厌氧氨氧化是目前公认最为经济的生物脱氮技术^{[1, 2]}, 短程硝化作为其前置工艺, 一直是国内外学者研究的对象^{[3, 4]}.实现短程硝化的关键是富集氨氧化细菌(AOB), 抑制亚硝酸盐氧化细菌(NOB), 而AOB生长速率缓慢、自固定能力弱和对外界环境敏感^[5], 增大了短程硝化快速启动的难度.众多学者针对此难题进行了大量的研究, 结果表明采用高温、高FA、低DO、间歇曝气和实时控制^[6~8]等方法均可启动短程硝化, 但关于接种不同泥源启动短程硝化的研究鲜有报道.而且多数研究都是从启动时间、亚硝化率等宏观角度分析短程硝化启动性能的优劣, 对于启动前后微生物群落结构的变化特征研究较少, 因此将宏观与微观结合起来考察不同泥源条件下短程硝化启动性能差异显得十分必要.

高通量测序技术作为新型微生物种群鉴定技术, 具有分析结果准确、高速、高灵敏度和高自动化等特点, 在环境微生物鉴定领域应用广泛^{[9, 10]}.同时, 该技术也越来越多地被应用于短程硝化工艺的微生物群落结构检测中^[11], 有助于短程硝化工艺的进一步调控与实施.膜生物反应器(MBR)较之传统生物反应器具有占地面积小、容积负荷高和剩余污泥量低等优势^[12], 且膜过滤出水的运行方式可实现系统污泥的高效截留, 有利于富集生长缓慢的AOB, 减少短程硝化的启动时间.本研究选用MBR反应器, 分别接种硝化污泥、厌氧亚硝化污泥和1 :1混合接种厌氧亚硝化污泥和反硝化污泥, 考察不同接种污泥的短程硝化启动特征及启动前后菌群结构变化, 以期为快速启动短程硝化反应器的污泥源选择提供依据.

本实验采用的MBR(图 1)反应器由有机玻璃制成, 长10 cm, 宽8 cm, 有效高度24 cm, 有效容积为1.9 L. MBR采用中空纤维微滤膜组件, 膜孔径0.1 μm, 膜面积为0.2 m².反应器由蠕动泵连续进水, 经膜组件抽吸连续出水.反应器底部采用曝气砂头供氧, DO控制为0.6~1.0 mg ·L^-1, 通过定时插座控制停曝时间.整个运行过程中, 反应器放置于水浴缸中, 保持运行温度在(30±1)℃.

图 1

Fig. 1

图 1 MBR反应器装置示意 Fig. 1 Schematic of membrane bio-reactor

本实验采用3种污泥, 反应器1(R1):取自苏州市某污水厂A²/O工艺的好氧硝化污泥; 反应器2(R2):取自实验室长期放置1 a以上的厌氧亚硝化污泥; 反应器3(R3): 1 :1混合接种上述的厌氧亚硝化污泥和反硝化污泥, 反硝化污泥取自苏州市某污水厂A²/O工艺的缺氧池.初期接种污泥性质如表 1所示.

表 1 (Table 1)

表 1 接种污泥性质 Table 1 Characteristics of inoculum 反应器 R1 R2 R3 SVI/mL·g-1 62 69 73 MLSS/g·L-1 3.5 3.5 3.5 MLVSS/g·L-1 2.1 2.7 2.3 MLVSS/MLSS/% 60 77 66

表 1 接种污泥性质 Table 1 Characteristics of inoculum

反应器实验进水相同, 均采用人工配水.以乙酸钠作为有机碳源, 氯化铵作为氮源, 磷酸二氢钾作为磷源, 碳酸氢钠提供碱度, 调节进水COD、NH₄⁺-N、TP浓度和pH值, 并添加硫酸镁、氯化钙等生物所需营养元素及其他微量元素, 具体含量见表 2.整个实验运行过程中, 3个反应器pH值均控制在7.5~8.0.反应器的具体运行条件见表 3.

