甲烷(CH₄)是全球主要的温室气体之一.稻田是大气CH₄排放的重要来源, 约占全球CH₄排放总量的5%~20%^[1].水稻作为世界三大粮食作物之一, 在中国具有广阔的种植面积, 约占世界水稻种植面积的22%^[2].我国稻田每年约排放CH₄为7.41Tg, 占全球稻田CH₄年排放总量的29.9%^[3].因此, 探索稻田CH₄减排措施对生态环境具有重要意义.已有研究发现硫酸盐对稻田生态系统CH₄的排放具有积极的调控作用, 如Dise^[4]和Gauci等^[5]发现施加Na₂SO₄可以使苏格兰高原泥炭湿地处理样地CH₄的排放量比对照样地减少30%~40%.章宪等^[6]的研究发现添加硫酸盐降低了福州平原稻田CH₄的排放通量, 并认为原因是硫酸盐可抑制产甲烷菌的活性. Gon等^[7]和Lueders等^[8]的研究发现稻田施用含硫肥料有抑制CH₄排放的效果.脱硫石膏是燃煤电厂烟气脱硫的副产物, 其主要成分是二水硫酸钙(CaSO₄·2H₂O), 且年产量达到8 000万t以上^[9], 目前主要应用在土壤改良和旱地植物生长等方面, 资源化程度还很低, 如不能得到妥善处理, 不仅浪费资源, 而且占用大量土地, 还会对环境形成新的危害, 因此探求脱硫石膏资源化利用新方向成为热点话题.而脱硫石膏与硫酸盐、硫肥相似, 都具有丰富的S元素, 鉴于以上对硫酸盐研究分析, 它具有降低稻田CH₄排放的潜力, 但尚无定论.

目前以上研究都主要集中在硫酸盐对稻田CH₄减排效果层面, 对产甲烷菌和甲烷氧化菌群落结构变化的研究关注还很少, 而这些是调控稻田土壤甲烷排放通量的关键生物学因子.脱硫石膏如果能降低稻田CH₄排放, 可能是通过改变土壤环境因子来影响相关微生物种群来实现的.谢军飞等^[10]的研究发现土壤产甲烷菌生长繁殖的最适pH值为6~8, 当pH值低于6或高于8时, 产甲烷菌的活性将显著降低, CH₄的排放通量也会随之减少. Saengkerdsub等^[11]的研究发现产甲烷菌分布于氧化还原电位低于-200 mV的厌氧环境中, 且-320 mV以下正常生长, -160 mV时可以生长繁殖但极为缓慢.李煜珊等^[12]认为稻田中Fe³⁺和SO₄^2-等电子受体存在时, 相应的微生物, 如铁还原菌、硫酸盐还原菌, 可以利用这些作为电子受体与产甲烷菌竞争底物.杨芊葆等^[13]的研究发现甲烷氧化菌的群落结构和比活性与土壤pH值、全氮和有机质含量呈显著正相关.因此, 研究脱硫石膏对稻田CH₄排放的影响需进一步研究土壤中产甲烷菌与甲烷氧化菌及两种微生物的比值的变化.

本文以田间试验为对象, 通过高通量测序和荧光定量PCR技术分析不同量脱硫石膏处理下稻田土壤细菌群落结构、多样性及产甲烷细菌和甲烷氧化菌功能基因丰度, 研究了不同量脱硫石膏施加对稻田CH₄排放的影响, 评价脱硫石膏对稻田微生物群落结构与功能影响及其与稻田CH₄排放的相关性, 以期为脱硫石膏在农业资源化利用上提供新思路及基础理论.

