2018, Vol. 39
2. 天津农学院农学与资源环境学院, 天津 300384
2. College of Agronomy and Resources Environment, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China
氧化亚氮(N2O)是重要的温室气体之一, 其增温态势是二氧化碳(CO2)的310倍左右, 工业化以来大气中N2O的含量从270 nL·L-1增加到322.5 nL·L-1[1].与CO2和甲烷(CH4)不同的是N2O不仅会引起温室效应, 还会对臭氧层造成不可恢复的破坏, 对人类的生活健康造成威胁, 因此其含量变化及其对全球气候变化的影响备受关注[2].据估计, 70%的N2O排放来自于土壤, 其中, 农田土壤是N2O的主要来源[3].土壤中N2O的产生主要源于硝化作用和反硝化作用[4], 硝化作用由氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌共同完成, 其中氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)和氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)通过amoA基因产生的氨单加氧酶控制的氨氧化过程被认为是硝化反应的限速步骤, 土壤中氨氧化菌的研究通常利用amoA基因的相对丰度来代表其分布水平[5].反硝化作用即脱氮作用, 主要分为4个步骤:第一步是NO3-在nar基因编码的硝酸盐还原酶的作用下, 还原为NO2-; 第二步是NO2-在nir基因编码的亚硝酸盐还原酶的作用下还原为NO; 第三步是NO在nor基因编码的NO还原酶的作用下还原为N2O; 第四步是N2O在nos基因编码的N2O还原酶的作用下还原为N2[5, 6].其中, 亚硝酸还原酶是土壤反硝化过程的关键酶和限速酶, nirS与nirK基因作为调控亚硝酸还原酶的重要基因研究较为广泛[6].nosZ基因是反硝化微生物的标志性功能基因, 由它控制的氧化亚氮还原酶决定了土壤反硝化作用能否完全进行, 对N2O排放具有潜在的影响[7].因此探明土壤N2O排放机理并对相应的减排措施进行研究是我国农业应对全球气候变化的迫切需求.
生物炭是有机物料在低氧条件下经高温热解得到的一种富碳固态物质.它具有稳定性高、呈碱性、碳氮比较大等特点[8].生物炭能减轻土壤酸化, 提高氮肥利用率, 并且对土壤健康、作物产量、碳固存和温室气体(GHG)的减排等具有潜在益处[8, 9].多数研究表明施用生物炭能够显著减少N2O的排放[10~13], 并且有研究表明施用生物炭能够减少土壤N2O排放量的49%±5%[14].生物炭能够吸附土壤中的硝酸根(NO3-)和铵根(NH4+), 从而抑制硝化反硝化, 达到减排的效果.由于土壤是一个极为复杂的多样化体系, 微域环境差异较大, N2O排放具有很大的空间变异性, 一些研究显示添加生物炭对N2O排放无显著影响[15], 亦有研究发现生物炭导致N2O排放增加[16~18], 可能原因为生物炭种类及用量不同导致其对N2O排放产生不同的影响[19].以往研究多集中于生物炭对N2O的减排效果及与相关土壤性质的相关性分析, 如土壤水分、土壤温度、土壤pH、土壤质地等[20~23], 而结合土壤硝化反硝化微生物及其合成相关酶的功能基因来揭示土壤N2O排放机制的研究甚少[24~27].
因此, 本文以华北平原粮食主产区的农田土壤为研究对象, 采用盆栽实验和实时荧光定量PCR技术, 结合土壤理化指标、土壤氨氧化细菌(AOA-amoA、AOB-amoA)和反硝化细菌(nirK、nirS、nosZ)丰度, 综合分析生物炭施用量对土壤N2O排放的影响, 以期为华北农田合理施用生物炭进行固氮减排提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 实验设计实验于2015年3月27日开始, 6月5日结束.共设5个处理CK、C1:5%、C2:10%、C3:15%、C4:30%(质量分数).每盆装土10 kg, 底肥用量分别为N 200 kg·hm-2, P2O5 52.5 kg·hm-2, K2O 37.5 kg·hm-2, 折合每盆施用尿素(46%)1.94 g, 过磷酸钙(16%)1.76 g, 硫酸钾(50%)0.4 g.本实验采用的土壤取自山东省淄博市桓台县华北集约农业生态试验站0~10 cm土层土壤, 土壤类型为砂姜潮湿雏形土, pH值为8.1, 有机质含量为10.8 g·kg-1, 全氮含量为0.7 g·kg-1, 碱解氮含量为48.0 mg·kg-1, 速效磷含量为11.5 mg·kg-1, 速效钾含量为210.1 mg·kg-1.生物炭购于辽宁金和福农业开发有限公司.该生物炭原料为玉米秸秆, 在360℃厌氧条件下裂解24 h得到的黑色粉末, 生物炭密度为0.297 g·cm-3, pH值为8.2, 含碳量为65.7%, 含氮量为0.9%, 有效磷含量为0.08%, 有效钾含量为1.6%.将土壤过筛, 与生物炭和肥料混匀后装盆, 供试小麦品种为济麦22, 放置于田间进行野外培养, 尽量与田间条件保持一致.2015年3月29日第一次采集气体, 以后每隔5~7d采样一次, 直到实验结束.培养过程中视土壤干湿状况, 适量灌水, 每盆灌水量相同.
