环境科学  2018, Vol. 39 Issue (9): 4222-4228   PDF    
引用本文
胡亚茹, 姜蕾, 张天阳, 雷丹丹, 姜巍巍, 张东, 林匡飞, 崔长征. 华东地区某饮用水源地中磺胺类抗性基因的分布特征[J]. 环境科学, 2018, 39(9): 4222-4228.
HU Ya-ru, JIANG Lei, ZHANG Tian-yang, LEI Dan-dan, JIANG Wei-wei, ZHANG Dong, LIN Kuang-fei, CUI Chang-zheng. Distribution Characteristics of Sulfonamide Antibiotic Resistance Genes in a Drinking Water Source in East China[J]. Environmental Science, 2018, 39(9): 4222-4228.
华东地区某饮用水源地中磺胺类抗性基因的分布特征
胡亚茹1, 姜蕾2, 张天阳1, 雷丹丹1, 姜巍巍2, 张东2, 林匡飞1, 崔长征1     
1. 华东理工大学资源与环境工程学院, 国家环境保护化工过程环境风险评价与控制重点实验室, 上海 200237;
2. 上海城市水资源开发利用国家工程中心有限公司, 上海 200082
收稿日期: 2017-12-14; 修订日期: 2018-03-12
基金项目: 国家水体污染控制与治理科技重大专项（2017ZX07402003）；中国博士后科学基金项目（2017M621391）；上海市科委科技攻关项目（16DZ1204703）；上海市青年科技启明星计划项目（15QB1400700）
作者简介: 胡亚茹(1990~), 女, 博士研究生, 主要研究方向为饮用水安全保障技术, E-mail:hu746459@163.com
通信作者: 崔长征, E-mail:cuichangzheng@ecust.edu.cn
摘要: 饮用水源中检测到的抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes，ARGs）对饮用水质安全和人体健康产生的潜在威胁受到广泛关注.在掌握了华东地区某饮用水源地13种磺胺类抗生素的污染特征基础上，进一步采用定性PCR和荧光定量PCR解析该饮用水源水和底泥中磺胺类ARGs（sul 1、sul 2）以及抗性基因可转移元件Ⅰ型整合酶基因（intI 1）的分布特征.结果表明，3种基因在该饮用水源水和底泥中均100%检出，sul 1基因是该饮用水源地中检出含量最高的磺胺类ARGs，在水源水中含量范围为1.5×104~6.4×105 copies·mL-1，底泥中则高达1.6×108 copies·g-1，较sul 2、intI 1基因分别高0.6~2.2、0.5~1.9个数量级.sul 1、sul 2和intI 1基因在该水源地入水口和出水口处的绝对含量无显著差别，而在底泥中sul 1、sul 2和intI 1基因的绝对含量则是出水口高于入水口.sul 1在夏季水源地出水口的检出含量最高，为6.4×105 copies·mL-1；intI 1基因在冬季的检出含量高于其他季节.sul 1基因与13种磺胺类抗生素具有相关性（r=0.69，P < 0.05），其中与磺胺甲唑的含量显著相关（r=0.79，P < 0.01）；intI 1与sul 1、sul 2的相对含量之间也存在正相关关系（r为0.80和0.73，P < 0.05），这表明intI 1在磺胺类ARGs的水平转移过程中起到了重要作用.本研究为典型饮用水源地中ARGs的污染现状提供基础数据，也为管控饮用水环境的抗性基因污染和制定管理决策提供依据.
关键词: 磺胺类抗性基因      Ⅰ型整合酶基因intI 1      饮用水源水      分布特征      水平基因转移     
Distribution Characteristics of Sulfonamide Antibiotic Resistance Genes in a Drinking Water Source in East China
HU Ya-ru1 , JIANG Lei2 , ZHANG Tian-yang1 , LEI Dan-dan1 , JIANG Wei-wei2 , ZHANG Dong2 , LIN Kuang-fei1 , CUI Chang-zheng1     
1. State Environmental Protection Key Laboratory of Environmental Risk Assessment and Control on Chemical Process, School of Resources and Environmental Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China;
2. National Engineering Research Center of Urban Water Resources, Shanghai 200082, China
Abstract: Antibiotic resistance genes (ARGs) in drinking water sources have attracted widespread attention due to the threat they pose to water security and human health. This study mainly focused on the distribution of sulfonamide ARGs (sul 1, sul 2) and one integrase gene (intI 1) in water and sediment using qualitative and fluorescent quantitative PCR, based on previous work on the characteristics of 13 kinds of sulfonamides in a drinking water source in East China. Results showed that the three target genes were all detected in water and sediment. The sul 1 gene was the sulfonamide ARG with highest concentration, with 1.5×104-6.4×105 copies·mL-1 in source water and maximum concentration of 1.6×108 copies·g-1 in sediment. Concentration of sul 1 was 0.6-2.2, 0.5-1.9 order of magnitudes higher than sul 2 and intI 1 genes, respectively. There was no significant difference between the absolute concentrations of sul 1, sul 2, and intI 1 in inflow and outflow. However, in the case of sediment, absolute abundances of sul 1, sul 2, and intI 1 in outflow were higher than those in inflow. The maximum concentration of sul 1 was detected in outflow in summer (6.4×105 copies·mL-1). The concentration of intI 1 was higher in winter compared to other seasons. There was a positive correlation between sul 1 and 13 sulfonamides (r=0.69, P < 0.05), and the relative concentration of sul 1 and amount of sulfamethoxazole were significantly positively related (r=0.79, P < 0.01). There were also positive correlations between the relative concentrations of intI 1 and sul 1, sul 2 (r:0.80 and 0.73, P < 0.05), respectively, suggesting that intI 1 played an important role in horizontal gene transfer of sulfonamide ARGs in this drinking water source. This study provides basic data for monitoring pollution of ARGs, as well as a basis for controlling ARG pollution in the drinking water environment and making management decisions.
Key words: sulfonamides antibiotics resistance genes      integrase gene intI 1      drinking water source      distribution characteristics      horizontal gene transfer     

