环境科学  2018, Vol. 39 Issue (8): 3901-3909   PDF    
引用本文
杜林森, 唐美铃, 祝贞科, 魏亮, 魏晓梦, 周萍, 葛体达, 王久荣, 邹冬生, 吴金水. 长期施肥对不同深度稻田土壤碳氮水解酶活性的影响特征[J]. 环境科学, 2018, 39(8): 3901-3909.
DU Lin-sen, TANG Mei-ling, ZHU Zhen-ke, WEI Liang, WEI Xiao-meng, ZHOU Ping, GE Ti-da, WANG Jiu-rong, ZOU Dong-sheng, WU Jin-shui. Effects of Long-term Fertilization on Enzyme Activities in Profile of Paddy Soil Profiles[J]. Environmental Science, 2018, 39(8): 3901-3909.
长期施肥对不同深度稻田土壤碳氮水解酶活性的影响特征
杜林森1,2, 唐美铃2,3, 祝贞科2,4, 魏亮2, 魏晓梦2, 周萍2, 葛体达2, 王久荣2, 邹冬生1, 吴金水2     
1. 湖南农业大学生物科学技术学院, 长沙 410128;
2. 中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室, 长沙 410125;
3. 中南林业科技大学生命科学与技术学院, 长沙 410004;
4. 湖南省农业科学院农业部长江中游平原农业环境重点实验室, 长沙 410125
收稿日期: 2017-11-25; 修订日期: 2018-02-24
基金项目: 国家重点研发计划项目（2016YFD0300902）；国家自然科学基金项目（41501321）；湖南省自然科学基金项目（2016JJ3132，2016JJ2136）；农业部长江中游平原农业环境重点实验室开放基金项目
作者简介: 杜林森(1994~), 男, 硕士研究生, 主要研究方向为土壤生态, E-mail:070220dn@sina.com
通信作者: 祝贞科, E-mail:zhuzhenke@isa.ac.cn; 邹冬生, E-mail:zoudongsheng2@sina.com
摘要: 与稻田土壤碳周转密切相关的酶活性是评价土壤肥力和肥料管理的重要指标.本研究选取秸秆还田（ST）、化肥（NPK）和不施肥（CK）的长期定位试验田，以10 cm的间距分段采集土壤剖面0~40 cm范围内的新鲜土样，利用96微孔酶标板荧光分析法，测定参与土壤碳氮转化过程关键酶β-1，4-葡萄糖苷酶（BG）和β-1，4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性，探讨不同施肥措施对不同深层土壤酶活的影响.结果表明，相比不施肥的土壤，施用化肥和秸秆土壤的BG酶活性分别提高了35%~118%和55%~342%；NAG酶活性分别提高了9%~30%和102%~484%.同时，随着土层深度的增加，土壤酶活性逐渐降低，0~20 cm深层土壤酶活性显著高于20~40 cm深层土壤.在不同施肥措施中秸秆还田可高程度影响稻田深层土壤.RDA分析表明土壤碳氮含量主要与0~20 cm的土壤酶活性有显著的正相关关系，与20~40 cm的土壤酶活性呈负相关关系.综上所述，随着土壤深度增加土壤微生物量和土壤酶活性显著降低.长期施肥显著提高了不同深层土壤生物量和土壤酶活性，其中秸秆还田作用尤为突出.因此，合理的秸杆还田有利于改善稻田深层土壤肥力，优化农田土壤养分循环，为作物生长提供良好的土壤环境.
关键词: 水稻土      长期施肥      土层      酶活性      碳氮水解酶      米氏方程     
Effects of Long-term Fertilization on Enzyme Activities in Profile of Paddy Soil Profiles
DU Lin-sen1,2 , TANG Mei-ling2,3 , ZHU Zhen-ke2,4 , WEI Liang2 , WEI Xiao-meng2 , ZHOU Ping2 , GE Ti-da2 , WANG Jiu-rong2 , ZOU Dong-sheng1 , WU Jin-shui2     
1. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China;
2. Key Laboratory of Subtropical Agriculture Ecology, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China;
3. College of Life Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China;
4. Key Laboratory of Agricultural Environment in the Middle Reaches of the Yangtze River, Ministry of Agriculture, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410125, China
Abstract: The enzyme activity, which is closely related to soil material cycling (mineralization, transformation, etc.), can reflect soil quality and nutrient status. In order to explore the effect of long-term fertilization on the enzyme activity in paddy soil profile (0-40 cm), soils with organic fertilizer and inorganic fertilizer, and non-fertilized soils were selected, and the carbon and nitrogen contents, and the activities of β-1, 4-glucosidase (BG), and β-1, 4-N-acetylglucosaminidase (NAG) in 10cm depths of soil were analyzed. The results showed that the activities of BG and NAG in the soils treated with inorganic fertilizer and organic fertilizer increased by 0.73-47.87 nmol·(g·h)-1 and 1.33-128.81 nmol·(g·h)-1, and 0.19-9.72 nmol·(g·h)-1 and 0.92-57.66 nmol·(g·h)-1, respectively, compared to those for non-fertilized soil. Soil enzyme activity decreased with increasing soil depth. Soil enzyme activity in soil from 0-20 cm was significantly higher than that of soil from 20-40 cm. Soil enzyme activities were significantly affected by long term fertilization at different soil depths. RDA analysis showed that soil carbon and nitrogen contents had significant positive relationships with the activities of BG and NAG in the 0-20 cm soil profiles, however, negative relationships were observed in the 20-40 cm soil profiles. The long-term application of organic fertilizer significantly increased soil biomass and enzyme activity, both of which decreased with the increase in soil depth. Long-term fertilization could increase soil nutrient contents, microbial biomass, and extracellular enzyme activities, which has important theoretical significance for optimizing farmland fertilizer management and improving soil productivity.
Key words: paddy soil      long-term fertilization      soil profile      enzyme activity      carbon and nitrogen hydrolytic enzyme      Michaelis-Menten equation     