1.2 样品的采集和测定气体样品的采集采用静态暗箱法.盆钵由不锈钢板制作而成, 内圆直径为20 cm, 盆钵上口有1.5 cm深的凹型槽, 用以采样时注水与采样箱密封, 盆钵底部有若干直径为2 cm的小孔以渗漏降水.为使盆钵土壤温度与大田温度一致并减小盆钵间的温度差异, 盆钵的4/5高度埋入土壤.采集气体时将圆筒型采样箱套在盆钵凹型槽内, 将水注入凹槽加以密封.相应的采样箱为圆筒型, 高50 cm, 箱体直径与盆钵凹槽直径一致.箱体外侧包有一层海绵, 然后覆盖一层铝箔以减小采样时因太阳辐射所引起的箱内温度变化.气样用带有三通阀开关的塑料针筒采集, 各盆钵每次采样3个, 采样时间为上午09:00~11:00, 分别于罩箱后0、10、20 min采集, 样品量为50 mL.采用安捷伦气相色谱仪(Agilent 7890A)测定N2O气体浓度, 电子捕获检测器(ECD)检测N2O含量.
在采集气体样品的同时, 采集少量土壤样品, 一部分用于测定土壤含水量, 一部分用于土壤矿质氮(NH4+-N、NO3--N)的测定.其中土壤矿质氮采用CaCl2浸提-AA3流动分析仪测定; 土壤含水量采用烘干法进行测定; 土壤pH值采用pH计法测定.
首次和末次采集的土壤样品部分储存在-80℃冰箱用于土壤总DNA提取.土壤总DNA提取方法:用Fast DNA® SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals, 美国)进行土壤微生物总DNA的提取, 具体操作步骤按照试剂盒操作说明进行, 并用超微量紫外分光光度计(ND-2000, NanoDrop Technologies, 美国)测定DNA浓度和质量.然后用1%的琼脂糖凝胶电泳来检测所提DNA片段大小, DNA样品放于-80℃冰箱保存待用.
实时荧光定量PCR分析:本实验以土壤中氨氧化古菌amoA基因、氨氧化细菌amoA基因、亚硝酸盐还原酶(nirK、nirS)基因和一氧化二氮还原酶(nosZ)基因的拷贝数分别表示氨氧化古菌(AOA)、氨氧化细菌(AOB)、nirK、nirS和nosZ基因型反硝化细菌的丰度.利用荧光定量PCR(Real-time PCR)技术依次检测amoA、nirK、nirS和nosZ基因拷贝数, 即用SYBR® Premix Ex TaqTM(Takara, 日本)试剂盒, 在荧光定量PCR仪(CFX96型, Bio-Rad公司)上进行绝对定量PCR的分析, 具体PCR引物和扩增条件见表 1, 每个样品重复3次.荧光定量PCR的反应体系为10 μL, 其中包括9 μL的反应液, 1 μL DNA模板.9 μL的反应液包括前后引物(10 μmol·L-1)各为0.5 μL、3 μL超纯水和5 μL SYBR® Premix Ex TaqTM.分别以含有氨氧化古菌amoA基因、氨氧化细菌amoA基因、亚硝酸盐还原酶(nirK、nirS)基因和一氧化二氮还原酶(nosZ)基因的重组pGEM®-T载体作为标准质粒, 然后计算出标准质粒的拷贝数, 按照10倍浓度梯度进行稀释, 并以10-1~10-8浓度梯度的标准质粒作为模板, 进行实时荧光定量PCR扩增, 设置3个阴性对照, 反应的程序如表 1所示.将得到的结果以标准质粒拷贝数的对数值为纵坐标, 以不同浓度质粒的Cp值为横坐标建立出标准曲线, 并根据标准曲线计算基因丰度.
