2018, Vol. 39
2. 城市生活污水资源化利用技术国家地方联合工程实验室, 苏州 215009;
3. 苏州科技大学环境生物技术研究所, 苏州 215009
, JIN Run1,2,3 , YUAN Yan1,2,3 , LI Xiang1,2,3
, HUANG Yong1,2,3 , GU Cheng-wei1,2,3
2. National and Local Joint Engineering Laboratory of Municipal Sewage Resource Utilization Technology, Suzhou 215009, China;
3. Institute of Environmental Biotechnology, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China
铁几乎是所有微生物生长的重要元素之一, 参与到三羧酸循环, 电子转移, 氨基酸和嘧啶的合成, 与一些重要的蛋白类物质, 血红素、硫铁蛋白有着重要联系[1].近年来, Fe(Ⅲ)将氨氮氧化的现象(Feammox)在稻田、高原土、河岸湿地等一些富有氨氮和铁的厌氧环境中被发现[2~4].这一现象的发现, 为自然界氮素与铁元素的转化提供了新的认识, 受到研究者的广泛关注.随后, 一些研究者在自然界原位的环境和实验室小试的装置中进一步证实Feammox现象的存在, 并对机制进行深入分析, 推测土壤中大约有18 t·(km2·a)-1的氮是由Feammox过程转化实现[5, 6].
厌氧氨氧化(ANAMMOX)菌作为一种厌氧条件下以亚硝酸盐为电子受体氧化氨的新型高效生物脱氮菌种, 受到研究者的广泛关注[7~9]. Van Niftrik等[10]发现ANAMMOX菌体内储存大量铁颗粒, 并证实其在ANAMMOX反应过程中参与铁蛋白和血红素的组成, 是ANAMMOX过程中的重要元素.随后, 有学者进行了关于Fe(Ⅱ)浓度对ANAMMOX菌活性的影响研究, 结果一致表明按照Strous等[11]最早所报道并被广泛运用于ANAMMOX菌培养的模拟废水中Fe(Ⅱ)含量明显不足[12, 13].随着ANAMMOX微生物生理特征和环境因子研究的不断深入, 人们发现在厌氧的条件下, 不仅仅亚硝酸盐可以作为唯一电子受体, Fe(Ⅲ)也可作为电子受体, 将氨氧化为NOx或者N2. Li等[14]接种ANAMMOX污泥启动Feammox反应器实现了Fe(Ⅲ)和氨的同步转化.姚宗豹等[15]利用Fe(Ⅲ)代替亚硝酸盐, 通过接种ANAMMOX污泥也成功地实现了Feammox反应.说明ANAMMOX污泥中存在着Feammox反应, 只要条件适宜即可驯化.
ANAMMOX菌培养的最适温度为32℃, 最适pH值为7.5~8[16].然而, 铁元素在中性的条件下多以Fe(OH)2或者Fe(OH)3的形态存在.这种絮体易沉淀在反应器中, 不易随水流出, 导致Feammox反应过程中铁元素的价态及浓度变化很难测定.目前研究者在不同的pH(4.5~8.5)环境中均发现或者实现了Feammox反应[5, 6], 且存在多种不同产物的报道.然而有关pH、温度等一些常规控制参数对其影响尚不明确.这些缺陷限制了人们对Feammox机制的深入探索.
因此, 本研究利用前期驯化出的Feammox污泥, 通过进出水氮素形态的测定, 探讨pH、温度的变化对Feammox过程氮素转化的影响, 以期为强化Feammox过程氮素的转化能力和微生物的富集提供一些技术参考.
1 材料与方法 1.1 装置与控制条件采用1套带有密封塞的1 000 mL血清瓶进行Feammox污泥活性[14]的恢复.在研究pH值对Feammox污泥活性影响的过程中, 采用10个100 mL的同样外形的血清瓶, 将恢复好的Feammox污泥均分到各个瓶中, 进入同样的营养液, 控制不同的pH值(4.5~9.0, 以0.5作为梯度逐步提高), 温度控制在32℃.在研究温度对Feammox污泥活性影响的过程中, 采用9个相同的装置接种再次恢复活性的Feammox污泥, 设定不同的温度(5~45℃, 以5℃作为梯度逐步上升), 进水pH值控制在7.温度通过气浴恒温振荡器或者低温生化培养箱维持.进水pH值通过0.1 mol·L-1的盐酸调节.水力停留时间(HRT)最初均控制在2 d.
