2018, Vol. 39
2. 天津农学院农学与资源环境学院, 天津 300384
, ZHU Ke1,2 , LI Gang1
, LIU Hui-fen2 , WANG Jing1,2 , XIU Wei-ming1 , ZHAO Jian-ning1 , YANG Dian-lin1
2. College of Agriculture and Environmental Resources, Tianjin Agriculture University, Tianjin 300384, China
转基因作物商业化种植已经21 a, 其种植面积从1996的170万hm2增加到2016年的1.851亿hm2, 不仅为农民乃至整个社会带来了可观的经济效益, 同时带来了巨大的环境、健康和社会效益[1].转基因作物虽然具有广阔的发展前景, 但其环境安全性问题已引起国际上的广泛关注, 其对生态环境的潜在影响成为科学界研究的热点.
cry1Ab基因是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫晶体蛋白基因的一种, 其表达产物能够与靶标害虫中肠受体结合, 造成中肠崩溃, 最终导致害虫死亡[2]. epsps基因来源于土壤细菌(Agrobacterium spp. CP4), 该基因编码的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶是草甘膦抗性的主要来源[3]. 2种基因通过表达载体导入受体玉米植株获得转cry1Ab和epsps基因玉米, 赋予其抗虫和抗除草剂特性, 这种兼具多种优良性状的复合性状转基因作物已经成为未来的发展趋势[4], 转基因玉米作为生物技术产业化的重大成果, 对于作物抗虫和控制杂草等方面有着非常重要的生产意义, 已得到普遍应用[5].但在看到转基因玉米所带来的巨大利益的同时, 也不应忽视其对生态环境的潜在影响, 转基因玉米中外源基因所表达的蛋白分泌到土壤可能会对土壤微生物群落产生影响, 其根系分泌的转基因蛋白也可能对土壤微生物的数量造成一定的影响, 因此在推广前应进行全面的生态环境安全性评估[6].
土壤微生物是土壤生态系统最重要的组成部分, 在土壤营养元素循环、肥力形成和发展、生态环境改善等方面发挥极其重要的作用[7].土壤氮循环作为元素生物地球化学循环的重要组成部分, 直接关系到土壤质量、生产力和可持续利用.生物固氮构成氮循环的中心环节, 由固氮微生物催化完成, 能够将大气中的氮气还原成氨, 是土壤中有效性氮素的重要来源[8, 9].固氮微生物的数量和多样性变化直接反映土壤固氮效率和氮素循环的运转情况, 是衡量土壤质量的重要指标[10].转基因作物的外源表达产物随凋落物及根系分泌物等途径进入土壤后很可能会与固氮微生物发生相互作用[11], 因此充分认识转基因作物种植后土壤固氮微生物群落的变化, 能够为全面地认识转基因作物的环境安全性提供参考[12].
目前转基因玉米的环境安全性研究主要集中在对土壤动物群落结构[13]、土壤细菌多样性[14~18]、土壤真菌多样性的影响[19]、基因漂流[20, 21]和外源蛋白动态变化[22]等方面.固氮微生物在玉米土壤生态系统中的固氮率可达13 kg·(hm2·a)-1[23], 是除人工施肥外土壤氮素的重要来源, 在农田生态系统氮素循环平衡起着重要作用, 然而目前缺乏转基因玉米种植对土壤固氮微生物群落影响的研究.本文以兼具抗虫性和除草剂耐受性的转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5为研究对象, 采用qPCR和T-RFLP技术, 并结合统计学分析, 探讨其种植对土壤固氮微生物丰度和群落结构的影响, 结果对转基因玉米的环境安全性评价具有重要的参考价值.
1 材料与方法 1.1 供试土壤及样品采集土壤样品采集于北京大北农生物技术有限公司河北省试验基地, 位于唐山市玉田县陈家铺乡(E117°43′, N39°47′), 该区域气候类型为北温带大陆性季风气候, 年平均降雨量693.1 mm, 年平均气温11.2℃, 无霜期约为193 d.供试土壤为潮土, pH 8.28, 有机质13.09 g·kg-1, 全氮2.80 g·kg-1, 全磷0.53 g·kg-1, 硝态氮15.96 mg·kg-1, 铵态氮0.2 mg·kg-1, 速效磷1.25 mg·kg-1.