试验地点位于重庆市璧山区八塘镇(29°46′ N, 106°18′ E), 供试土壤为重庆市典型紫色土.基本理化性质为：pH值6.12, 有机碳14.75 g·kg^-1, 全氮1.48 g·kg^-1, 全硫0.69 g·kg^-1, 有效磷11.38 mg·kg^-1.供试脱硫石膏基本性质：pH值7.24, Ca含量122.80 g·kg^-1, S含量156.70 g·kg^-1, K含量0.19 g·kg^-1, Na含量0.03 g·kg^-1, Mg含量1.40 g·kg^-1; 重金属Cd含量0.14 mg·kg^-1, Pb含量12.40mg·kg^-1, Cu含量4.80 mg·kg^-1, As含量1.30 mg·kg^-1, Zn含量10.80 mg·kg^-1, Hg含量0.89 mg·kg^-1.本研究于2016年5月初进行, 试验设置5个施加脱硫石膏处理梯度, 即0、2、4、8、16 t·hm^-2, 标记为：FGDG₀、FGDG₁、FGDG₂、FGDG₃、FGDG₄, 每个处理3次重复, 共15个田间小区随机排列, 每个试验田小区面积为2 m×10 m=20 m².为防止水肥交互渗透且能独立排灌, 每个小区周围筑有高约20 cm的田埂, 小田之间有1 m宽隔离畦.水稻移栽前1d, 试验田排水后将脱硫石膏(粉末状)和肥料(碳酸氢铵:过磷酸钙=3:1)一次性均匀播撒在土壤中, 并翻耕充分混均, 然后灌水, 此后不再追肥.后期晒田、水份管理等农作活动与当地农民习惯保持一致.

于水稻灌浆期, 每个试验小区采用5点交叉取样法采集表层0~15 cm土壤并混均.去除植物根、石块等杂物后, 一部分土壤样品(约200 g)液氮低温冷冻并立即送回实验室置于-80℃冰箱保存, 用于土壤微生物分析, 另一部分土壤样品自然风干, 用于理化性质测定.

自然风干后的土壤过1mm筛用于测定土壤pH、有机质、全氮、有效磷、速效钾.土壤pH采用pH计(美国Sartorius公司PT-10)测定(土水比1:2.5);土壤有机质含量采用重铬酸钾容量法测定; 半微量开氏法测定全氮; 土壤有效磷采用0.5 mol·L^-1NaHCO₃浸提-钼蓝比色法测定; 土壤速效钾采用NH₄Ac浸提-火焰光度计法测定; 土壤氧化还原电位(Eh)用Eh仪(美国Sartorius公司TDR 300)现场测定.具体测定详细步骤参见文献[14, 15].

每个土样准确称取0.5 g土样(湿重), 使用Fast DNA^® SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals, USA)试剂盒按照说明来提取各土壤样品中的DNA.获取的DNA经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后, -20℃保存备用.

将冻存的稻田土壤DNA样品用干冰包装后, 送往上海美吉生物科技有限公司进行高通量测序.细菌16S rRNA基因, 在PCR仪(ABI GeneAmp^® 9700型)上进行扩增. PCR反应体系(20 μL)为: 5×FastPfu Buffer 4 μL, 5 mmol·L^-1 dNTPs 2 μL上下游引物各0.8 μL, FastPfu Polymerase 0.4 μL, DNA模板10 ng, BSA 0.2 μL, 无菌水补足20 μL.细菌16S rRNA基因上游引物338F：5′-ACTCCTACGGG AGGCAGCA-3′, 下游引物806R:5′-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′^[16]. PCR产物采用Illumina公司MiSeq测序系统上机分析.

本试验选取产甲烷菌的mcrA基因、甲烷氧化菌的pmoA基因进行实时荧光定量PCR分析, 反应在定量PCR仪iCycler iQ5(BioRad, 美国)上进行.反应体系为20 μL, 其中包含10 μL SYBR Green(TaKaRa, 日本), 0.2 μL Rox DYEII, 1 μL DNA模板, 前后引物(10 μmol·L^-1)各0.4 μL, 8 μL灭菌水.各基因定量PCR分析所用的引物和反应条件见表 1.