1.2 模拟废水实验所用废水由人工配置.废水主要由NH4+-N 30 mg·L-1左右, 由NH4Cl配制; Fe(Ⅲ) 50~60 mg·L-1, 由FeCl3配制、NaHCO3 500 mg·L-1、KH2PO4 27 mg·L-1、CaCl2·2H2O 136 mg·L-1、MgO 4 mg·L-1、微量元素1.25 mL·L-1组成.微量元素浓缩液：EDTA 10 000 mg·L-1, ZnSO4·7H2O 430 mg·L-1, CoCl2·6H2O 240 mg·L-1, MnCl2·4H2O 990 mg·L-1, CuSO4·5H2O 250 mg·L-1, NaMoO4·2H2O 220 mg·L-1, NiCl2·6H2O 190 mg·L-1, NaSeO4·10H2O 210 mg·L-1, H3BO4 14 mg·L-1.废水配置后通过高纯氮气进行30 min的曝气, 保证反应器内厌氧的环境.
1.3 水质分析指标测定方法均按照文献[17]. NH4+-N采用纳氏分光光度法; NO2--N采用N-(1萘基)-乙二胺分光光度法; NO3--N采用紫外分光光度法; pH采用哈纳pH211型酸度计, Fe(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)采用邻菲罗啉分光光度法, 测定方法稍微做了一些改进, 具体参见文献[18].
1.4 颗粒污泥表面EDX分析利用EDX对最初接种的ANAMMOX污泥, 以及经过40 d活性恢复的Feammox污泥表面进行观察.样品首先利用0.45 μm的纤维膜进行过滤, 然后放置在4%的戊二醛溶液中进行24 h固定, 然后利用0.1 mol·L-1的磷酸缓冲液进行3次清洗, 每次时间15 min.再利用不同梯度浓度(20%、40%、60%、80%和100%)的酒精溶液进行脱水, 每个浓度5 min.通过临界点干燥仪对脱水的样品进行干燥.最后利用扫描电镜(Quetan2500, FEI, USA)进行观察.
2 结果与讨论 2.1 Feammox污泥的活性恢复将前期成熟的Feammox污泥接种入反应器内, 进行40 d的活性恢复, 结果如图 1所示.在反应器启动初期就有明显的Feammox现象显现.在进水氨氮和Fe(Ⅲ)浓度分别30 mg·L-1, 50 mg·L-1的条件下, 出水氨氮最低下降到9.94 mg·L-1, 亚硝酸盐一直处于2 mg·L-1以下, 出水硝酸盐维持在6.5 mg·L-1左右, 氨氮转化率维持在70%左右, 总氮去除率约40%.而出水Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)浓度分别维持在14 mg·L-1和9.5 mg·L-1, 出水总铁明显低于进水, 说明大量的铁离子沉淀在反应器内.在反应器运行过程中未监测到高浓度的亚硝酸盐主要是因为接种污泥最初是以亚硝酸盐为电子受体的ANAMMOX污泥, Feammox污泥中存在ANAMMOX菌(Candidatus Kuenenia stuttgartiensis、Candidatus Brocadia sinica和Candidatus Brocadia fulgida)将产生的亚硝酸盐与剩余的氨转化[14].
