2018, Vol. 39
2. 江苏省水处理技术与材料协同创新中心, 苏州 215009;
3. 江苏省环境科学与工程重点实验室, 苏州 215009
2. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Technology and Material of Water Treatment, Suzhou 215009, China;
3. Jiangsu Key Laboratory of Environmental Science and Engineering, Suzhou 215009, China
基于厌氧氨氧化代谢途径的自养脱氮工艺, 凭借工艺流程简短、无需外加有机碳源、曝气能耗低、污泥产量低等优势, 成为污水生物脱氮领域的研究热点[1~3].自养脱氮包含亚硝化和厌氧氨氧化两个过程, 亚硝化是利用参与硝化过程的亚硝化菌和硝化菌的生理特性不同, 将硝化过程稳定控制在亚硝酸盐阶段[4], 然而, 亚硝酸盐菌增值速率慢且难以维持较高生物浓度[5], 对环境变化敏感, 使得亚硝化的工业化推进受到影响.如何快速稳定启动亚硝化, 一直是国内外学者研究的重点[6].亚硝化的启动性能与反应器的类型息息相关, 目前, SBR反应器是国内外公认的快速启动亚硝化的理想反应器[7], 但在实际工程应用中连续流一般是环保工程师的首选工艺模式[8~10], 连续流完全混合反应器(CSTR)运行基建费用低, 操作简便, 结构简单, 可作为亚硝化的理想反应器[11~13].然而, 采用CSTR反应器启动亚硝化时间较长, 启动时间基本在45 d至数月不等[14~16].相比之下, 利用储存污泥的快速活化, 可显著缩短亚硝化的启动时间[17], 有利于亚硝化工艺的实际应用.
目前, 国内外利用储存污泥进行亚硝化的研究较少, 本题组对长期储存的亚硝化颗粒污泥进行了研究, 在此基础之上, 本研究在CSTR反应器中接种4℃下储存10个月的亚硝化污泥, 对储存了10个月的亚硝化絮状污泥进行活化.系统考察了亚硝化性能恢复、外观形态、与胞外聚合物(EPS)组成变化, 同时采用MiSeq高通量测序技术对活化前后的微生物进行检测, 从分子生物学角度分析接种污泥前后的菌群结构变化, 以期为快速启动亚硝化絮状污泥提供宏观和微观依据, 促进亚硝化工艺的应用.
1 材料与方法 1.1 实验装置本实验所用装置为合建式连续流CSTR反应器(图 1), 由有机玻璃制成, 分为曝气池和沉淀池两部分组成, 有效容积分别为1.9 L和0.7 L.反应器长20 cm, 宽8 cm, 有效高度24 cm, 采用蠕动泵连续进水, 溢流出水.曝气区底部装有曝气装置, 以提供溶解氧, 并使泥水充分混合, 溶解氧DO控制在0.4~0.8mg·L-1之间, 与亚硝化絮状污泥储存之前相同, 实验前期采用连续曝气, 后期采用间歇曝气.反应器的运行工况设置如表 1所示.活化期间, CSTR反应器始终置于恒温水浴箱中, 温度控制在(30±1)℃.
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图 1 实验装置示意 Fig. 1 Experimental apparatus |
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表 1 CSTR反应器运行参数 Table 1 CSTR operating parameters |
1.2 接种污泥性质
接种污泥为长期冷冻保存的亚硝化絮状污泥, 接种前在4℃条件下储存了10个月.储存前亚硝化絮状污泥为棕黄色, MLVSS/MLSS为77%, 污泥体积指数(SVI)值为90mg·L-1, 氨氮容积负荷1.024 kg·(m3·d)-1, 氨氮去除率94%, 亚硝累积率为89%, 储存10个月后, MLVSS/MVSS和SVI均有明显变化, 污泥颜色由储存前的棕黄色分成两层不同的颜色, 分别为灰色(上层)和黑色(下层).污泥经过10个月长期储存后, 会带有浓郁的臭鸡蛋气味, 这是因为污泥经过长期的厌氧储存后, 会发生内源呼吸和厌氧消化, 因而污泥的无机化程度提高, 会产生硫化氢, 甲烷等气体, 所以带有浓郁的臭鸡蛋气味[18~20].不同时期的污泥特征如表 2所示.