试验始于2015年, 供试材料转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5(TM)及亲本非转基因玉米DBN318(PM)均由北京大北农生物技术有限公司提供.采用随机区组设计, 每个处理各设置3次重复, 共6个10 m×15 m的小区, 小区间以非转基因玉米作为保护带, 宽度为5 m, 基地四周设有围墙, 周边为设施菜地, 无基因漂移风险.试验前样地的土地利用方式为小麦和玉米轮作, 均为非转基因常规品种.本试验于5月进行玉米播种, 采取垄施复合肥方式, 基肥占60%, 于种植前施入, 追肥占40%, 于拔节期施入, 期间按照当地常规操作进行田间管理, 全生育期不施用农药.
分别于拔节期(6月28日, J)、抽雄期(8月10日, T)、乳熟期(8月31日, M)和完熟期(9月28日, R)采集根际土(GJ)和非根际土(FGJ).根际土和非根际土采集方法参见王晶等的报道[22].每个生长时期将同一小区的根际土和非根际土分别充分混匀装入自封袋中, 放入低温样品储藏箱中带回实验室.土壤样品过2 mm筛后分为2部分, 一部分保存于-70℃冰箱中用于土壤微生物分子生物学分析, 另一部分用于土壤基本理化性质测定.
1.2 土壤基本理化性质测定土壤有机质、全磷、速效磷、pH和含水量(H2O)的测定参照文献[24]的方法.土壤全氮、硝态氮和铵态氮使用连续流动分析仪测定.测定结果见文献[25].
1.3 土壤DNA提取将存于-70℃冰箱中的土壤样品(根际土和非根际土, 2种玉米, 4个生长时期, 3次重复, 共48个土壤样品), 采用PowerSoilTM Total DNA Isolation试剂盒(Mo Bio Laboratories, Solana Beach, CA, USA)提取DNA, 每个样品称取0.25 g, 提取步骤参照试剂盒说明书, 最后用100 μL ddH2O洗脱. DNA的质量采用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检验, 并采用NanoDrop分光光度计(NanoDrop Technologies, USA)测定浓度, DNA样品存储在-70℃冰箱中.
1.4 荧光定量PCRnifH基因丰度的qPCR分析采用SYBR Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)(TaKaRa)试剂盒于Stratagene Mx3005P Real-Time PCR System上进行, 使用的引物和扩增条件见表 1.反应体系25 μL, 其中1.0 μL 20倍稀释的DNA模板加入包括12.5 μL SYBR Premix Ex TaqTM Buffer, 0.5 μL上下游引物(10 μmol·L-1), 0.5 μL ROX Reference dye Ⅱ, 0.05 μL T4 gene 32 protein(5 g·L-1)(Roche)的反应液中, 用灭菌ddH2O补足至总体积为25 μL.以灭菌ddH2O作为无模板对照(No Template Control, NTC), DNA样品和NTC各3次重复. qPCR反应最后绘制熔解曲线(60~95℃, 每扫描一次温度增加0.5℃).参照Stempfhuber等[26]的方法制作标准曲线, 采用10倍连续稀释的阳性质粒被用作模板进行qPCR(每个稀释梯度均设3次重复), nifH基因的扩增效率范围在86.2%~87.5%之间, R2为1.000.
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表 1 PCR所用的引物序列和反应条件 Table 1 Primer sequences and reaction conditions used for PCR |
1.5 末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)
土壤固氮细菌nifH基因的多样性分析采用T-RFLP方法进行, 使用的引物和扩增条件见表 1, 其中上游引物PolF的5′采端用6′-FAM荧光标记.反应体系如下：50 μL的PCR反应扩增体系包括：5×Buffer 10.0 μL, MgCl2(25 mmol·L-1) 3.0 μL, dNTPs(2.5 μmol·L-1 each) 2.0 μL, 上下游引物(10 μmol·L-1)各2.0 μL, BSA(20 g·L-1)(TaKaRa) 1.0 μL, GoTaqTM Hot Start Polymerase(5 U·L-1)(Promga, USA) 0.25 μL, 1.0 μL DNA作为模板, 加灭菌ddH2O补至50 μL, 每个样品各3次重复, 并以灭菌ddH2O作为无模板对照.将3次重复的扩增产物混合, 用Wizard SV Gel and PCR Clean-UP System试剂盒纯化(Promega, USA), 采用限制性内切酶HaeⅢ(TaKaRa)进行酶切, 反应条件为37℃酶切3 h.酶切产物送生工生物工程(上海)股份有限公司检测.