表 2 (Table 2)

表 2 人工配水的水质特征 Table 2 Characteristics of synthetic wastewater 组分 质量浓度/mg·L-1 组分 质量浓度/mg·L-1 COD 140~160 CoCl2·6H2O 0.15 NH4+-N 140~160 MnCl2·4H2O 0.12 TP 4~6 ZnSO4·7H2O 0.12 MgSO4 10 NaMoO4·2H2O 0.06 CaCl2 10 CuSO4·5H2O 0.03 FeCl3·6H2O 1.5 KI 0.03 H3BO3 0.1 NaHCO3 根据实际情况添加

表 2 人工配水的水质特征 Table 2 Characteristics of synthetic wastewater

表 3 (Table 3)

表 3 反应器具体运行情况 Table 3 Stable operation of reactors 阶段 HRT/h 缺氧/好氧比 进水氨氮平均负荷/kg·(m3·d)-1 Ⅰ 5 0:1 0.72 Ⅱ 5 1:3 0.72 Ⅲ 4 1:3 0.90 Ⅳ 3 1:3 1.20

表 3 反应器具体运行情况 Table 3 Stable operation of reactors

实验过程中每隔1 d取水样测定, 测定项目主要包括^[13], NH₄⁺-N:纳氏试剂分光光度法; NO₂^--N: N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法; NO₃^--N:紫外分光光度法; COD:密闭消解-分光光度法; MLSS、MLVSS:标准重量法; SVI: 30 min沉降法; pH: pHS-9V数显酸度计; 溶解氧: YSI550A溶氧仪.

样品采集:为研究不同泥源短程硝化启动前后微生物群落结构的差异, 分别将R1、R2和R3反应器的接种污泥和启动成功稳定运行第56 d的污泥采集送样, 污泥样品对应编号为A0、B0、C0和A1、B1、C1.

总DNA的提取与PCR扩增:采用FastPrep DNA提取试剂盒法(QBIOGENE, USA)DNA, 完成基因组DNA抽提, 并利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA. PCR扩增测序区域为338F_806R, 扩增引物采用16S rRNA基因V3-V4区通用引物(338F/806R).引物名称和引物序列分别是338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT). PCR正式实验采用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase, 20μL反应体系.全部样本按照正式实验条件进行, 每个样本3个重复, 将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测, 使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物, Tris_HCl洗脱; 2%琼脂糖电泳检测.参照电泳初步定量结果, 将PCR产物用QuantiFluor^TM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量, 之后按照每个样本的测序量要求, 进行相应比例的混合.

MiSeq文库构建与测序: ①MiSeq文库构建, 通过PCR将Illumina官方接头序列添加至目标区域外端并回收PCR产物; Tris-HCl缓冲液洗脱, 2%琼脂糖电泳检测; 氢氧化钠变性, 产生单链DNA片段. ②MiSeq测序, 按照高通量测序平台的操作说明对形成的cDNA文库进行MiSeq高通量测序, 将测序得到的DNA序列进行拼接, 同时进行质量控制, 对区分样品后得到的有效数据进行操作分类单元(OUT)分类.

生物多样性和分类学分析:将序列按照彼此的相似性归为操作分类单元(OTU), 按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类, 在聚类过程中去除嵌合体, 得到OTU的代表序列.为了得到每个OTU对应的物种分类信息, 采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析, 并分别在各个分类水平: domain(域)、kingdom(界)、phylum(门)、class(纲)、order(目)、family(科)、genus(属)、species(种)统计各样本的群落组成.通过单样本的多样性(α多样性)分析反映微生物群落的丰度和多样性.