近年来, 由于抗生素滥用而产生的细菌耐药性问题在全球范围内引起广泛关注[1, 2].环境中残留的抗生素不仅会加剧微生物对抗生素的抗性, 同时也促使抗生素抗性基因(antibiotic resistence genes, ARGs)在环境中增殖以及在微生物之间的水平转移, 造成抗生素的治疗效果日益下降[3]. ARGs具有“可复制或可传播”的生物学特性和“不易消亡或环境持久”的物理化学特性, 通常位于质粒、转座子、整合子等可移动遗传元件上, 能够在细菌间进行传播扩散[4]. Martínez等[5]认为在某种程度上抗性细菌和ARGs的产生、传播比残留微量抗生素对环境的危害更大.因而细菌耐药性严重威胁了生态环境及人体健康, 是人类将要解决的重要问题之一.

磺胺类抗生素(sulfonamide antibiotics, SAs)是最早被应用于临床的抗生素.目前在我国的生产量和使用量仍较大, 且在地表水等环境中的检出率和含量较高[6, 7]. SAs具有类似于p-氨基苯甲酸的结构, 在细菌生长中通过竞争性抑制p-氨基苯甲酸与二氢叶酸合成酶的结合, 扰乱细菌的叶酸代谢循环, 从而抑制细菌生长和繁殖而起到抑菌作用[8].细菌中dhps(folP)突变基因编码的二氢叶酸合成酶能够分辨p-氨基苯甲酸和SAs, 进而与p-氨基苯甲酸结合, 使得细菌中二氢叶酸正常合成, 即表现为对SAs的耐药性[9]. sul1和sul2是位于质粒上常见的两种均编码二氢叶酸合成酶的基因[10].其中sul1基因通常与Tn21型整合子中的其它抗性基因相连, sul2则通常位于IncQ家族的小质粒(RSF1010)以及由pBP1代表的质粒上[11].整合子作为基因捕获系统, 在抗性基因的水平转移中发挥着重要作用, 编码整合酶(位点特异性重组酶)intI基因较为常见.根据intI基因DNA序列的不同, 可把整合子分为4类[12], 其中intI1被认为位于Tn21及相关转座子上[11], 是一种频繁检出的ARGs可转移元件[13].目前在我国地表水(105~107 copies·mL-1)[13]、生活污水处理厂(105 copies·mL-1)[14]、以及西班牙医院废水[15](106 copies·mL-1)和美国科罗拉多州(10-6~10-2, 相对含量)[16]等水环境中, 均检测出sul1、sul2和intI1, 这表明磺胺类ARGs污染在水环境已经普遍存在.但是, 目前针对磺胺类ARGs的污染现状及分布特征的研究主要集中在地表水及污水等水环境, 而对于饮用水源水的研究报道较少.近年来, 饮用水源地或饮用水中抗生素抗性基因的残留及其潜在风险日益受到关注[17, 18].