1.6 数据分析将检测所得T-RFLP图谱中相差1 bp以内的片段归为同一T-RF[29], T-RF丰度(relative abundance, Ra)用相对峰值表示[30], 并去除Ra小于1%的T-RFs, Ra大于10%的T-RFs为该样品的优势种群[31].生物多样性用Shannon指数(H)和Evenness指数(EH)评价.
采用SPSS 22.0进行统计分析, 多组处理间的显著性分析采用单因素方差分析(Duncan检验)法进行比较, 两组处理间的数据比较采用独立样本的t检验. PCA分析采用SPSS 22.0软件进行, 相关图采用Origin 9.0绘制.采用CANOCO for Windows 4.5.1的冗余分析确定土壤固氮微生物群落结构与土壤环境因子的关联关系, 并应用蒙特卡洛检验进行显著性分析(P < 0.05).
2 结果与分析 2.1 土壤固氮细菌nifH基因丰度的qPCR分析土壤固氮细菌nifH基因丰度变化如图 1所示.其中根际土中, 亲本玉米固氮细菌nifH基因丰度范围为3.86×107~5.50×107 copies·g-1, 转基因玉米固氮细菌nifH基因丰度范围为3.42×107~7.02×107 copies·g-1.而非根际土中亲本玉米固氮细菌nifH基因丰度范围分别为3.42×107~6.07×107 copies·g-1, 转基因玉米固氮细菌nifH基因丰度范围为2.99×107~5.36×107 copies·g-1.显著性分析表明, 同一生长时期亲本玉米和转基因玉米根际土固氮细菌nifH基因丰度间均无显著差异(P > 0.05), 非根际土的分析结果与根际土相同.亲本玉米和转基因玉米根际土和非根际土固氮细菌nifH基因丰度随生长时期整体呈现先升高后降低的变化趋势(除亲本玉米根际土外).
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图 1 不同生长时期土壤固氮细菌nifH基因丰度变化 Fig. 1 Abundance changes of the soil diazotrophic nifH gene in different growth stages |
由表 2可见, PM根际土固氮细菌nifH基因丰度在拔节期和完熟期高于TM, 而在抽雄期和乳熟期相反, 但差异均不显著(P > 0.05), 非根际土的分析结果与根际土基本一致(除乳熟期PM高于TM), PM与TM间差异同样不显著(P > 0.05).同时发现同一种玉米同一生长时期根际土和非根际土固氮细菌nifH基因丰度间均无显著差异(P > 0.05).
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表 2 土壤固氮细菌nifH基因丰度显著性分析 Table 2 Significant analysis of abundance of the soil diazotrophic nifH gene |
以上研究结果说明转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5种植对土壤固氮细菌nifH基因丰度无显著影响, 生长时期是引起土壤固氮细菌nifH基因丰度变化的最主要因素.
相关分析表明(表 3), 根际土固氮细菌nifH基因丰度与有机质含量表现为极显著正相关关系(P < 0.01), 与总氮含量表现为显著正相关关系(P < 0.05);非根际土固氮细菌nifH基因丰度与有机质含量同样表现为极显著正相关关系(P < 0.01).综合上述结果说明, 土壤有机质是驱动土壤固氮细菌nifH基因丰度变化的关键因子, 而且根际土固氮细菌nifH丰度还受总氮影响.
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表 3 nifH基因丰度与基本理化性质相关性分析1) Table 3 Correlation coefficients for relationships between nifH gene abundance and basic physicochemical properties of soil |
2.2 土壤固氮细菌群落的T-RFLP分析
T-RFLP图谱显示(图 2), PM和TM土壤中共获得14种不同长度的T-RFs.其中43 bp和155bp的片段所代表的物种为所有土壤共有的优势种群, 它们的相对丰度均高于其他T-RFs.在同一生长时期, PM根际土中43 bp和155 bp片段的相对丰度与TM无显著差异(P > 0.05), 非根际土与根际土的分析结果相同.在根际土中, 39 bp片段在拔节期PM中为优势片段, 而在TM中虽不是优势片段, 但两种玉米的相对丰度无显著差异(P > 0.05), 而69 bp片段在抽雄期和乳熟期中, 158 bp片段在拔节期中, 180 bp在乳熟期中, 180 bp在完熟期中的分析结果均与39 bp片段的相同, 两种玉米的相对丰度均无显著差异(P > 0.05).在非根际土中, 19bp片段在抽雄期PM中为优势片段, 而在TM中虽不是优势片段, 但两种玉米的相对丰度无显著差异(P > 0.05), 39 bp片段在乳熟期中, 158 bp片段在完熟期中, 180 bp片段在完熟期中, 360 bp片段在完熟期中的分析结果均与19bp片段的相同, 两种玉米的相对丰度均无显著差异(P > 0.05).分析表明, TM和PM各T-RFs的相对丰度在同一生长时期和土壤样品采集区域间差异均不显著, 说明转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5种植对土壤固氮细菌群落结构无显著影响.
