能微生物相继增多, 因此系统中的微生物群落多样性丰富^[13].

表 1 (Table 1)

表 1 污泥样品α多样性 Table 1 The α diversity of the samples 样品编号 序列条数 OTU数 Shannon指数 ACE指数 盖度 Simpson指数 1 44770 2793 6.45 3170.46 0.99 0.005 2 41017 2547 5.95 3522.42 0.98 0.009 3 35307 2107 4.60 4328.24 0.97 0.050 4 39199 2078 4.25 3912.13 0.98 0.090

表 1 污泥样品α多样性 Table 1 The α diversity of the samples

为了更加清楚地了解和识别微生物, 通常将微生物有次序地进行分门别类为:界、门、纲、目、科、属、种^[14], 在本研究主要从属水平探讨菌群结构的演替规律. 图 4为不同阶段属水平细菌群落结构分布.从中可以看出, 不同的污染物去除系统中, 微生物属水平的分布存在较大差异.测序结果总共约400个菌属, 其中丰度小于1%的计为others.随系统功能的改变, 优势菌Azospira(固氮螺旋菌属)的丰度发生显著变化, 接种污泥中仅含有0.16%, Ⅰ阶段上升至24.1%, Ⅱ阶段为21.37%, Ⅲ阶段降至9.6%.该菌属于反硝化菌属, 丰度的变化规律与系统的功能改变完全吻合.同时Thiothrix(丝硫菌)的丰度在接种污泥和Ⅰ阶段时仅为0.08%和1.51%, 却在Ⅱ阶段达9.41%, Ⅲ阶段时降至4.29%, 丰度变化与系统的沉降性能完全一致. Thiothrix是典型的丝状菌属, 属于γ-变形菌亚门, 菌丝呈长直或弧形状, 从菌胶团中突出生长, 在其生长过程中能够进行良好的脱氮除硫功能^[15].通过本研究可以看出, 以乙酸钠为进水时, 具有厌氧区的AAO系统对该菌的生长具有选择抑制作用, 而含有缺氧的AO系统却刺激了该菌的优势竞争.相比Ⅰ阶段而言, 在Ⅱ阶段中具有反硝化功能的Azospira丰度下降, 此时系统整体的脱氮效率未有影响, 这可能与系统Thiothrix的脱氮功能有关. Ohtaekwangia菌以易降解有机物为底物, 属于严格的好氧菌^[16], 在系统具有厌氧、缺氧区时, 含量为0.01%~8.67%, 丰度较小, 而在Ⅲ阶段稳定期丰度高达17.87%, 单纯的好氧区环境有利于该菌的生长繁殖.除此之外, Azonexus菌在接种污泥和系统的I和Ⅲ阶段含量较小, 而在Ⅱ阶段时丰度却为5.72%. Azonexus属于变形菌门, 能够将NO₃^-还原完成脱氮功能^[17].通过本研究可以看出, 接种污泥和阶段I的AAO系统的中缺氧和好氧交替的脱氮环境并不利于该菌的生长.同时, 据图 4的进一步分析可以看出, Kofleria菌也是Ⅲ阶段系统中的优势菌种, 所占丰度达15.85%.该菌属于一种典型的黏细菌, 其生长繁殖受季节周期性的变化较为明显, 通常在春季(3~5月)和秋季(9~11月)较多, 而夏季和冬季则减少^[18].虽在实验中持续保持了较好的水温环境, 但明显可以看出Ⅲ阶段运行时的秋季环境依然诱发了该菌的大量生长.

图 4

Fig. 4

图 4 样品中属水平细菌群落结构分布 Fig. 4 Genus level depiction of bacterial communities

图 5为3阶段不同时期EPS各组分含量变化情况.通常EPS主要由多糖(PS)和蛋白质(PN)组成, PS带负电荷, PN带正电荷, 两者共同决定EPS的Zeta电位.从中可知, 不同污染物去除系统中, LB-EPS、TB-EPS的主要成分均为PN, 占EPS总含量的60%~90%.不同的运行系统中, 随微生物群落结构的变化, 代谢产物含量有所不同.为了分析污泥沉降性能与胞外聚合物组分之间的关系, 采用SPSS软件进行统计Spearman等级相关性的分析时发现, 污泥沉降性能与LB-EPS中PN/PS比值呈现显著的正相关性(r=0.767, P < 0.05), 而与TB-EPS之间的相关性较弱(r=0.159, P < 0.05).这是由于TB位于细胞内侧, 与细胞表面紧密结合, 对活性污泥的絮凝作用及沉降性能影响甚微.而LB位于TB的外侧, 对活性污泥的表面特性影响较大. Zhao等^[19]的研究发现, 相比TB-EPS而言, LB-EPS能够加强细胞间的聚集性. 图 6为3阶段不同时期Zeta电位变化情况.从中可知, 随Zeta电位的下降, 污泥沉降性能逐渐改善, 反之亦然.这是由于蛋白质带有正电荷, 可以中和羟基与磷酸基团等带有的负电荷, 进而压缩双电层降低表面电位^[20]. Zeta电位的降低使得污泥絮体间的静电斥力有所减少, 有利于污泥之间的凝聚作用.