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表 2 亚硝化絮状污泥的污泥特征 Table 2 Characteristics of nitrosation flocculent sludge |
1.3 反应器进水
采用人工配水, 以(NH4)2SO4为氮源(150mg·L-1), 不投加任何有机物, 加碳酸氢钠以调节pH至8左右.另外还包括生物所需的其他营养元素氯化钙(10mg·L-1)、硫酸镁(10mg·L-1)、磷酸氢二钾(4mg·L-1)及微量元素.微量元素分为微量元素Ⅰ和微量元素Ⅱ, 微量元素按照1 mL·L-1添加.微量元素Ⅰ组分(g·L-1)：EDTA 5, FeSO4 5.微量元素Ⅱ组分(g·L-1)：EDTA 15, ZnSO4·7H2O 0.43, CoCl2·6H2O 0.24, MnCl2·4H2O 0.99, CuSO4·5H2O 0.25, NaMoO4·2H2O 0.22, NiCl2·6H2O 0.19, NaSeO4·10H2O 0.21, H3BO4 0.014.
1.4 分析方法实验过程中每隔1 d取水样测定, 测定项目主要包括NH4+-N:纳氏试剂分光光度法; NO2--N：N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法; NO3--N：紫外分光光度法; MLSS、MLVSS：标准重量法; SVI：30 min沉降法; pH：pHS-9V数显酸度计; 溶解氧：YSI550A溶氧仪.
采用甲醇-NaOH法[21]对絮状污泥的EPS进行提取, 其主要包含蛋白质(PN)和多糖(PS)组分. PN、PS分别采用Lowry法[22]和改进苯酚-硫酸法[23]测定.
1.5 微生物高通量测序分析分别将活性恢复前、后的亚硝化絮状污泥采集送样, 采用FastPrep DNA提取试剂盒(QBIOGENE, USA)DNA, 完成基因组DNA抽提后, 利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA.用16S rRNA基因引物338F(ACTCCTACGGGAGGCA GCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)对细菌16S rRNA基因进行PCR扩增, PCR仪采用ABI GeneAmp® 9700型, 采用TransGen AP221-02; TransStart Fastpfu DNA Polymerase, 20 μL反应体系.反应程序为95℃预变性3 min, 95℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 27个循环后, 72℃延伸10 min, 每个样品重复3次.
使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物, 委托上海美吉生物医药科技有限公司完成对PCR扩增产物的高通量测序, 微生物多样性分析于上海美吉医药生物科技有限公司所提供的I-Sanger生信分析云平台上完成.
2 结果与讨论 2.1 亚硝化性能的恢复在活性恢复的1~6 d, 控制进水氨氮浓度为150 mg·L-1, HRT为4 h, 氨氮负荷为0.945kg·(m3·d)-1, DO为0.4~0.8 mg·L-1, 以选择性抑制Nitrobacter和Nitrospira等硝化菌(NOB)的生长[24~26].如图 2, 接种储存污泥的第一天, 氨氮去除率就达到了54.17%, 第二天氨氮去除率便达到99%, 但由于过高的曝气量, 致使DO为2.0mg·L-1, 此时出水硝态氮浓度高达30mg·L-1, 遂在接下来的4 d时间降低曝气量, 使DO降低至0.6mg·L-1, 出水硝态氮浓度降低至10mg·L-1, 氨氮去除率、亚硝累积率均达到90%以上, 各时间段出水氮浓度如图 3.随后分别在第7 d和第10 d缩短HRT为3 h和2 h, 分阶段将进水氨氮负荷提升至1.89kg·(m3·d)-1, 氨氮去除率在第7 d和第10 d略有降低, 随后迅速恢复, 反应器运行至15 d时, 氨氮去除率和亚硝累积率分别为95%和92%, 亚硝化性能恢复良好.