在前期对华东地区某饮用水源地13种磺胺类抗生素的污染特征研究基础上, 本研究采用普通定性PCR和荧光定量PCR技术, 对该饮用水源地水源水和底泥中磺胺类抗性基因(sul1、sul2)和抗性基因的可转移元件Ⅰ型整合酶基因(intI1)的空间和季节分布特征进行了进一步解析, 以期为正确评价磺胺类ARGs在饮用水源中的潜在风险, 以及饮用水中抗生素和ARGs的风险防控提供基础数据.

1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂

定性PCR仪(Eppendorf 5333, Germany), 荧光定量PCR仪(LightCycle 480 Ⅱ, Roche), 超微量分光光度计(NanoDrop2000, USA), FastPrep®-24快速核酸提取仪(MP, USA), 电泳仪(DYY-12C, 北京).

Fast DNA® SPIN Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals, USA), pGEM-T Easy平末端DNA段克隆试剂盒(Promega, USA), SYBR Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa, Japan), TIAN pure Midi Kit质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DH5α感受态细胞、2×TaqPCR MasterMix均购自天根生化科技有限公司.

1.2 样品采集

样品采集地点位于我国华东地区长江下游, 水样采集时间、饮用水源地采样地点与金磊等[19]的报道一致, 2014年12月~2015年2月、2015年的3~5月、6~8月、9~11月, 依次代表冬季、春季、夏季和秋季样品, 且每季度分别在入水口、库中和出水口取两份水样, 置于灭菌棕色玻璃瓶中.底泥采集时间为2014年12月, 分别在入水口、库中及出水口取3份, 置于密封袋中.对所用样品进行标记并储存于冰块中, 在24 h内完成水样过滤及样品DNA提, DNA于-20℃保存, 并尽快进行ARGs分析.

1.3 磺胺类ARGs的分析 1.3.1 样品预处理

取1 000 mL水样经0.22 μm的醋酸纤维素滤膜过滤, 截留水样中的微生物, 采用Fast DNA® SPIN Kit for Soil试剂盒进行水样DNA提取.取底泥样品500 mg于上述试剂盒中, Lysing Matrix E Tube中提取样品DNA.

1.3.2 ARGs定性PCR

以上述提取的DNA为模板, 进行磺胺类ARGs(sul1、sul2), intI1及16S rRNA的定性PCR检测.引物参照Luo等[13]报道的序列, 由生工生物工程(上海)有限公司进行引物合成. PCR反应体系为：2×Taq PCR MasterMix(12.5 μL); 上下游引物(各1 μL), ddH2O(10 μL), 模板(0.5 μL), 采用ddH2O替代模板作为阴性对照.定性PCR条件为：预变性：95℃, 5 min; 扩增(30个循环)：95℃, 30 s; 退火温度T(表示不同的退火温度), 30 s; 72℃, 1 min; 延伸：72℃, 7 min.取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测, 电泳条件为1 400 mV, 30 min.利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段, 并送至生工生物工程(上海)有限公司测序, 测序结果在NCBI的GenBank数据库进行BLAST序列分析, 并证实为目的基因序列.