图 5

Fig. 5

图 5 污泥沉降性能与EPS各组分含量变化情况 Fig. 5 Sludge settleability and EPS components of changes

图 6

Fig. 6

图 6 污泥沉降性能与Zeta电位变化情况 Fig. 6 Sludge settleability and Zeta potential of changes

三维荧光光谱技术主要针对有机物中含有的荧光基团(芳香结构和不饱和链), 根据不同物质的荧光反应测定相关物质的成分, 同时间接表示物质的相对含量等^[21]. 图 7为不同功能系统中稳定期EPS的LB、TB三维荧光光谱特性对比分析, 其中Peak A: E_x/E_m=220~240/280~350nm(酪氨酸/色氨酸区), Peak B: E_x/E_m=220~290/280~360 nm(酪氨酸/色氨酸蛋白区), Peak C: E_x/E_m=260~290/420~460 nm(聚芳环类腐殖酸区), Peak D: E_x/E_m=330~370/420~460 nm(聚羧酸类腐殖酸区)^[22].据图 7可以看出, 不同功能系统运行的稳定期LB、TB的化学物质组成截然不同, LB中除蛋白质类物质外还有少量的腐殖酸.根据荧光强度发现内层的EPS具有更高的物质浓度, 这与之前的组分含量测定结果一致.同时, Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ阶段的稳定运行期, TB中荧光物质荧光强度基本稳定于2000~3000AU之间, 浓度变化较小.而不同系统LB的物质浓度存在显著差异, Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ阶段LB的Peak A、Peak B荧光强度分别为(2705 AU、2092 AU), (581.3 AU、432.4 AU), (1349 AU、848.7 AU).

图 7

Fig. 7

图 7 不同阶段稳定运行期EPS中LB、TB三维荧光特性对比 Fig. 7 Comparisons of three-dimensional fluorescence characteristics of LB-EPS and TB-EPS under stable conditions

李志华等^[23]的研究认为, 活性污泥系统中代谢产物的荧光特性与污泥沉降性能之间存在一定的内在联系, 活性污泥沉降性能良好时会产生大量的代谢产物; 而沉降性能较差时, 微生物代谢产生的荧光物质强度则相对较弱.在3个阶段稳定期的沉降性能对比中发现, Ⅰ阶段最佳、其次为Ⅲ、Ⅱ阶段, 这与该时期的荧光峰荧光强度吻合良好.同时根据荧光峰在激发、发射波长所出现的位置, 可以判断该荧光峰发生了蓝移或红移.据图 7分析, Ⅱ阶段时LB中峰A、B均发生了蓝移, 表明在该阶段某些官能团产生了消失, 例如羰基、羟基或链结构中的共轭键减少等^[24].而在Ⅲ阶段LB中峰A、B均发生了红移, 说明EPS中的某些官能团有所增加, 例如氨基、羧基等.通过荧光峰位置的转移进一步发现在这3种不同的营养物去除系统中, 菌群结构的演替导致微生物代谢产物有所差异, LB-EPS所带官能团发生改变, 化学结构显著不同.

由于工艺的实现, 不仅是运行反应器中需要形成特定的环境, 而且还需要水质可以满足与该工艺应有的功能相适应的功能性微生物的生长.因此, 在实验期间, 为了满足单一的碳氧化菌、硝化菌和反硝化菌以及除磷菌的生长需求, 保持碳源不变, 根据不同工艺的功能特点对进水氮、磷负荷进行了适当的调整, 以配合各工艺特点所需要的水质.