3个反应器控制进水NH₄⁺-N和COD负荷在0.72~1.20 kg ·(m³ ·d)^-1, pH为7.5~8.0, DO浓度为0.6~1.0 mg ·L^-1, 采用间歇曝气和逐步缩短HRT的运行方式, 历经56 d均获得了稳定的短程硝化.本实验以亚硝累积率连续7 d稳定在85%以上作为短程硝化启动成功的标志, R1、R2和R3分别运行46、8和30 d实现短程硝化.启动期间各反应器进出水水质、氨氮去除率和亚硝累积率变化情况如图 2所示, 整个运行过程分为4个阶段.

图 2

Fig. 2

图 2 短程硝化启动过程中反应器性能 Fig. 2 Reactor performances during start-up of the shortcut nitrification process

阶段Ⅰ采用连续曝气的方式, 逐步活化、增强AOB的活性, 3个反应器内的氨氮去除率均逐步增加到95%以上.此阶段内, R1、R2和R3反应器各自耗时16、10和12 d, 这与接种污泥中所含AOB数量密切相关.运行至该阶段末期, R1和R3反应器内NO₃^--N浓度均呈现上升趋势, 这是因为随着出水NH₄⁺-N浓度的减少, 游离氨对NOB的抑制作用减弱, 使NO₂^--N较多的转化为NO₃^--N.值得一提的是, R2反应器出水NO₃^--N浓度稳定在13 mg ·L^-1左右, 亚硝累积率平均达90%, 成功启动了短程硝化.分析表明:一方面MBR反应器的截留作用有效避免了AOB的流失, 稳定的膜环境十分利于AOB的富集增殖; 另一方面接种的厌氧亚硝化污泥中, 含有较高数量级的AOB和较低数量级的NOB细菌, 加之外界环境的有效调控, 即高温、低DO和适宜的pH条件下成功抑制NOB, 快速实现短程硝化.

阶段Ⅱ在保持HRT不变的条件下, 采用缺氧/好氧比1 :3(15 min :45 min)间歇曝气的运行方式. R1和R3反应器内NO₃^--N浓度整体呈下降趋势, 说明缺氧/好氧交替的运行方式有效抑制了硝态氮的产生, 有利于短程硝化的实现^[14].这是由于在缺氧环境下AOB的活性受到抑制, 氨氧化过程受阻, 而一旦恢复曝气, 经历长期“饥饿”的AOB可以更多地利用氨产能, 使其自身大量增殖, 此即AOB的“饱食饥饿”特性, 而NOB不具有此种特性^[15]. R2反应器出水NO₃^--N浓度呈现出先下降后上升的趋势, 最高达到21 mg ·L^-1, 相应地亚硝累积率降至85%.分析前期NO₃^--N的下降与缺氧/好氧交替运行方式有关, 后期NO₃^--N的上升是因为一方面随着反应器内AOB富集程度越来越高, 进水NH₄⁺-N基质不能满足AOB的生长, AOB活性受到抑制; 另一方面HRT过长, 反应器内存在的NOB导致积累的NO₂^--N进一步氧化成NO₃^--N.

阶段Ⅲ和阶段Ⅳ分别在保持缺氧/好氧比1 :3(15 min :45 min)不变的条件下, 缩短HRT至4 h和3 h.随着HRT的缩短, R1、R2和R3反应器Ⅲ、Ⅳ阶段的氨氮去除率均值分别降至87%、93%、91%和85%、91%、88%.表明随着HRT的缩短, 氨氮去除率逐渐降低.阶段Ⅳ稳定运行期间, R1、R2和R3反应器氨氮平均去除负荷分别为1.04、1.10和1.07 kg ·(m³ ·d)^-1, R2反应器表现出较高的氨氮去除负荷, 说明R2反应器内AOB活性较好.同时, R1、R2和R3反应器出水NO₃^--N均值分别为9、9和7 mg ·L^-1, 亚硝累积率平均为92%、93%和94%, 表明3个反应器均成功启动短程硝化, 且R3反应器表现出更稳定的短程硝化.