在农业生产发展历程中, 由于对土地高强度的利用和高附加值的追求, 施肥已成为保障粮食安全和作物产量的关键措施.长期合理的肥料投入能有效提高土壤肥力, 促进微生物对土壤养分的活化, 提高作物对养分的利用效率[1].众多研究表明, 长期施肥能够促进土壤有机质的增加, 改善了土壤生态环境[2, 3].土壤是一个复杂的空间缓冲体系, 不同深度土壤理化性质和微生物环境迥然不同[4].长期培肥不仅对表层土壤养分状况有重要调控作用, 还作用于深层农田土壤.土壤剖面养分指标在一定水平上可以反映长期培肥效应的作用深度及其影响空间范围.尽管如此, 目前长期施肥对土壤生态环境差异的研究尚为缺乏, 还主要停留在耕作层施肥效益的探索, 其对不同深度土壤环境的影响及其微生物响应过程还不明确.

在土壤-植物系统的碳氮养分循环中, 土壤酶活性与土壤功能密切相关, 能够反映土壤养分状况, 是具有潜力的土壤生态功能指标[5].其中, β-1, 4-葡萄糖苷酶(BG)是参与土壤纤维素降解的重要酶, β-1, 4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)则参与了氮循环中几丁质和肽聚糖的降解过程, 这两种酶表征着土壤碳氮循环的重要过程[5, 6].农田生态系统中土壤酶活性与养分指标存在显著相关关系, 易受到灌溉、施肥等人为农田管理措施的影响[7].田善义等[8]的研究表明化肥和秸秆的施用均能够不同程度地提高BG和NAG等参与碳氮过程的关键酶活性, 改变土壤养分状况.同时, 也有研究表明不同施肥措施也影响着各个土层酶活性的大小.邱莉萍等[9]和Wang等[10]均发现, 随着土层加深, 不同施肥处理的土壤酶活性逐渐降低.以往的研究往往集中于施肥对酶活性的影响程度方面, 缺乏对不同深度土壤酶活性的关注, 而研究不同土层长期施肥的土壤酶活性有助于认识土壤在剖面尺度上对施肥措施的响应, 为揭示土壤生态过程的调控机制奠定理论基础.