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图 2 不同生长时期土壤固氮细菌nifH基因的限制性酶切片段和相对丰度 Fig. 2 Average relative abundance of T-RFs of the soil diazotrophic nifH gene in different growth stages |
根据T-RFLP图谱中片段的种类和峰值, 计算出土壤固氮细菌的Shannon指数和Evenness指数.由表 4可见, PM和TM根际土固氮细菌的Shannon指数变化均表现为先升高后降低, PM抽雄期最高, TM乳熟期最高, 而PM最低值出现在完熟期, TM最低值出现在拔节期; 非根际土中, 2种玉米的Shannon指数变化同样表现为先升高后降低, 最高值均出现在乳熟期, 而PM最低值出现在完熟期, TM最低值出现在拔节期. PM和TM根际土固氮细菌的Evenness指数变化均表现为先升高后降低, 分别在乳熟期和拔节期最高, PM和TM非根际土固氮细菌的Evenness指数变化与根际土相同.显著性分析表明, 相同生长时期TM和PM根际土固氮细菌的Shannon指数之间均无显著差异(P > 0.05), Evenness指数也均无显著差异(P > 0.05), 非根际土的分析结果与根际土相同.说明土壤固氮细菌的Shannon指数和Evenness指数受转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5种植的影响不显著, 而随生长时期变化明显.
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表 4 不同生长时期土壤固氮细菌的多样性指数 Table 4 Diversity index of soil nitrogen-fixing bacteria in different growth stages |
2.3 土壤固氮细菌群落的PCA分析
PCA分析结果表明(图 3), 同一生长时期, 根际土PM和TM固氮细菌群落组成在PC1和PC2轴上均未发生明显分离, 非根际土PM和TM固氮细菌群落同样未发生明显分离, 表明转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5土壤固氮细菌群落结构与亲本玉米DBN318无显著差异.
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图 3 不同生长时期土壤固氮细菌群落结构的PCA分析 Fig. 3 PCA analysis of the community structure of soil nitrogen-fixing bacteria in different growth stages |
根际土固氮细菌群落结构的RDA分析结果显示[图 4(a)], 前两轴可解释nifH基因多样性变化的78.3%.土壤硝态氮含量(P=0.002)、pH(P=0.024)和铵态氮含量(P=0.036)与根际固氮细菌群落组成显著相关.非根际土的RDA分析结果显示[图 4(b)], 前两轴可解释nifH基因多样性变化的84.1%, 土壤pH(P=0.008)、全磷含量(P=0.034)、铵态氮含量(P=0.048)与非根际土固氮细菌群落组成显著相关.综合分析认为, 影响土壤固氮细菌群落结构的主要因素是pH和铵态氮.
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图 4 不同生长时期土壤固氮细菌群落结构的RDA分析 Fig. 4 RDA analysis of the composition of soil nitrogen-fixing bacteria in different growth stages |
土壤微生物作为生态系统的重要组成部分, 与土壤的结构和稳定性息息相关[32], 对土壤微生物影响的研究成为转基因作物风险评估的重要内容之一.固氮微生物是土壤生态系统氮素固定的主要执行者, 对土壤生态系统氮素循环平衡起着关键作用.本研究通过对转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5种植后土壤固氮细菌的丰度和多样性变化的分析, 探讨了转基因玉米种植对土壤固氮细菌群落丰度和结构的影响.
对土壤固氮细菌nifH基因丰度分析发现, 无论是根际土, 还是非根际土, 在4个生长时期PM和TM之间均无显著差异(P > 0.05), 说明转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5种植对土壤固氮细菌nifH基因丰度无显著影响.与朱银玲[33]对转epsps基因抗虫抗除草剂大豆种植后土壤nifH基因丰度变化的研究结果一致. PM和TM土壤固氮细菌nifH基因丰度随生长时期均呈现先升高后降低的变化趋势, 其中PM和TM根际土固氮细菌nifH基因丰度均在乳熟期最高, 完熟期最低; 而PM和TM非根际土固氮细菌nifH基因丰度最高值分别出现在乳熟期和抽雄期, 拔节期最低.根系分泌物是影响固氮微生物的重要因素[34], 在生理活动旺盛的生长时期, 玉米植株体生长较快, 向土壤释放的根系分泌物也不断增加, 为固氮微生物提供了充足的碳源, 促进了固氮微生物的生长, 固氮细菌nifH基因丰度表现为与生长时期密切相关.