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表 1 实时荧光定量PCR扩增引物及反应条件 Table 1 Real-time PCR amplification of primers and reaction conditions |
1.3 数据处理与分析
N2O排放通量的计算公式如下:
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(1) |
式中, F为N2O排放通量, μg·(m2·h)-1; ρ为标准状态下N2O气体密度, 为1.977 g·L-1; h为箱高, m; 
N2O累积排放量的计算公式为:
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(2) |
式中, M为土壤N2O累积排放量, μg·m-2; F为N2O排放通量, μg·(m2·h)-1; i为采样次数; ti+1-ti为采样间隔天数.
利用Microsoft Office Excel 2016进行数据整理, 在Origin 8.5中进行绘图.利用SPSS 22.0进行数据分析, 采用单因素方差分析和LSD法比较不同处理间的差异, 利用Pearson相关系数检验N2O排放通量与土壤硝态氮、铵态氮、含水量、pH以及基因丰度等影响因子之间的相关性及显著性水平, 显著差异为P＜0.05, 极显著差异为P＜0.01.
2 结果与分析 2.1 N2O排放通量、土壤pH和土壤含水量图 1为N2O排放通量、土壤pH以及土壤含水量的变化曲线.整个实验过程中, N2O排放通量变化趋势基本一致, 总体表现为CK>C1>C2>C4>C3.实验初期, N2O排放通量最大, CK、C1、C2、C3和C4处理的排放通量依次为1576.6、1438.3、453.0、50.0和86.8 μg·(m2·h)-1.与CK相比, C2、C3、C4分别降低了71.2%、96.8%、94.5%(P＜0.01), C1与CK处理之间差异不显著(P＞0.05).4月18日灌水后, CK、C1处理在4月20日出现明显的排放峰各处理的排放通量依次为100.4、57.3、12.4、12.3和16.6 μg·(m2·h)-1, 其中C1、C2、C3、C4分别对比CK降低了42.8%、87.6%、87.7%、83.4%(P＜0.01).5月31日至实验结束, 各处理的N2O排放通量均有所提高且C1处理高于其它处理.在整个实验周期中, CK处理和C1处理排放量较为接近, 在各采样时期均远高于其它处理, C3和C4处理在各采样时期均表现出较低的排放量.
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图 1 不同处理N2O排放通量、土壤含水量和土壤pH的变化 Fig. 1 Variation in N2O emission fluxes, soil water content and soil pH under different treatments |
各处理土壤pH的变化趋势基本一致.土壤pH值变化范围在7.41~8.44之间, 总体表现为生物炭处理的土壤pH值均高于对照, C4、C3、C2和C1分别比对照平均高出0.08、0.03、0.10、0.08个单位.4月18日灌水后至5月12日期间, 高量生物炭处理波动较大, 4月28日至5月4日期间, C3、C4处理均显著高于CK及其它处理, 对比CK分别平均高出0.35、0.57个单位, 5月12日各生物炭处理均显著高于CK处理, 直至实验结束时.生物炭处理对土壤pH波动较大, 其中最高土壤pH和最低土壤pH均为C4处理.
由图 1可知各处理土壤含水量变化趋势基本一致, 其变化范围在2.0%~65.0%之间, 各处理之间差异不显著(P < 0.05).其中4月13日至5月12日期间, 由于灌水和降雨的影响, 土壤含水量波动较大, 各处理在4月28日出现明显的峰值, 然后逐渐降低, 5月12日后开始升高, 于5月25日出现新的峰值.
图 2为各处理N2O的累积排放量, C1处理在一定程度上提高了N2O累积排放量, 与CK处理相比, 差异不显著(P＞0.05), 而C2、C3、C4处理的N2O累积排放量分别比CK降低了62.6%、84.7%、80.6%(P < 0.05).说明施加生物炭能够降低土壤N2O的排放, 但N2O的累积排放量并没有随生物炭施用量的增加而减少.
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图 2 不同处理N2O累积排放量 Fig. 2 N2O cumulative emission under different treatments |
图 3为土壤NH4+-N和NO3--N含量的变化曲线.整体上, 各处理土壤NH4+-N含量均处于较低水平, 且变化趋势大致相同.与CK处理相比, 生物炭处理对土壤NH4+-N含量无显著影响.3月29日至5月4日期间, 各处理间对比波动较大, 生物炭处理与CK处理相比差异不显著.5月4日后各处理间差异逐渐减小, 且趋于平稳.各处理土壤NH4+-N含量均在5月31日出现明显的峰值, 且处理之间差异明显, 其大小顺序为C4＞C3＞C2＞C1＞CK, 各处理对比CK处理的增加幅度分别为12.7%、22.3%、28.0%、48.4%(P＜0.05).在6月5日实验结束时, 各处理土壤NH4+-N含量均再次降低.