表 1 (Table 1)

表 1 荧光实时定量PCR扩增引物及反应条件 Table 1 Amplification primer and reaction conditions for quantitative PCR 基因 引物 序列(5′→3′) 定量PCR反应程序 采集信号温度/℃ 文献 mcrA MLf GGTGGTGTMGGATTCA CACARTAYGCWACAGC 94℃ 3 min, 94℃ 25 s, 50℃ 45s, 72℃ 60 s, 35cycles 72 [17] MLr TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT pmoA PmoA A189f GGNGACTGGGACTTCTGG 95℃ 5 min, 92℃ 1 min, 55℃ 1.5min, 72℃ 60 s, 35cycles 72 [18] PmoAmb661r CCGGMGCAACGTCYTTACC

表 1 荧光实时定量PCR扩增引物及反应条件 Table 1 Amplification primer and reaction conditions for quantitative PCR

CH₄排放通量采用静态暗箱/气相色谱法测定, 于水稻移栽成活后开始, 至8月中旬水稻生长期, 每4~6 d采样一次, 每次采样时间固定在上午的09:00~11:00.采用3个箱体平行采样, CH₄采样时间为关箱后的0 min、20 min.气体采集完毕后带回实验室并于10 h内测定完毕.以高纯氮为载气, 分子筛填充柱分离气样后用FID检测器测定CH₄浓度(安捷伦GC-7890A型气相色谱仪).

CH₄排放通量计算公式为^{[19, 20]}：

(1)

式中, F为CH₄的排放通量[mg·(m²·h)^-1]; ρ为标准状态下的气体密度(CH₄=7.162×10⁵ mg·m^-3); h为经过田间水层高度调整后采样箱顶部距水面的实际高度(m); dc/dt为采样过程中箱内CH₄浓度随时间的变化率(10^-6·h^-1); T为采样时箱内的实际温度(℃); α为转换系数(CH₄为12/16).

本试验数据采用Microsoft Excel 2003、SPSS 19.0和Origin 8.0软件进行处理分析和制图, 各处理差异显著性检验采用单因素方差分析(Duncan检验).

由表 2可知, 脱硫石膏处理组土壤pH值较对照提高, 且FGDG₂、FGDG₃、FGDG₄的处理较对照统计差异显著(P < 0.05);与对照相比, 脱硫石膏处理组土壤氧化还原电位(Eh)、有机质、速效钾增加, 但处理间统计差异不明显, 而全氮、有效磷无明显变化.

表 2 (Table 2)

表 2 稻田土壤理化性质1) Table 2 Physical and chemical properties of paddy soils 处理 pH Eh /mV 有机质 /g·kg-1 全氮 /g·kg-1 有效磷 /mg·kg-1 速效钾 /mg·kg-1 FGDG0 6.07±0.03c -252.5±11.2b 26.74±1.61b 1.37±0.2ab 10.97±1.01a 37.01±2.00a FGDG1 6.25±0.09bc -216.3±5.0a 27.39±0.41ab 1.39±0.2ab 10.39±0.40a 37.64±2.47a FGDG2 6.38±0.11b -224.8±17.0ab 29.49±1.64a 1.32±0.6b 11.55±0.88a 37.52±1.16a FGDG3 6.41±0.18b -238.3±22.0ab 27.95±0.93ab 1.36±0.3ab 10.73±0.62a 38.42±3.51a FGDG4 6.86±0.1a -245.0±10.8b 26.88±1.10b 1.40±0.5a 11.63±0.42a 38.71±1.91a 1)同一列中不同小写字母表示处理间在0.05水平差异显著, 下同

表 2 稻田土壤理化性质1) Table 2 Physical and chemical properties of paddy soils

如图 1所示, FGDG₀对照处理稻田CH₄的平均排放通量为14.45 mg·(m²·h)^-1, 脱硫石膏处理组CH₄平均排放通量分别为9.89、6.17、2.37、1.35 mg·(m²·h)^-1, 且FGDG₁ > FGDG₂ > FGDG₃ > FGDG₄, 比FGDG₀处理分别减少了31.56%、57.30%、83.60%、90.66%.说明添加脱硫石膏抑制了水稻生长期紫色土稻田CH₄的排放.通过单因素方差分析得知, 对照处理与FGDG₂、FGDG₃、FGDG₄处理之间差异性显著(P < 0.05).