利用MiSeq高通量测序平台对R1、R2和R3反应器的接种污泥和启动成功稳定运行第56 d的污泥进行测序, 通过单样本的多样性分析(α多样性)反映微生物群落的丰度和多样性, 具体情况如表 4所示.此次测序的6个样品的覆盖度均大于99%, 表明本次测序结果能够代表样本中微生物的真实情况. ACE和Chao指数可以估算群落中含OTU数目的指数, 表征微生物种群的丰富度, 在生态学中常用来估计物种总数, 其值越大表明物种总数越多^[16].由表 4可知, 3个反应器接种污泥的ACE、Chao指数表现为A0>C0>B0, 说明R1反应器内微生物种群的丰度最高, R3反应器其次, R2反应器最少.分析R1反应器接种的污水厂A²/O好氧硝化污泥, 具有一定的脱氮除碳功能, 微生物种群的丰富度相对较高; 而R2反应器接种的实验室放置1 a以上的厌氧亚硝化污泥, 经过长期的内源呼吸和厌氧消化作用, 微生物种群的丰度下降; R3反应器1 :1混合接种厌氧亚硝化污泥和反硝化污泥, 微生物种群的丰度较之两者适中.此外, R1、R2和R3反应器启动成功后, ACE和Chao指数均下降, 表明物种总数减少, 其降幅分别为45.4%、30%、36%和45.3%、28.5%、38.3%, 且上述两个指数的变化规律与OTU数变化一致. Shannon和Simpson指数是用来估算样本中微生物的多样性, Shannon值越大, 说明微生物种群多样性越高, Simpson指数值越大, 说明微生物种群多样性越低, 同时也说明优势微生物占总生物量的比例越大^[17]. 表 4显示, R1、R2和R3反应器中Shannon指数的变化趋势与ACE、Chao指数变化趋势一致, 均呈现下降趋势.且R1和R2反应器降幅较大, 分别为42.3%和16.1%, R3反应器降幅仅为5.1%.相应地, R1和R2反应器Simpson指数增幅较大, R3反应器Simpson指数保持不变.表明R1和R2反应器在短程硝化启动前后微生物种群多样性明显降低, 而R3反应器内微生物多样性变化不大.短程硝化的启动过程实质上是氨氧化细菌的富集, 劣势菌种的淘汰.在这个过程中, 随着系统内优势微生物占比逐渐增大, 通常会使得微生物种群多样性降低.从这方面来看, R1和R2反应器短程硝化启动前后的微生物群落结构变化符合这一趋势.相比于R2反应器, R3反应器启动时间略长但亚硝化稳定性能较强, 这可能与反应器内微生物群落的多样性有关.通常认为^[18]多样性影响群落对胁迫的响应, 研究表明^[19]群落的多样性越高, 则可能包含越多适应某胁迫的互补性单元, 从而使得在经受胁迫后群落的快速修复能力越强, 提高群落的恢复力, 确保群落的稳定性.

表 4 (Table 4)

表 4 MBR反应器微生物丰度和多样性情况 Table 4 Species abundance and diversity for microbial communities in the MBR 样品 序列数 OTU数 ACE指数 Chao指数 Shannon指数 Simpson指数 覆盖度/% A0 35585 663 694 698 5.340 0.012 99.81 A1 39961 333 379 382 3.082 0.082 99.84 B0 30265 359 410 403 4.026 0.039 99.78 B1 36962 254 287 288 3.378 0.071 99.87 C0 34670 576 677 687 3.896 0.060 99.56 C1 32746 335 433 424 3.697 0.060 99.70

表 4 MBR反应器微生物丰度和多样性情况 Table 4 Species abundance and diversity for microbial communities in the MBR

图 3为6个样本在门水平下微生物群落结构的分布情况, 从中可以看出, 主要包括变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和酸杆菌门(Acidobacteria)等, 并以变形菌门和拟杆菌门为主, 所占比例分别可达20.6%~58.9%和3.9%~35%.此外, 6个样本还检测到浮霉菌门(Planctomycetes)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae), 所占比例相对较小.