1.3.3 ARGs定量

(1) ARGs定量标准曲线建立

PCR产物的连接, 连接产物转化等标准质粒的构建及提取参照Xu等[1]的方法.构建的标准质粒含量及纯度经超微量分光光度计测定后, 进行系列10倍梯度稀释, 在实时荧光定量PCR仪上按照下列反应程序进行ARGs定量标准曲线的建立.定量PCR反应体系：SYBR Premix Ex TaqⅡ (TaKaRa) (2×), 10 μL; 上下游引物(10 μmol·L-1)：各0.4 μL; 无菌ddH2O：8.2 μL; 模板：1 μL.定量PCR条件为：预变性95℃, 5 min; 扩增(35个循环)：95℃, 15 s; T(℃), 1 min(T代表不同的退火温度); 72℃, 30 s; 延伸：72℃, 6 min. 16S rRNA、sul1、sul2及intI1基因的定量标准曲线R2大于0.994(P < 0.05), 扩增效率=(101/斜率-1)×100%, 在100%~120%之间.

(2) 样品ARGs定量

样品进行定量PCR时, 先采用超微量分光光度计测定样品基因组含量, 并将样品基因组稀释至合适的梯度.每个样品至少设置两个含量梯度, 每个含量设置3个平行样, 上机进行测定, 获得相应的Ct值.理论上Ct值在15~35之间表明结果可信, 将所得样品Ct值代入构建好的定量标准曲线可获得样品中相应ARGs的含量, 同时分别采用无菌ddH2O和构建的标准质粒作为阴性和阳性对照.

1.4 数据分析与处理

由相应ARGs的定量标准曲线(Ct=-k lg c′+b)可得相应ARGs的绝对含量[c=c′×稀释倍数×DES洗脱体积(提取DNA最后加入的洗脱液体积, μL)/样品体积(采集水样体积, 一般为1 000 mL), copies·mL-1]; 以ARGs的绝对含量/16S rRNA绝对含量=ARGs相对含量.数据处理采用SPSS 22.0分析, 制图采用Origin 8.0软件, 其中误差线为3个平行样含量的标准偏差.

2 结果与讨论 2.1 磺胺类ARGs在饮用水源水中的总体检出水平

该饮用水源水中磺胺类ARGs(sul1和sul2)及intI1的总体检出水平如表 1所示, sul1、sul2和intI1基因在该饮用水源水的所有样品中均被检出. sul1基因的检出含量最高, 绝对含量在1.5×104~6.4×105 copies·mL-1之间, 相对含量(ARGs/16S rRNA)在2.3×10-3~4.7×10-1之间; sul2检出含量范围为3.4×103~2.2×104 copies·mL-1, 相对含量范围为3.5×10-4~2.9×10-2; intI1检出含量在3.0×103~6.8×105 copies·mL-1之间, 相对含量为4.3×10-4~2.9×10-2之间.对比3种基因的绝对含量, sul1基因较sul2和intI1基因分别高0.6~2.2、0.5~1.9个数量级, 这与在科罗拉多河的研究中sul1基因丰度较sul2高一致[16].同时Pei等[20]的研究发现, sul2基因是受人类/农业影响最敏感的基因型, 该饮用水源地位于江心, 周围受人类活动的影响相对较小, 推测是sul2低的原因之一.

表 1 饮用水源水中磺胺类ARGs及intI1的总体检出水平1) Table 1 Summary of sul ARGs and intI1 concentrations in drinking water source

该水源地底泥中sul1、sul2和intI1的检出含量依次为1.7×107~1.6×108、8.7×105~1.2×107和2.6×108~4.3×108 copies·g-1, 比该水源水中分别高1.4~4.0、1.6~3.5和2.6~5.2个数量级, 这表明该水源地底泥是ARGs的一个重要储存库[1].

与国内外水环境的其他研究相比, 本研究水源水中的sul1和sul2检出含量(103~105copies·mL-1)略低于天津海河[13](105~107 copies·mL-1)和黄浦江水源水[21](均在105 copies·mL-1之间). intI1基因的检出含量(103~105copies·mL-1)低于珠江流域[22](105~106 copies·mL-1)及清河[1](1.2×106 copies·mL-1).底泥中sul1和sul2含量(105~108 copies·g-1)则低于海河底泥[13](108~1010 copies·g-1), 高于温榆河底泥[1](4.2×102~2.0×108 copies·g-1).不同水环境中残留的SAs含量不同, 对环境微生物产生的选择压力不同[23].例如天津海河流域SAs的检出含量为24~385 ng·L-1[23], 略高于该饮用水源水中SAs的总检出含量(10.5~238.5 ng·L-1)[19].