图 1

Fig. 1

图 1 水稻生长期稻田CH4的平均排放通量 Fig. 1 Average methane fluxes from paddy fields during the rice-growing season

表 3是不同用量脱硫石膏处理土壤细菌的多样性指数. Chao指数反映微生物群落物种丰度, 而Shannon指数反映微生物群落的物种多样性.施加脱硫石膏后, FGDG₁和FGDG₂处理的土壤细菌Chao指数显著增加(P < 0.05), FGDG₄处理显著降低(P < 0.05);土壤细菌Shannon指数变化趋势同Chao指数相似, 且脱硫石膏处理组间差异性显著(P < 0.05), 土壤细菌Chao、Shannon指数随着脱硫石膏施加量增加而降低, 脱硫石膏施加量超过4 t·hm^-2后, 土壤细菌Chao、Shannon指数低于对照处理.

表 3 (Table 3)

表 3 不同施加脱硫石膏处理土壤群落多样性指数 Table 3 Diversity of soil with different concentrations of desulfurated gypsums 处理 Chao指数 Shannon指数 FGDG0 1 429±29bc 6.08±0.01c FGDG1 1 827±53a 6.85±0.03a FGDG2 1 522±97b 6.25±0.10b FGDG3 1 373±72c 5.83±0.06d FGDG4 1 027±41d 5.79±0.20d

表 3 不同施加脱硫石膏处理土壤群落多样性指数 Table 3 Diversity of soil with different concentrations of desulfurated gypsums

图 2为各处理土壤细菌在属水平相对丰度.可知施加脱硫石膏后, 土壤硫酸盐还原菌属相对丰度较对照提高13.56%~6.98%, 且FGDG₂、FGDG₃、FGDG₄处理统计差异显著(P < 0.05);亚硝化螺菌属相对丰度较对照降低3.99%~14.77%, 梭菌相对丰度较对照降低1.92%~9.62%, 但处理间差异均不显著; 地杆菌相对丰度较对照降低1.88%~49.48%, 且FGDG₁、FGDG₂处理统计差异显著(P < 0.05);红环菌除FGDG₁处理较对照显著降低47.73%, 其余处理无显著变化.

图 2

Fig. 2

图 2 不同用量脱硫石膏处理稻田土壤细菌群落属组成 Fig. 2 Composition of bacteria in paddy soils at the phylum level under application of different concentrations of FGD gypsum

利用荧光定量PCR技术分析了与稻田CH₄产生和排放相关的关键微生物功能基因的丰度.如图 3所示, 施加脱硫石膏显著降低了(P < 0.05)稻田土壤产甲烷菌mcrA基因丰度, 其中FGDG₃和FGDG₄处理差异性较小(P > 0.05)且降低幅度最大, 较对照分别降低了15.2%、15.8%; FGDG₁和FGDG₂处理的甲烷氧化菌pmoA基因丰度显著增加(P < 0.05), 分别增加了6.2%、2.1%;脱硫石膏处理组的pmoA/mcrA比显著增加(P < 0.05), 且随着施加量提高而增加, 呈现FGDG₄ > FGDG₃ > FGDG₂ > FGDG₁的趋势, 其中FGDG₄处理较对照增加了20.9%.

图 3

Fig. 3

图 3 不同用量脱硫石膏处理的土壤中甲烷氧化菌基因(pmoA)和产甲烷菌基因(mcrA)拷贝数对数及其比值 Fig. 3 Abundance of the methanotrophic gene pmoA and methanogenic gene mcrA, and the pmoA/mcrA ratio in paddy soil relative to gypsum treatment

表 4为稻田土壤功能基因拷贝数及相关微生物相对丰度与CH₄平均排放通量相关性分析.可知, 土壤中硫酸盐还原菌门相对丰度与CH₄平均排放通量呈显著性负相关(P < 0.05), 其它菌种与CH₄平均排放通量相关性很低, CH₄平均排放通量与产甲烷细菌mcrA基因拷贝数呈显著性正相关(P < 0.05), 与pmoA/mcrA比呈显著负相关(P < 0.05), 而与甲烷氧化细菌pmoA基因拷贝数的相关性不显著.