图 3

Fig. 3

图 3 MBR反应器在门水平下微生物群落结构 Fig. 3 Microbial community structure at a phylum level in the MBR

在启动成功的3个反应器污泥样品中均检测到较少比例的浮霉菌门, 浮霉菌门是一类重要的环境微生物, 对于全球氮循环具有重要意义.赵志瑞^[20]等认为在低氨氮和低溶解氧条件下会导致浮霉菌门的出现, 可能是因为随着氨氮浓度和DO的降低, 污泥停留时间增加, 污泥群落发生改变^[21].本实验采用的膜生物反应器存在DO浓度梯度, 导致好氧、缺氧和厌氧共存在一个系统内, 加之间歇曝气的运行方式, 停曝条件下为缺氧状态, 为该细菌的生长提供了有利条件.另外, 硝化螺旋菌门包含硝化螺菌属(Nitrospira), Nitrospira是绝大多数已有报道中在生物脱氮过程中占主导地位的亚硝酸盐氧化菌(NOB)^{[22, 23]}.

为了进一步探究MBR反应器接种不同泥源短程硝化启动前后脱氮微生物所在的变形菌门分布特征的变化, 对6个样品在纲分类水平下变形菌门的群落结构进行分析, 结果见表 5.从中可知, R1和R2反应器接种污泥中α-变形菌纲(α-Proteobacteria)是变形菌门丰度最大的菌群, 分别占59.4%和43.7%.而R3反应器接种污泥中变形菌门丰度最大的菌群是β-变形菌纲(β-Proteobacteria), 所占比例达41%, 大于R1、R2反应器接种污泥的11.7%和38.2%. β-变形菌纲几乎囊括了所有类型的AOB, 故接种污泥中存在较大比例的β-变形菌纲更有利于短程硝化的实现.其次, 3个反应器短程硝化启动成功的样品中β-变形菌纲是系统的优势菌群, 这与钱飞跃等^[24]的研究相吻合.同时对比接种污泥, R1、R2和R3反应器启动成功的活性污泥中γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)均呈降低趋势, 分别为4.6%、4.9%和12%.

表 5 (Table 5)

表 5 MBR反应器中变形菌门(纲水平)的群落组成相对百分比/% Table 5 Class-level percentages of Proteobacteria microbial communities in the MBR/% 项目 A0 A1 B0 B1 C0 C1 β-Proteobacteria 11.7 59.6 38.2 63.6 41.0 69.3 γ-Proteobacteria 22.3 4.6 12.5 4.9 17.4 12.0 δ-Proteobacteria 6.6 9.2 5.6 6.7 4.2 9.5 α-Proteobacteria 59.4 26.6 43.7 24.8 37.4 9.2

表 5 MBR反应器中变形菌门(纲水平)的群落组成相对百分比/% Table 5 Class-level percentages of Proteobacteria microbial communities in the MBR/%

为进一步阐明MBR反应器接种不同泥源在短程硝化启动前后微生物种群分布的变化情况, 对属水平下6个样品的功能微生物及优势菌群进行分析.

如图 4所示, 在属分类水平上, 3个反应器接种污泥中占优势的菌群略有不同. R1反应器接种污泥中优势菌群主要为norank_p_Saccharibacteria和分支杆菌(Mycobacterium), 而R2和R3反应器主要为陶厄氏菌属(Thauera)和副球菌属(Paracoccus), 分别达到10.1%、21.7%和9.2%、20.4%.陶厄氏菌属和副球菌属均属于好氧反硝化细菌, 是以有机碳作为能源的异养菌.短程硝化启动成功后, R1、R2和R3反应器内的优势菌属均为亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas), 所占比例分别达12.8%、20.2%和19.7%. AOB主要属于亚硝化单胞菌属和亚硝化螺菌属(Nitrosospira), 系统中未检测到亚硝化螺菌属, 因此推断该系统中AOB属于亚硝化单胞菌属.这与大多数研究结果一致, 即污水处理系统中占优势的AOB多为亚硝化单胞菌属^[25].