在稻田生态系统中, 土壤耕作层一般为0~20 cm, 根系发达区为0~10 cm, 而施肥和灌溉等农田管理措施可间接影响深层土壤生态环境条件.然而, 长期施肥对土壤剖面的养分差异特征及酶活性的影响的研究较为缺乏.因此, 为深入理解土壤碳氮养分循环规律, 优化农田肥料管理措施, 本文特以38a长期施肥的定位试验水稻土为研究对象, 选取了两种碳氮过程关键酶(BG和NAG), 探讨化肥施用和秸秆还田对土壤酶活性的影响, 分析长期施肥条件下不同土层的养分转化及其土壤酶活性变化特征, 以期为后续深入研究土壤生态过程的酶学调控机制奠定基础.

1 材料与方法 1.1 供试土壤概况

供试土壤选自宁乡县农业技术推广中心(113°00′20″E, 28°25′16″N, 亚热带典型湿润气候, 年平均温度17.5℃, 降雨量1 300 mm, 日照1 663 h).该土壤选取于38年长期定位施肥试验田, 样地种植制度采用早水稻-晚水稻-冬闲制.本研究采用其中3种常规施肥处理, 分别是：①全化肥处理(NPK)：仅施氮磷钾化肥; ②秸秆还田+化肥处理(ST)：施用上一年度晚稻收割的秸秆和化肥; ③无肥对照(CK)：不施加任何肥料.选择0~10、10~20、20~30、30~40 cm不同土层的土壤碳氮相关酶(BG、NAG)作为研究对象.

种植小区面积为28.22 m2, 每个处理设3次重复, 随机区组排列.全化肥处理(NPK)每公顷分别施60 kg氮[(NH4)2SO4]、30 kg磷(P2O5)和60 kg钾(K2O); 秸秆还田+化肥处理(ST)以施用上季度秸秆为主, 若总氮量不足用化肥补足; 其中, 早季稻秸秆还田量为2 775.0 kg·hm-2, 晚季稻秸秆还田量为3 600.0 kg·hm-2.于2017年5月中旬, 对每个试验小区内采用五点法分别采集土样, 土壤剖面0~40 cm范围内按10 cm的间距分段取样.土样采集后在24 h内运回实验室, 在室内剔除根系等后过2 mm筛, 酶活性和微生物生物量的待测土样于4℃条件下保存并迅速测定; 部分土样风干后过0.15 mm筛后用于土壤基本理化性质测定(表 1).

表 1 土壤基本性质 Table 1 Characteristics of the paddy soils used in this study

1.2 指标测定及方法

用Mettler-toledo320 pH计按水土比2.5:1测定土壤pH; 土壤有机碳(SOC)和全氮(TN)采用碳氮元素分析仪(VARIO MAX C/N, 德国)测定(干烧法); 土壤溶解性有机碳(DOC, mg·kg-1)含量采用0.5 mol·L-1 K2SO4溶液浸提, 有机碳分析仪(岛津Vwp, 日本)测定; 土壤微生物生物量碳氮(MBC、MBN, mg·kg-1)均采用氯仿熏蒸提取, 其中MBC采用有机碳分析仪(岛津Vwp, 日本)测定, MBN采用流动注射仪(Fiastar 5000, 瑞典福斯)测定[11].土壤碱解氮(Alkeline-N)采用0.5 mol·L-1 K2SO4溶液浸提, 流动注射仪(Fiastar 5000, 瑞典福斯)测定[12].