表 4 (Table 4)

表 4 稻田土壤功能基因拷贝数及相关微生物相对丰度与CH4平均排放通量的相关系数1) Table 4 Correlation coefficients of soil functional gene copy number and relative abundance of related microorganisms to average CH4 fluxes in paddy fields 项目 CH4平均排放通量 mcrA基因拷贝数 0.745* pmoA基因拷贝数 -0.411 pmoA/mcrA比 -0.717* 硫酸盐还原菌相对丰度 -0.676* 亚硝化螺菌属 0.211 地杆菌 -0.121 梭菌 0.117 红环菌 -0.202 1)*表示在0.05水平(双侧)上显著相关

表 4 稻田土壤功能基因拷贝数及相关微生物相对丰度与CH4平均排放通量的相关系数1) Table 4 Correlation coefficients of soil functional gene copy number and relative abundance of related microorganisms to average CH4 fluxes in paddy fields

本研究发现施加不同量脱硫石膏能够增加稻田土壤细菌丰富度和多样性, 与李凤霞等^[21]的研究发现施加2.5~7.5 g·kg^-1的脱硫废弃物能够显著增加土壤微生物功能多样性和姜美玲^[22]发现施加0.6~1.2 g·kg^-1脱硫石膏对盐害土壤改良同时, 改善土壤微生物生长繁殖的环境, 细菌数量较对照提高11.11%~22.22%的结果一致.这是因为脱硫石膏中含有大量土壤缺乏的Si、S、Ca、Mo等元素, 可以提高试验土壤养分含量, 改善土壤理化性质, 提高土壤供肥性能和持水能力^[23], 为细菌生存和生长提供适宜微环境, 使土壤细菌种群多样性增加.但试验结果还发现随着脱硫石膏施加量增加, 土壤细菌丰富度和多样性逐渐下降, 可能原因是一方面由于脱硫石膏含有微量的Pb、Cd、As、Hg、Cu、Zn等重金属元素^[24], 过量施入稻田, 可能造成土壤重金属污染, 对某些细菌群落产生毒害作用; 此外, 土壤中过多的SO₄^2-会增加硫化物含量, 从而对土壤微生物产生毒害作用^[25]; 另一方面, 脱硫石膏本身为碱性, 且脱硫石膏具有一定的类石灰性^[26], 能提高土壤pH值.由表 2结果可知随着脱硫石膏用量增加, 土壤pH值不断提高, 从而降低了土壤的酸性, 致使酸杆菌这类嗜酸的细菌数量的降低.因此, 土壤中细菌多样性和丰富度逐渐下降.

本研究还发现稻田土壤中亚硝化螺菌属是主要的氨化细菌, 地杆菌、梭菌、红环菌是土壤中主要的铁还原菌.而在淹水厌氧环境中硫酸盐还原菌和铁还原菌与甲烷产生菌竞争乙酸盐和H₂^[27], 且NH₄⁺-N浓度较低时, CH₄可以在氨化细菌铵单氧化酶作用下被氧化^[28].研究结果可看出硫酸盐还原菌虽然在稻田土壤细菌中所占比例不高, 但对脱硫石膏用量提高响应最强烈, 其相对丰度随着脱硫石膏施加量增加而提高.原因为脱硫石膏带入大量SO₄^2-, 增加了硫酸盐还原菌的活性, 促进其生长^[29].土壤中地杆菌在脱硫石膏施加量为2~4 t·hm^-2时, 其相对丰度显著降低, 可能原因是Fe³⁺是铁还原菌电子受体, 而大部分硫酸盐还原菌可以将Fe³⁺作为电子受体异化还原Fe^3+[30].而随着脱硫石膏施加量增多, 在SO₄^2-和Fe³⁺共存的情况下, 硫酸盐还原菌优先把SO₄^2-作为电子受体^[31].