图 4

Fig. 4

图 4 MBR反应器在属水平下微生物群落结构 Fig. 4 Microbial community structure at a genus level in the MBR

表 6是MBR反应器接种不同泥源在短程硝化启动前后脱氮菌属的分布特征, 从中可以看出, 3个反应器启动短程硝化后亚硝化单胞菌属均处于优势地位, 未检测出亚硝化螺菌属.侯爱月等^[26]的研究表明, 在有机短程硝化系统中的脱氮菌属主要为反硝化细菌和亚硝化单胞菌属, 未发现硝化螺菌属, 这与本实验结果相一致.分析表明, 在一定量的碳源条件下, AOB和NOB产生DO竞争机制, 且AOB对DO的亲和能力高于NOB, 使得AOB处于有利地位.加之本实验采用间歇曝气和缩短HRT的方式, 逐步抑制、淘洗反应器内的NOB.同时, 仅在R3反应器启动成功的样品中检测到少量的反硝化菌(Denitratisoma)和反硝化菌(Pseudomonas)属, 具体原因仍需进一步研究, 此处不予解释.此外, 对比接种污泥, R2和R3反应器内的陶厄氏菌属、副球菌属和热单胞菌属(Thermomonas)呈减少趋势.分析三者均为异养菌, 随着反应器内优势菌种亚硝化单胞菌属的富集, 劣势菌属丰度逐渐减少.值得一提的是, 刘燕^[27]等利用副球菌属进行脱氮特性研究, 发现以乙酸钠为碳源, 无论好氧或者厌氧条件都有亚硝酸盐的累积, 这是因为反硝化菌以乙酸钠为碳源, 以硝态氮为电子受体进行反硝化, 从而导致了亚硝酸盐的积累, 故笔者认为反应器内反硝化菌属的存在促进了短程硝化的实现.

表 6 (Table 6)

表 6 MBR反应器主要脱氮菌属(属水平)群落组成相对百分比1)/% Table 6 Relative abundance of the dominant denitrifying bacterial communities at a genus level in the MBR/% 脱氮功能 菌属 A0 A1 B0 B1 C0 C1 硝化 Nitrosomonas — 12.8 1.2 20.2 0.7 19.7 Nitrospira 4.1 — 0.4 — 0.1 — Thauera — 3.1 10.1 0.4 21.7 10 Paracoccus 0.1 0.1 9.2 1.5 20.4 0.5 反硝化 Thermomonas — — 1.2 0.2 0.8 0.1 Denitratisoma — — — — — 0.5 Pseudomonas — — — — — 0.3 1)“—”表示未检测出

表 6 MBR反应器主要脱氮菌属(属水平)群落组成相对百分比1)/% Table 6 Relative abundance of the dominant denitrifying bacterial communities at a genus level in the MBR/%

(1) R1、R2与R3反应器分别耗时46 d、8 d和30 d均成功启动短程硝化, R2反应器启动时间最短.稳定运行期内, R1、R2和R3反应器亚硝累积率均稳定在90%以上, 且R3反应器表现出更稳定的短程硝化性能.

(2) ACE、Chao、Shannon和Simpson指数结果表明, 对比接种污泥, 稳定运行期内, R1和R2反应器微生物丰度和多样性水平均大幅低于接种启动水平, R3反应器物种丰度略有减少而多样性水平变化不大.

(3) 稳定运行后, 3个反应器内的主要菌群为变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes), 且主要脱氮功能菌变形菌门丰度相较于接种污泥均有提高.其次, 3个反应器短程硝化启动成功后β-变形菌纲为系统的优势菌群.

(4) 短程硝化启动成功后, R1、R2和R3反应器内的优势菌属均为亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas), 所占比例分别达12.8%、20.2%和19.7%.相比R1反应器, R2和R3反应器接种污泥内存在一定比例的反硝化细菌, 更有利于系统短程硝化的实现.