两种土壤酶活性(BG与NAG)均采用96微孔酶标板荧光分析法测定[13].具体步骤如下：称取1.00 g新鲜土壤于乐扣盒中, 加入50 mL灭菌水, 180 r·min-1振荡30 min, 用磁力搅拌器边搅拌边加样50 μL于每孔, 并加入50 μL MES缓冲溶液(C6H13NO4SNa0.5), 设置底物浓度梯度为0、20、40、60、100、200、600、800 μmol·g-1, 每孔加底物(4-Methylumbelliferyl-N-Acety-β-D-Glucosaminide, 4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucoside)100 μL.同时设置0、100、200、500、800、1 200 pmol·孔-1的标线.分别于加入底物第0、30、60、120、180和240 min借助多功能酶标仪(Scientific Fluoroskan Ascent FL, Thermo)测定荧光强度.

1.3 数据处理和统计分析

测定的荧光强度差换算为酶活性, 之后采用米氏方程Michaelise-Menten进行拟合：

式中, V为反应速率[nmol·(g·h)-1]; Vmax为最大反应速率[nmol·(g·h)-1]; Km为底物亲和性(μmol·g-1); [S]为底物浓度(μmol·g-1).

式中, Ka为催化效率.

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0进行数据处理和统计分析(P < 0.05), 不同处理显著性用One-way ANOVA(单因素方差分析)进行检验, 采用Duncan多重比较分析组间差异, RDA(冗余分析)和方差分解通过Canoco5实现.

2 结果与分析 2.1 不同施肥处理下土壤碳氮含量的剖面分布

在经过38 a培肥处理后, 施用秸秆和化肥土壤中C、N含量是不施肥处理土壤的1.1~13.7倍.土壤C、N含量随着土壤深度的增加而逐渐降低, 在0~30 cm深层土壤中, 施用秸秆处理土壤C、N含量显著高于不施肥和单施化肥处理, 而在30~40 cm土壤中, 不同施肥处理之间C、N含量差异不显著(图 1).在0~30cm土层中, 和纯施化肥的土壤相比, 施用秸秆的土壤中DOC、MBC、SOC、Alkeline-N、MBN和TN含量分别提高了2%~8%、2%~53%、25%~33%、15%~35%、20%~63%和18%~25%;相比不施肥土壤, 秸秆的土壤中DOC、MBC、SOC、Alkeline-N、MBN和TN含量分别提高了19%~105%、15%~130%、22%~83%、39%~109%、88%~179%和31%~58%.长期施肥和土层均显著影响土壤DOC、MBC、SOC、Alkeline-N、MBN和TN含量变化, 而两者交互作用显著影响土壤DOC、MBC、SOC、Alkeline-N、MBN和TN含量变化(表 2).

图 1 不同施肥处理下不同深层土壤C、N的含量 Fig. 1 Soil C and N contents in different soil depths under different conditions of fertilizer application

表 2 施肥处理和土层深度对土壤碳氮含量影响的多重性比较1) Table 2 Effects of fertilization and soil depth on soil carbon and nitrogen contents

2.2 不同深层土壤酶活性对施肥的响应

长期使用化肥和秸秆提高了土壤葡萄糖水解酶(BG)和乙酰水解酶(NAG)活性, 相比不施肥的土壤, 施用化肥和秸秆的土壤BG酶活性分别提高了35%~118%和55%~342%; NAG酶活性分别提高了9%~30%和102%~484%;同时, 相比化肥处理, 秸秆提高了0~10 cm土壤BG酶活性, 却降低了10~20 cm土壤BG酶活性, 而秸秆处理提高了各个土层的NAG酶活性(图 2).

图 2 不同施肥处理条件下各深层土壤酶活性动力学 Fig. 2 Enzyme kinetics in soil profiles with different conditions of fertilizer application