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图 1 Feammox污泥活性恢复过程中氮素及铁素的变化 Fig. 1 Changes in nitrogen and iron during recovery of Feammox sludge activity |
当反应器运行至25 d时, 将HRT缩短至1 d, 经过十多天的运行, 氨氮出水浓度明显提高, 最终稳定在14.5mg·L-1, 转化率为50%.亚硝酸盐出水并未明显增加.硝酸盐的出水浓度出现波动, 平均浓度约在6.1mg·L-1.总氮去除率维持在25.6%.出水Fe(Ⅱ)离子维持在9mg·L-1, Fe(Ⅲ)离子平均浓度为11mg·L-1.但是HRT缩短后, 氨氮转化速率和总氮去除速率获得了明显的提升, 氨氮转化速率由9.5 mg·(L·d)-1上升到14.5 mg·(L·d)-1.在反应器运行的40 d, 对污泥中的铁离子形态和浓度进行了监测, 结果表明1mL污泥中Fe(Ⅲ)浓度达到287mg·L-1. Fe(Ⅱ)离子浓度达到812 mg·L-1.通过EDX分析表明, 最初的ANAMMOX污泥中铁离子浓度很低仅3.2%[图 2(a)], 而经过40 d恢复运行后的污泥中铁离子含量达到40%, 基本与碳元素等量[图 2(b)].因此, 出现氨氮转化率的降低, 可能是因为大量的铁离子沉积在污泥中导致微生物很难与基质接触, 甚至可能导致污泥矿化. Fe(Ⅲ)也很容易被吸附在微生物表面参与到电子传递过程[19]. Oshiki等[20]和Gao等[21]通过SEM观察实验过程中的污泥絮体也发现被一些不规则的粒子覆盖, 他们推测可能是含有被氧化的Fe的矿物质.因此, 在Feammox运行过程中如何防止铁离子过度沉积妨碍基质传输将是一个值得探讨的问题.
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图 2 ANAMMOX污泥与Feammox污泥的EDX分析 Fig. 2 EDX analysis of ANAMMOX sludge and Feammox sludge |
利用C10H14N2Na2O8·2H2O将驯化后的Feammox污泥中铁离子尽可能地洗出, 然后平均封装于10个小反应器中, 设定不同的pH值(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0), 经过2 d的培养, 其结果如图 3所示.当pH值为6.5时, 出水氨氮的浓度为6.17mg·L-1, 氨氮的转化率最高为80.2%[图 3(a)].随着pH值持续升高或者降低, 出水氨氮的浓度均出现逐步上升.当pH值为4.5时, 出水的氨氮浓度为12.51 mg·L-1, 转化率为60%;当pH值为9.0时, 出水氨氮的浓度为20.99 mg·L-1, 转化率为32.7%.说明升高pH值对氨氮转化率的影响明显大于下降pH值的影响. pH值对硝酸盐产生量的波动较小, pH值在7.0~9.0之间时, 硝酸盐的生成量在8.5mg·L-1左右波动, 最低值出现在pH为9时, 浓度为7.9mg·L-1. pH值在4.5~5.5时存在少量亚硝酸盐的积累, 约2~3mg·L-1, 但随着pH值得升高, 仍处于较低浓度.从总氮的去除情况看, pH值7.0时最高, 总氮去除达到14.7mg·L-1.随着pH值得上升或者下降, 总氮去除量呈现出明显的下降趋势.因此, 从亚硝酸盐累积及总氮的去除量可以推测, 出现该现象主要是因为Feammox污泥中的ANAMMOX菌在低pH环境下不适宜生长, 出现少量亚硝酸盐的积累[22], 而当pH逐步上升时, ANAMMOX菌的pH环境逐步适宜, 可以利用亚硝酸盐氧化氨氮, 所以pH值升高时观察不到亚硝酸盐积累. Huang等[5]在pH值为4.5的环境中利用水铁矿和针铁矿作为电子供体氧化氨氮, 结果存在亚硝酸盐的生成, 因此认为氨氮在Feammox过程中被氧化为亚硝酸盐. Shrestha等[23]在pH值为3.5~4热带雨林沉积物中观察到Feammox现象, 并且氨氮被转化为亚硝酸盐, 未有硝酸盐的产生, 通过同位素示踪实验推测ANAMMOX反应将氨氮和亚硝酸盐转化为氮气. Zhou等[24]在pH值为6.8~7.2的高原土壤中发现Feammox现象, 氨氮被氧化为硝酸盐和亚硝酸盐, 存在反硝化细菌将硝酸盐或亚硝酸盐转化为氮气. Li等[6]利用同位素示踪技术在pH值为8.32~8.46的湿地中发现Feammox过程, 未观察到亚硝酸盐的产生, 认为氨氮被氧化为氮气.说明pH值的变化对Feammox过程氨氮转化的产物形态影响较大.