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图 2 氨氮去除率、亚硝累积率和氮损的变化 Fig. 2 Variations in removal efficiency of ammonia nitrogen, accumulation ratio of nitrite nitrogen, and nitrogen loss |
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图 3 出水氮浓度变化 Fig. 3 Change in effluent nitrogen concentration |
值得说明的是, 反应器对氨氮去除速率仅需2 d就达到99%, 张肖静等[27]在研究亚硝化絮状污泥的活性时, 在恢复的前几天, 氨氮去除率几乎为0, 这与本实验的研究结果不符, 这与张控制的DO较低, 仅为0.3mg·L-1有关.钱飞跃等[28]在研究常温储存亚硝化颗粒污泥的活化时, 在1~8 d内, 反应器对氨氮去除率逐渐增大, 最终达到95%, 而本实验仅在两天内就达到99%, 推测可能与污泥形态有关系, 钱飞跃等所用实验污泥为颗粒污泥, 颗粒污泥结构密实, 氧气在颗粒污泥的传递比在絮状中困难[29], 且钱飞跃所做实验为亚硝化污泥在常温下储存了1 a, 污泥在常温下长期储存可能导致大量微生物死亡, 这也是钱飞跃所做实验恢复较慢的原因.另外, 在活性恢复的前9 d时间中, 出现了不同程度的氮损为负值的现象, 即出水总氮大于进水总氮.分析原因是污泥长达10个月的储存中, 衍生出一定量的厌氧菌, 在活性恢复实验中因不能适应好氧环境而发生细胞自溶, 从而释放大量NH4+-N, 进而被AOB氧化为NO2--N, 导致出水总氮升高.在随后的6 d中, 有不同程度的氮损, 这是因为反应器中有部分区域为死区, 造成局部厌氧环境, 且反应器中同时有氨氮和亚硝态氮的存在, 为厌氧氨氧化菌提供了适宜的生存环境, 反应器中发生了局部的厌氧氨氧化反应, 故出现了氮损的现象.
2.2 污泥形态与EPS组成的变化在活化的过程中, 污泥的颜色发生了显著的变化, 活化仅2 d, 污泥颜色便由长期放置的黑色变为棕黑色, 之后逐渐恢复至棕黄色(图 4), 这是典型的亚硝化絮状污泥的颜色[30], 表明污泥的亚硝化性能得到恢复.
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图 4 不同时期污泥颜色 Fig. 4 Sludge color at different times |
亚硝化絮状污泥在经历长期储存时, 微生物的内源呼吸导致细胞水解, 产生大量絮体, 在活性恢复实验中由水解产生的絮体随水流出, 导致污泥浓度由4 800 mg·L-1逐渐降低至4 000 mg·L-1.在储存过程中, 由污泥解体产生的絮体导致SVI值升至166 mL·g-1, 沉降性能明显恶化, 在活性恢复实验中, 絮体随水流出, SVI值逐渐降低至73 mL·g-1, 污泥的絮凝性能和沉降性能得到提升.
接种储存污泥时, 总固体质量浓度(MLSS)为4 800 mg·L-1, 在活性恢复过程中, MLSS有所降低, 逐渐下降至4 000 mg·L-1, 这是因为污泥在长期储存过程中, 微生物的内源呼吸致使细胞水解, 在活性恢复时, 污泥解体产生的絮体和沉降性能较差的污泥随水流出, 反应器内的MLSS下降.正是因为污泥在长期储存过程中, 微生物得不到营养基质和溶解氧, 微生物发生细胞水解, 部分微生物死亡, 污泥的沉降性能和VSS含量有所下降, VSS/SS由储存前的0.77下降至0.56, SVI指数由90mL·g-1左右上升至232mL·g-1.在活性恢复过程中, 污泥解体产生的絮体和沉降性能较差的污泥随水流出, SVI值有所下降(图 5), 沉降性能得到恢复, 同时VSS/SS也逐渐恢复, 15 d后达到0.75, 表明污泥性能得到提高.
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图 5 亚硝化絮状污泥SVI和MLVSS/MLSS值的变化 Fig. 5 Variations in SVI and MLVSS/MLSS values of nitrosation flocculent sludge |
微生物所分泌的胞外聚合物(EPS)能够将细菌粘结到一起, 形成菌胶团, 即通常所说的絮凝作用, 故EPS是反映污泥性能的重要参数.本研究分别在污泥储存后和污泥活性恢复后对污泥做了EPS提取实验, 如表 3所示.亚硝化絮状污泥在经历了长期储存后, 蛋白质(PN)与多糖(PS)含量分别只有13.9 mg·g-1和14.7 mg·g-1, 这是由于污泥在储存时, 由于营养物质的缺乏, 污泥分泌的EPS被微生物作为底物利用[31].如表 3所示, 随着污泥活性的恢复, EPS总量显著增加, 且PN的增长量更为显著, 由活性恢复前的13.9 mg·g-1增加至66.2 mg·g-1. Sponza等[32]发现污泥在DO为0.5~2mg·L-1时, 蛋白质、糖类和核酸含量随着时间增长而升高; 李延军等[33]也发现好氧污泥随着DO的升高, 污泥中多糖、蛋白质及EPS总量有所增加, 蛋白质产生量约为多糖的2~3倍.有研究表明, EPS的总量与污泥的SVI值存在相关性, EPS增多, SVI值降低, 污泥的沉降性能变强, 这与本实验的研究结果较为一致, 这是因为EPS成分大多呈负电性, 细胞表面的负电性能够更容易与Mg2+和Ca2+等正价无机离子相结合, 增加絮体疏水性能和沉降速度, 故SVI值降低.本实验结果与钱飞跃等[28]和王新华[34]的实验结果均不一致, 后者的实验结果显示亚硝化絮状污泥在活性恢复后EPS含量比储存时有所减少, 这可能是因为其所做实验污泥为颗粒污泥的原因.