由表 3可知, 土壤最大酶活性潜势(Vmax)随土壤深度的增加而逐渐降低; 从0~10 cm到30~40 cm, CK处理的BG酶与NAG酶明显降低, 化肥处理与秸秆处理呈现与CK处理相同的趋势.相比不施肥处理, 施用化肥土壤中BG酶提高了3.5倍(0~10 cm)、4.2倍(10~20 cm)、9.7倍(20~30 cm)、4.3倍(30~40 cm); NAG酶的最大酶活性提高了2.0倍(0~10 cm)、3.0倍(10~20 cm)、2.4倍(20~30 cm)、5.8倍(30~40 cm).相比施化肥处理, 施用秸秆的土壤中BG酶提高了1.6倍(0~10 cm)、4.3倍(10~20 cm)、4.3倍(20~30 cm)、2.8倍(30~40 cm); NAG酶的最大酶活性提高了1.6倍(0~10 cm)、2.7倍(10~20 cm)、2.2倍(20~30 cm)、4.5倍(30~40 cm).在3种不同施肥管理中, BG酶和NAG酶的Km均从土壤表层至深层缓慢改变, 无显著变化; 另外, 相较于不施肥和施用化肥的土壤相比, 施用秸秆的土壤对不同土层的土壤酶活参数Ka的影响更为显著.

表 3 不同施肥方式下各土层土壤酶活性动力学参数 Table 3 Dynamic parameters of soil enzyme activity in soils under different conditions of fertilizer application

2.3 土壤生物化学因子变化对土壤酶活性的影响

土壤酶活性的变化受到多重因素的影响.对影响不同施肥处理下不同深层土壤酶活性的主要因子(DOC、MBC、SOC、Alkeline-N、MBN、TN)进行RDA分析发现(图 3), 土壤碳氮含量与0~20 cm土壤中BG酶活性表现正相关关系, 尤其对0~10 cm土壤中BG酶活性的影响较强, 而与20~40 cm土壤中BG酶活性表现负相关关系.土壤碳氮含量对土壤中NAG酶活性影响在不同施肥处理条件下略有不同, 土壤碳氮含量主要与CK和ST处理中0~20 cm土壤中NAG酶活性表现正相关关系, 与NPK处理中20~30cm土壤中NAG酶活性表现出较强的正相关关系; ST处理中TN与20~30 cm土壤中BG和NAG酶活性表现出较强的正相关关系.

图 3 影响酶活性因素的RDA分析 Fig. 3 RDA analysis of factors influencing enzyme activities

3 讨论 3.1 长期施肥管理对水稻土壤酶活性的影响

土壤中氮磷元素是水稻生长的必需养分, 长期施用化肥和秸秆可以提高稻田土壤养分, 促进水稻生长, 增加根系分泌物和凋落物等向土壤中输入, 进而促进土壤微生物陈新代谢, 增加土壤微生物量[14, 15].本研究中, 长期施用化肥和秸秆导致土壤耕作层(0~30 cm)中碳氮含量以及微生物量碳氮显著高于不施肥处理(图 1), 表明不同肥料的投入均能够直接增加土壤碳氮含量, 同时也能够改善土壤理化性质, 更有利于土壤微生物生长繁殖, 进而增加土壤微生物量[16, 17].

土壤中的酶主要来源于土壤微生物和植物根系分泌, 也有部分依靠动植物残体分解而形成, 通常被看作评价土壤质量的生物活性指标, 在土壤生态系统中起重要作用[18, 19].化肥和秸秆的长期投入, 在增加土壤碳氮含量的同时, 提高了土壤酶活性, 加快土壤碳氮的周转[20].本研究表明长期施肥条件下, 土壤BG和NAG酶活性总的趋势是施用秸秆高于施用化肥, 施肥高于不施肥.相比较施用化肥处理, 秸秆施用对提高土壤酶活性效果更佳, 这是因为秸秆本身含有大量的酶类, 而且和组分简单的化肥相比, 秸秆可以为产酶微生物提供丰富多样的营养源, 促进了土壤的生化过程[3, 21]; 另外随营养元素的施入, 作物生长加速, 根系分泌物增加, 相应地土壤酶类活性增加[22].土壤中的大部分酶属于诱导酶类, 其活性和数量受底物可利用性和微生物自身对养分需求的限制[8].本研究中酶活性的变化趋势与微生物量碳氮, 有机碳和全氮的变化趋势基本一致, 这表明土壤微生物元素组成和土壤元素之间存在化学计量平衡, 微生物通过调控酶的分泌来增加其对限制性养分的吸收, 实现自身对养分吸收的平衡, 因此土壤酶活性也反映了微生物养分限制状况和养分有效性[23, 24].