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图 3 不同pH值对Feammox过程氮素及铁离子形态的影响 Fig. 3 Effects of different pH values on nitrogen and iron ion forms in the Feammox process |
铁离子的出水浓度随着pH的提高, 则出现明显的下降现象[图 3(b)].同时在pH值为4.5时, 出水Fe(Ⅱ)浓度达到60.7mg·L-1, Fe(Ⅲ)浓度为20.3 mg·L-1, 明显高于进水总铁[Fe(Ⅲ)]30mg·L-1, 说明低pH值下污泥中未完全洗净的Fe(OH)2和Fe(OH)3发生溶解后, 随出水流出.而当pH值升高到9.0时, 出水Fe(Ⅱ)浓度下降到1.7mg·L-1, Fe(Ⅲ)浓度为1.3 mg·L-1, 说明高pH环境下铁离子几乎完全沉淀在污泥中, 不易于Feammox反应的长期进行.
2.3 温度对Feammox污泥活性的影响目前有关Feammox现象的研究基本在25℃左右的常温条件下进行的, 鲜见不同温度对Feammox影响的对比分析.本研究在进水氨氮和Fe(Ⅲ)浓度分别为31.2 mg·L-1和48.5 mg·L-1的条件下, 不同温度(5、10、15、20、25、30、35、40、45℃)对Feammox过程影响如图 4(a)所示.当温度为30℃时, 反应器中氨氮的转化速率最高, 出水氨氮浓度为8.6mg·L-1, 转化率为72.4%.随着温度逐步的升高或者降低, 出水的氨氮浓度都会逐步增加.当温度为5℃时, 出水氨氮浓度达到28.7mg·L-1, 转化率为8%, 几乎未发生转化.当温度升高至45℃时, 出水氨氮浓度为22.3 mg·L-1, 转化率为28.5%.因亚硝酸盐产量较低, 所以温度对其影响几乎不明显.而温度对硝酸盐的产量产生明显的影响, 当温度从5℃开始逐渐上升到25℃时, 硝酸盐的产量逐步升高.当温度大于25℃时, 温度对硝酸盐的影响变得不明显, 出水硝酸盐浓度基本维持在8 mg·L-1. Park等[3]利用活性污泥富集培养Feammox微生物, 将pH控制在6.8, 温度控制在35℃, 也发现氨氮转化的产物主要为硝酸盐.温度在30℃时, 总氮的去除率最大, 去除量达到15.7 mg·L-1, 去除率为50.3%.随着温度的逐步上升或者下降, 反应器的总氮去除速率开始逐步下降.当温度下降到5℃时, 出水总氮浓度反而升高, 可能是此温度下部分微生物因无法生长出现了内源消化.
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图 4 温度对Feammox过程氮素及铁离子形态的影响 Fig. 4 Effects of temperature change on nitrogen and iron ion forms in the Feammox process |
在不同温度下, 反应器出水Fe(Ⅲ)浓度基本随着氨氮浓度的下降而下降[图 4(b)], 在温度35℃时, 出水Fe(Ⅲ)浓度下降到8.3 mg·L-1.出水Fe(Ⅱ)浓度与Fe(Ⅲ)趋势相反, 高浓度20~25 mg·L-1出现在温度为20~35℃, 此时反应器脱氮能力处于一个相对较高的水平.
3 结论(1) pH值变化对Feammox过程氨氮转化的产物形态影响较大.当pH值为6.5时, 出水氨氮的浓度最低为6.17mg·L-1, 氨氮的转化率最高为80.2%.当pH值7.0时, 总氮去除最高达到14.7mg·L-1.随着pH值的上升或者下降, 总氮去除量呈现出明显的下降趋势.
(2) 温度在30℃时, 氨氮的转化速率和总氮的去除率都最高, 出水氨氮浓度为8.6mg·L-1, 去除量达15.7mg·L-1.随着温度逐步上升或下降, 反应器氨氮的转化速率和总氮去除速率都逐步下降.
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