在水稻生长期, 脱硫石膏能够抑制水稻紫色土稻田CH₄的排放, 且抑制效果随着施加量增加而增强.土壤稻田CH₄排放包括CH₄产生、再氧化和传输3个过程^[32], CH₄是在严格厌氧的条件下, 土壤中的产甲烷菌利用氢(H₂)/CO₂及乙酸等基质还原生成的, 而产生的CH₄约有70%~85%在土壤氧化层和根际氧化膜中被甲烷氧化菌氧化^[33].因此, 脱硫石膏对CH₄的减排可能由于脱硫石膏抑制产甲烷菌的活性而使产甲烷菌的比例降低.本研究也发现脱硫石膏的施加可以显著降低产甲烷菌的丰度(P < 0.05), 增加甲烷氧化菌丰度, 造成稻田产甲烷菌丰度降低原因一方面可能是因为施加脱硫石膏后, 硫酸盐还原菌相对丰度增加, 而硫酸盐还原菌对乙酸和氢的亲和力比产甲烷菌更强, 可将SO₄^2-作为电子受体, 利用这些底物而获得能量^[34], 硫酸盐还原菌对产甲烷菌的竞争优势的增加, 造成产甲烷菌丰度减少; 另一方面是因为硫酸盐还原产物对产甲烷菌具有毒害作用, 限制了产甲烷菌的活性, 从而进一步抑制了CH₄的排放^[35]; 此外, 硫酸盐可以在厌氧环境中氧化CH₄, 发生CH₄+SO₄²→HCO₃^-+HS^-+H₂O反应^[36].甲烷氧化菌丰度增加原因可能由于脱硫石膏改变了土壤结构, 表 2的土壤理化性质结果显示脱硫石膏组土壤有机质增加, 而土壤有机质增加会促进土壤团粒状结构形成, 从而改善土壤通气性和孔隙度^[37], 这有利于氧的扩散, 使Eh值增加, 促进甲烷氧化菌生长.

相关性分析显示, 稻田CH₄的排放量与产甲烷菌丰度呈显著正相关(P < 0.05), 与甲烷氧化菌丰度呈负相关.这说明稻田CH₄的排放量还与土壤中甲烷氧化菌数量有关.已有研究表明pmoA/mcrA比值可较好地反映田间CH₄产生、氧化及排放之间的数量关系^[38], 分析结果发现施加脱硫石膏处理较对照处理提高了pmoA/mcrA比值, 且pmoA/mcrA比与稻田CH₄排放通量呈显著负相关(P < 0.05), 说明施加脱硫石膏对土壤中甲烷氧化菌的促进作用强于产甲烷菌, 有助于减少土壤CH₄排放.

本研究对脱硫石膏在农业中的应用提供了新的思路以及理论依据, 但脱硫石膏过多或长期施用, 脱硫石膏中重金属在土壤、植物中的富集存在潜在的风险.此外, 脱硫石膏带入大量SO₄^2-可能导致土壤板结, 长期使用会不会对土壤生态系统造成深远影响还有待研究.

(1) 脱硫石膏能改变土壤理化性质, 提高土壤pH、Eh, 增加有机质、速效钾含量.

(2) 施加脱硫石膏能提高稻田土壤细菌丰富度和多样性, 且随着施加量增加而降低.

(3) 施加脱硫石膏能增加土壤硫酸盐还原菌属相对丰度, 降低土壤产甲烷菌量, 能抑制稻田土壤CH₄排放.稻田土壤CH₄平均排放通量与产甲烷菌丰度呈显著正相关(P < 0.05), 与pmoA基因丰度呈负相关, 与pmoA/mcrA比和硫酸盐还原菌丰度呈显著负相关(P < 0.05).