相关分析表明, 土壤固氮细菌nifH基因丰度与有机质含量极显著正相关, 与侯海军等[35]对水稻田的研究结果一致.分析认为, 生物固氮是一个耗能还原过程(打破N≡N), 因此更偏爱以还原态碳为能源的基质[36], 土壤有机质的增加可以提高固氮酶的活性, 并促进固氮微生物的生长.固氮酶对氧高度敏感, 氧的存在可使大多数固氮菌的固氮酶不可逆失活, 土壤水分通过调节微环境中氧的水平而影响着生固氮的效率[37]. Keuter等[38]对草地生态系统研究认为高水分通过降低土壤的通气性从而减少对固氮酶活性的抑制.但Burgoyne等发现[39], 春季解冻带来的高水分厌氧条件会降低固氮速率, 因而5月(高水分)土壤的固氮速率小于8月.这种变化是否与农业生态系统中氮肥的投入以及相应产生的多种土壤特性次生效果有关, 具体机制有待进一步研究.
T-RFLP结果表明, 不同生长时期土壤中不同T-RFs所占比例变化虽然各不相同, 但是优势种群组成结构未发生明显改变, 这些片段比例的变化反映了不同生长时期土壤中固氮细菌群落结构的整体变化趋势, 说明转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5土壤固氮细菌群落结构与亲本玉米DBN318无显著差异.进一步对Shannon指数和Evenness指数分析发现, 同一生长时期TM和PM之间根际土固氮细菌nifH基因的Shannon指数均无显著差异(P > 0.05), 非根际土的分析结果与根际土相同; 无论根际土还是非根际土, 土壤固氮细菌nifH基因的Evenness指数均无显著差异(P > 0.05). PM和TM根际土固氮细菌的Shannon指数变化均表现为先升高后降低, PM抽雄期最高, 而TM乳熟期最高; 非根际土中, 2种玉米的Shannon指数变化同样表现为先升高后降低, 最高值均出现在乳熟期. PM和TM根际土固氮细菌的Evenness指数变化均表现为先升高后降低, 均在乳熟期最高, 在拔节期最低, 非根际土的分析结果与根际土相同.说明转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5土壤固氮细菌的Shannon指数和Evenness指数与受体玉米DNB318无显著差异, 生长时期较土壤样品采集区域对Shannon指数和Evenness指数的影响更为明显.
PCA分析结果表明转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5土壤固氮细菌群落结构与亲本玉米DBN318无显著差异, 与王丽娟等[40]的研究认为耐除草剂转基因大豆根际土壤固氮微生物群落结构与亲本无显著差异的结果一致.而有研究表明, 在不同生育时期土壤固氮微生物群落多样性及丰度有不同的表现, 可能是由于玉米在抽雄期和乳熟期生长旺盛, 其根系分泌物增多为固氮微生物的增长提供更多的养分, 促进了固氮微生物的生长, 造成固氮微生物的数量及多样性增加. RDA综合分析结果认为, 土壤pH和铵态氮含量是调控土壤固氮细菌群落结构变化的关键因子. pH是影响土壤固氮微生物的重要参数[41], pH越高的土壤越有利于固氮细菌的活性, nifH基因丰度越高[42].铵态氮是土壤中重要的矿质氮, 显著影响土壤固氮微生物的群落结构, Wang等[43]对江苏常熟水稻小麦长期轮作试验地调查发现, 固氮菌群落结构受土壤铵态氮变化的显著影响, 与本研究的结果一致.
4 结论转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5对土壤固氮细菌nifH基因丰度无显著影响.土壤固氮细菌nifH基因丰度主要受生长时期的影响, 土壤有机质是驱动土壤固氮细菌nifH基因丰度变化的关键因子.转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5对土壤固氮细菌nifH基因多样性无显著影响.土壤固氮菌群落结构变化是土壤铵态氮、pH、全磷和硝态氮之间相互关联共同影响的结果, 其中土壤铵态氮和pH与固氮细菌群落关系最密切.
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