2.2 磺胺类ARGs在饮用水源水中的空间分布特征

磺胺类ARGs及intI1在该饮用水源水中的空间分布特征如图 1和图 2所示.从绝对含量来看, sul1、sul2和intI1基因在饮用水源地入水口处的绝对含量与出水口处相差不大; 相对含量则无明显分布规律.然而在该饮用水源地底泥中, 出水口中sul1、sul2和intI1基因的绝对含量1.6×108、1.1×107和4.3×108 copies·g-1均高于入水口1.7×107、8.1×105和2.6×108 copies·g-1. Xu等[1]发现温榆河底泥样品中的磺胺类ARGs和intI1基因在没有人类活动干扰的情况下, 也随着水流而逐渐升高.该饮用水源地底泥中磺胺类ARGs在出水口中的绝对含量高于入水口(高0.2~1.1个数量级), 且在出水口底泥中的微生物丰度[图 1(a)]也高于入水口, 推测水源水入水口ARGs高于出水口可能是由于含ARGs微生物被水中悬浮物吸附而沉降导致的.若该水源地出水口底泥受到扰动, 会增加水源水中ARGs的含量或含抗性基因微生物数量.因此, 建议定期清除取水口底泥, 有助于减小对饮用水厂去除该类污染物压力和降低对饮用水安全的潜在威胁.

图 1 饮用水源中磺胺类ARGs及intI1基因的绝对含量 Fig. 1 Absolute abundance of sul ARGs and intI1 in drinking water source

图 2 饮用水源水中sul及intI1基因的相对含量 Fig. 2 Relative abundance of sul ARGs and intI1 in drinking water source

2.3 磺胺类ARGs在饮用水源水中的季节变化特征

磺胺类ARGs的绝对含量在该饮用水源水中的季节分布特征如图 1所示, sul1在夏季的检出含量范围为5.4×105~6.4×105 copies·mL-1, 比其余季节高0.1~0.8个数量级.这与Luo等[13]在天津海河流域中sul1在夏季的检出含量最高一致. sul2随季节变化无明显趋势; intI1基因则在冬季的检出含量范围为3.4×105~6.8×105 copies·mL-1, 高于其余季节0.8~1.7个数量级, 这与前期在珠江流域[22]的研究均一致.该饮用水源水中磺胺类ARGs相对含量的季节分布特征如图 2所示, sul1在夏季的相对含量要高于其他季节, sul2则是在春季的相对含量高于其他季节, 这与Pruden等[16]在北科罗拉多的研究中发现sul2在2月的相对含量高于其他月份相一致, intI1则呈现无明显规律.水源水中ARGs的季节分布特征主要受到季节温度变化, 微生物活性及降雨量的稀释作用等因素的影响[13].天津海河流域发现夏季水体中的sul1含量明显高于冬季, 推测可能是由于夏季气温高, 水体中微生物快速增殖, 从而导致ARGs的检出含量增加[13].在美国北部科罗拉多州河流中, sul2在2月(冬季)的检出含量高于其他时期[16], 导致这种现象的原因可能有两方面：一是温度的影响.有研究发现sul2基因在经过嗜热厌氧消化处理后, 含量下降, 但sul1则没有变化[24], 推测sul2基因的削减作用在嗜热条件下较强, 冬季气温较低时则较弱, 导致sul2在冬季的检出含量高于其他季节; 另外一方面是由于冬季气温较低对含ARGs的转移有一定的影响, 有研究表明E. coli 425与E. coli NK5449之间发生结合转移频率随着温度的降低有所升高, 在35℃降至15℃的过程中, 结合频率升高了6.4(pH 8.1)和33.8倍(pH 7.1)[25], 冬季较低的温度加速sul2基因的转移, 推测是导致sul2基因在冬季的检出含量高于其他季节的原因之一.