3.2 水稻土壤不同深层酶活性对长期施肥的响应

同一土壤剖面上由于上、下土层性质存在差异, 特别是土壤容重、水分、有机质含量以及土壤孔隙等物理化学性质的不同, 造成微生物活性在不同土层间差别较大.土壤酶活性作为微生物活性的重要指标, 其在不同土层中存在显著的差异[25].本研究结果表明, 随着土层加深土壤BG和NAG酶活性逐渐降低.不同施肥处理下, 土壤酶活性及变化量在不同土层中的总体排列顺序为：0~10 cm＞10~20 cm＞20~30 cm＞30~40 cm, 这与Wang等[26]的研究结果相一致.间接说明随着土层的加深, 土壤的养分状况逐渐变差, 越不适合作物生长.

长期施肥处理不仅影响土体中碳氮总含量, 也影响各个土层中可利用态碳氮含量, 土壤C、N含量随着土壤深度的增加而逐渐降低, 施用秸秆处理和化肥土壤中C、N含量是不施肥处理土壤的1.1~13.7倍(图 1).受到长期施肥影响, 各土层碳氮含量产生不同程度变化[27], 土壤胞外酶作为碳氮转化的动力源, 对各个施肥处理下不同土层中碳氮含量的响应也有所不同[28]. RDA分析表明土壤碳氮含量主要与0~20 cm土壤酶活性有显著的正相关, 与20~40 cm土壤酶活性呈负相关关系.这可能是因为0~20 cm土壤中碳氮含量相对充裕, 满足微生物生长需求, 促进了胞外酶的释放; 而接近犁底层的20~40 cm土壤中养分输入较少, 微生物处于养分受限状态, 微生物活性较低, 所以因施肥而输入的养分破坏了微生物元素平衡, 降低了微生物对碳氮转化关键酶的分泌[28].此外, 酶活性随着土层加深而降低还可能因为深层土壤容重过大导致土壤三相比失调, 尤其是高容重土壤氧气含量低于低容重土壤, 致使底层土壤好氧微生物活性下降, 相应地酶活性下降[24, 29].因此, 在农业生产中可以通过深耕松土措施, 降低土壤容重, 改善土壤物理结构, 提高土壤酶活性, 从而改善作物生境提高产量[30].

4 结论

(1) 长期施用化肥和秸秆还田显著提高了土壤碳氮含量及其微生物量, 不同程度地增加了不同土层β-1, 4-葡萄糖苷酶(BG)和β-1, 4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性.同时, 相比化肥处理, 秸秆提高了0~10 cm土壤BG酶活性, 却降低了10~20 cm土壤BG酶活性, 而秸秆处理提高了各个土层的NAG酶活性.

(2) 稻田土壤中, 随着土层深度的增加, 土壤BG和NAG酶活性逐渐降低.相较于不施肥和施用化肥的土壤相比, 施用秸秆的土壤对不同土层的土壤酶活参数的影响更为显著.

(3) RDA分析发现, 在不同施肥处理中BG酶与0~20 cm土壤碳氮含量有显著的正相关关系, 与20~40 cm土壤碳氮含量有显著的负相关关系; 而NAG酶与不同深层土壤碳氮含量关系略有不同; ST处理中TN与20~30 cm土壤中BG和NAG酶活性表现出较强的正相关关系.

(4) 长期秸秆还田和施用化肥提高了土壤微生物生物量以及酶活性.相较于施用化肥, 秸秆还田对酶活性影响土壤深度更深.因此, 长期合理施肥以及土壤深耕等措施, 能够有效改善土壤物理结构, 增加土体以及深层土壤养分含量, 提高养分利用效率, 最终增加作物产量.

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