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表 3 亚硝化絮状污泥EPS组成变化/mg·g-1 Table 3 Variation in EPS composition of nitrosation flocculent sludge/mg·g-1 |
2.3 微生物菌群结构变化
利用MiSeq高通量测序平台对污泥中微生物多样性进行分析, 本研究中2个样本的覆盖度均大于99.99%, 可确保本次测序结果能够代表样本中微生物群落组成.活性恢复前后, 污泥中的微生物分别从属于22个门、38个纲、167个属和22个门、47个纲、182个属.如表 4所示, Chao1和ACE指数有所增加, 表明活性恢复后的亚硝化絮状污泥拥有更高的微生物物种丰度, Shannon和Simpson指数变化较小, 污泥活性恢复前后多样性略有增加.
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表 4 污泥活性恢复前后微生物多样性变化 Table 4 Variations in microbial diversity of sludge before and after reactivation |
如图 6, 活性恢复前后丰度较高的菌门均为α-Proteobacteria(变形菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)和Chloroflxi(绿弯菌门), Proteobacteria门所占比例由恢复前的40.61%增加到58.83%, 这主要是因为β-Proteobacteria纲所占比例由活性恢复前的16.80%增加到活性恢复后的32.29%所致, β-Proteobacteria纲几乎涵盖了所有类型的AOB[35], 这也从微生物角度证明了亚硝化性能的恢复.
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图 6 活性恢复前后, 亚硝化絮状污泥中各菌群在纲级别上的相对丰度 Fig. 6 Relative abundance of different microbial classes in nitrosation sludge before and after reactivation |
活性恢复前, 属于发酵酸化菌的Cytophagia纲大量存在, 活化15 d后, Cytophagia纲大量减少, 且Bacteroidia纲、Clostridia纲等厌氧微生物的相对丰度大量降低, 甚至达到未测出的状态.活性恢复后, 与分泌N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)群体感应信号分子相关的Sphingobacteria纲和Flavobacteria纲增加, Sphingobacteria纲和Flavobacteria纲具有增加硝化污泥活性、提高微生物生长速率和增强氨氮转化效率的功能[36], 且Flavobacteria纲与分泌EPS密切相关, 故从微生物角度解释了活性恢复前后EPS含量增加的原因.此外, 以Nitrosomonas为代表的AOB的相对丰度由活性恢复前的未检出状态上升至25.33%, 同时, Nitrospria等NOB的生长亦得到了有效抑制, 活性恢复前后均呈现出未检测状态, 这也解释了本实验NAR积累率较高的原因.
3 结论(1) 通过缩短HRT提升氨氮负荷[0.64~1.89kg·(m3·d)-1]、控制DO为0.4~0.8mg·L-1、pH值为8左右等措施, 在15d内成功活化了4℃储存了10个月的亚硝化絮状污泥.氨氮去除率和亚硝累积率分别达到95%和92%.
(2) 在储存污泥活性恢复过程中, 污泥颜色迅速从黑灰色向棕黄色转变; VSS/SS由储存后的0.56提高到0.75, SVI值由232下降至73mg·L-1; EPS总量显著增加, 且PN增量明显大于PS增量.
(3) 随着亚硝化性能的恢复, 厌氧、发酵微生物被洗脱, Nitrosomonas等AOB相对丰度显著增加, 成为了优势菌属, 同时, Nitrospria等NOB的生长得到了有效的抑制, 是长期储存的亚硝化絮状污泥活性快速恢复的原因, 是实现短程硝化快速启动的核心因素.
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