2.4 磺胺类ARGs与SAs、可转移元件intI1的相关性

在前期研究的13种SAs在该饮用水源地中的分布特征[19]的基础上, 对磺胺类ARGs的相对丰度与13种SAs进行相关性分析(表 2).结果显示sul1基因与13种SAs总含量具有相关性, 相关系数为0.69(P < 0.05), 而sul2则与13种SAs含量无相关性(P>0.05).然而在温榆河流域内的研究中[1], 磺胺类ARGs与SAs具有较好的相关性(sul1：r=0.630, sul2：r=0.559, P < 0.05).考察磺胺类ARGs与单一SAs的相关性, 结果发现sul1基因与该饮用水源地中含量最高的磺胺甲唑(SMX)含量存在显著的正相关关系(相关系数为0.79, P < 0.01), 而sul2则与磺胺二甲嘧啶(SMZ)的含量正相关(相关系数为0.75, P < 0.05). Hoa等[26]采用60 μg·mL-1 SMX筛选磺胺类耐药菌时, 发现分离的耐磺胺类药物单菌携带sul1基因的频率(34%~60%)高于携带sul2基因(19%~51%). Mckinney等[27]在养殖泻湖区中磺胺抗性与抗生素的关系时, 发现sul1和sul2基因均与SMZ含量显著相关, 相关系数分别为0.88和0.80, P < 0.01.

表 2 磺胺类ARGs与SAs的相关性1) Table 2 Correlation between sulfonamide ARGs and SAs

磺胺类ARGs与基因可转移元件intI1的相关性如图 3所示. sul1、sul2基因与intI1基因均呈正相关, 相关系数分别为0.80和0.73(P < 0.05), 这与Chen等[22]在珠江流域的研究中, intI1与磺胺类ARGs的相关性结果(sul1：r为0.89~0.94; sul2：r为0.84~0.99)一致.整合酶基因3′端有编码磺胺类的ARGs, 整合子可介导该基因从一个整合子转移到另一个整合子, 或者在另一个整合子的基因盒中重组, 促使ARGs整合至细菌染色体中, 从而加速磺胺类ARGs的转移和增殖[10].磺胺类ARGs与intI1基因的相对含量的相关性, 也表明了可转移元件整合子在ARGs的水平基因转移中起到了重要的作用.同时, 磺胺类ARGs在环境中的高检出也可能是由于Ⅰ型整合子携带含有磺胺类ARGs的基因在细菌间传播扩散, 提高了ARGs的传播风险.然而sul1和sul2基因随intI1基因的变化不同, 这是由于intI1基因由5′保守端和3′保守端组成, 3′保守端由季铵盐化合物的耐药基因(qacEΔ1)、磺胺类耐药基因sul1, 以及功能不详的ORF框组成[28], 推测intI1基因与sul1基因的相关性更强.

图 3 sul1、sul2与intI1相对含量之间的相关性 Fig. 3 Correlation between relative abundance of sul1, sul2, and intI1

根据Martínez等[5]阐述的ARGs的风险等级中, 该饮用水源地中磺胺类ARGs能够编码对SAs抗性, 含量可达105 copies·mL-1, 与基因可转移元件intI1具有较高的相关性, 可将其列为该风险等级5级.在掌握了饮用水源地中SAs和磺胺类ARGs及Ⅰ型整合酶基因intI1的检出及分布特征基础上, 针对该饮用水源水中的磺胺类ARGs是否位于人类致病菌中以及水源水中抗生素抗性基因的水平转移机制值得进一步关注, 为更有效地遏制ARGs在水源水环境中的扩散, 保障饮用水源水质安全提供保障.

3 结论

(1) 华东地区某饮用水源地水源水和底泥中磺胺类ARGs(sul1和sul2)及Ⅰ型整合酶基因intI1均100%检出, 其中sul1基因检出含量最高.

(2) 磺胺类ARGs(sul1和sul2)及Ⅰ型整合酶基因intI1在该饮用水源地中呈现出一定的空间和季节分布特征, sul1、sul2及intI1的绝对含量在该水源水的入水口和出水口处无显著差异, 但在底泥中sul1、sul2及intI1在出水口中的绝对含量高于入水口, sul1在夏季含量高于其他季节.

(3) 该饮用水源水中sul1基因与13种SAs相关(r=0.69, P < 0.05), 且与SMX含量显著正相关(r=0.79, P < 0.01).

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