研究发现, 从接种污泥到Ⅰ阶段稳定期的运行过程中, Thiothrix的丰度变化从0.08%上升至1.51%, 然而污泥的沉降性能却发生了显著下降. Hesham等^[25]探究了AAO系统在两种不同运行模式中活性污泥菌群结构的差异, 通过移动窗口的相关分析发现, 污泥沉降性能均与Microthrix parvicella和Nostocoida limicola Ⅰ的生长繁殖相关. Knoop等^[26]的研究发现, 在实际的营养盐去除系统中易于导致微丝菌的生长繁殖引发污泥沉降性能恶化, 这一现象大多发生在秋末和冬季的低温环境.而在本实验过程中控制水温始终为20~25℃, 因而并未出现微丝菌的大量繁殖.但通过EPS组分的测定发现, 在此过程中微生物代谢分泌的LB-EPS中PN/PS的比值却逐渐上升.由于LB-EPS包裹在污泥的外表面, PN/PS的比值变化可直接影响污泥的表面特性.同时PN具有较强的疏水性, 随含量的增加有助于减少污泥絮体与水分子之间的结合作用, 进而促进污泥表面的絮凝性能, 絮体之间聚集形成菌胶团, 密实度逐渐增加.

系统转入Ⅱ阶段时, Thiothrix的丰度逐渐增加至9.41%, 此时污泥沉降性能变差. Guo等^[27]的研究表明, 脱氮系统中常见的优势丝状菌为Type0041、Type0675和Type1851.然而, 在本实验中并未发现此类丝状菌的生长, 这可能与不同的进水基质相关, Thiothrix适宜生长在进水含有大量高浓度低分子碳水化合物或还原性硫化物的环境中, 以乙酸钠为进水碳源时容易诱导Thiothrix的大量增殖^[15].此时的三维荧光特性分析看出, 相比Ⅰ阶段而言, LB-EPS所带官能团发生改变, 化学结构有所不同.同时, LB-EPS中PN/PS的比值逐渐下降, 由于PS含量的增加, 其较强的亲水作用使得污泥絮体间形成一种类似流体通道的结构, 进而导致污泥的密实度也显著下降, 污泥沉降性能变差.王杰等^[28]探究缺氧/好氧体积比对活性污泥沉降性能影响时发现, 不同的系统模式下优势丝状菌的种类发生显著改变, 进而导致污泥的沉降性能有所差异.同时测定系统不同时期的EPS分泌情况表明, EPS中PN/PS的比值也与污泥沉降性能呈正相关.

系统转入Ⅲ阶段时, Thiothrix的丰度下降至4.29%, 单纯的好氧环境似乎不利于该菌的生长繁殖, 此时的污泥沉降性能逐步改善.通过EPS组分的测定发现, 在此过程中微生物代谢分泌的LB-EPS中PN/PS的比值逐渐上升.夏志红等^[29]研究了自养菌和异养菌胞外聚合物与污泥絮体的关系, 表明异养活性污泥的絮体形态依赖于TB-EPS的作用.然而王红武等^[30]的研究却发现, 以异养菌为主的活性污泥中LB-EPS越多, 污泥的絮凝和沉降性能变差, 但TB-EPS对此基本无影响.通常由于反应器的运行状态、微生物组成以及环境条件的改变均有可能导致代谢产物的微观变化, 不同体系中的结论有所差异, 这可能还与该系统特定的生物相有关.

由于废水组成、运行条件及环境因素等的不同, 致使不同的污水处理厂引起沉降性能改变的优势丝状菌有所不同.但目前的研究认为活性污泥絮体的形成是一种生物过程, 胞外聚合物在此期间同样发挥重要作用.本研究的结果显示, 在不同的生物处理系统中, 丝状菌的生长繁殖是影响污泥沉降性能的主导细菌, 同时胞外代谢产物的相关变化加剧了污泥沉降性能改善或恶化的进程.因此, 以微生物为主体的运行工艺, 污泥沉降性能与优势丝状菌的变化及胞外聚合物的分泌情况均相关.

(1) 以乙酸钠为碳源, 不同的运行条件下活性污泥沉降性能有所差异, AAO脱氮除磷(Ⅰ阶段)沉降性能最佳、其次为好氧除碳(Ⅲ阶段)、AO脱氮(Ⅱ阶段).

(2) 3种不同的污染物去除系统中, Ⅰ阶段微生物种群多样性最高, 其次为Ⅱ、Ⅲ阶段.缺氧区和厌氧区的引入导致系统功能与环境的复杂度增加, 微生物群落多样性有所升高.

(3) 不同的运行条件下, 系统优势菌群显著不同, Thiothrix 的丰度变化是影响污泥沉降性能变化的主导细菌. Ⅰ阶段的厌氧区对该菌生长具有抑制作用, 而Ⅱ阶段的缺氧区却刺激了其优势生长.

(4) 微生物群落结构变化对EPS的组分有显著影响, 进而加剧了污泥沉降性能改善或恶化的进程, 污泥沉降性能与LB-EPS中PN/PS比值呈正相关.