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图 3 不同处理土壤NH4+-N和NO3--N含量变化 Fig. 3 Variation in soil NH4+-N and NO3--N concentrations under different treatments |
与土壤NH4+-N含量相比, 各处理土壤NO3--N含量较高(图 3).在3月29日至5月4日期间, 除C1处理外, 其它各处理的土壤NO3--N含量均高于CK, 与对照相比, C2、C3、C4处理的增幅分别为10.4%~145.6%、15.5%~177.3%和13.2%~240.1%(P＜0.05).5月4日后, 各处理土壤NO3--N含量逐渐趋于平稳直至实验结束, 在此期间各处理的NO3--N含量差异不显著.总体来看, 生物炭处理的土壤NO3--N含量分别比CK提高了9.0%、15.1%、15.7%、30.8%(P＜0.05), 并且C4处理显著高于其它处理.
2.3 生物炭对硝化反硝化功能基因丰度的影响 2.3.1 生物炭对amoA基因丰度的影响图 4为实验初期各处理土壤AOA-amoA基因的拷贝数, 其中C1、C2、C3、C4处理的AOA丰度均高于CK处理, 分别较CK处理高出11.4%、54.9%、102.3%和78.6%, 其中C2、C3、C4处理与CK, C1处理间均存在极显著性差异(P＜0.01), CK与C1处理之间差异不显著.实验末期, 各处理土壤AOA丰度的大小顺序为C1＞CK＞C2＞C4＞C3, 除C1处理的AOA丰度较CK处理略有增加, C2、C3、C4各处理的AOA丰度对比CK处理均表现出不同程度的减少, 其减少幅度分别为5.1%、14.2%、13.5%.C3、C4生物炭处理对比CK处理差异显著(P＜0.05).
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图 4 不同处理下氨氧化菌基因丰度的变化 Fig. 4 Variation in ammonia oxidizing bacteria gene abundance under different treatments |
各处理土壤AOB-amoA的拷贝数显著低于AOA-amoA(图 4).实验初期, 生物炭处理减少了AOB的丰度, C1、C2、C4处理的AOB丰度对比CK处理分别减少了12.1%、7.2%、28.3%(P＜0.05), C3处理与CK相比无显著差异.实验末期, 生物炭处理提高了AOB丰度, 其中C1、C2、C3、C4各处理的AOB丰度分别增加了34.9%、113.1%、21.1%、70.6%, 其中C3与CK间差异显著(P＜0.05), C1、C2、C4与CK间差异极显著(P＜0.01), 且除C1、C3间差异不显著外, 生物炭处理之间均达到极显著水平(P＜0.01).
2.3.2 生物炭对nirS、nirK和nosZ基因丰度的影响图 5(a)为各处理土壤nirS基因的拷贝数.实验初期, 除C1处理低于CK处理外, 其它处理的nirS基因拷贝数均高于CK处理, 其中C3、C4处理对比CK处理则提高了54.6%、86.0%(P＜0.01).实验末期, 除C3处理外, 各生物炭处理对比CK处理均不同程度地提高了nirS基因的拷贝数, 其中C1、C2、C4处理的nirS基因的拷贝数对比CK处理分别增加了110.2%、86.7%、93.3%, 差异达到极显著水平(P＜0.01).
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图 5 不同处理下反硝化细菌基因丰度的变化 Fig. 5 Variation in denitrifying bacteria gene abundance under different treatments |
各处理土壤nirK基因的拷贝数如图 5(b)所示.实验初期, C1、C2、C3、C4各处理的nirK基因拷贝数对比CK处理分别提高了274.7%、575.6%、571.1%、246.2%, 差异均达到极显著水平(P＜0.01).实验末期, 各处理的nirK基因拷贝数对比CK处理均有不同程度的降低(C4除外), 其中C1、C2、C3分别比CK降低了52.8%、80.5%、50.9%(P＜0.01), C4处理与CK处理相比, 差异不显著.
由图 5(c)可知, 实验初期, 生物炭处理均提高了土壤nosZ基因的拷贝数, C1、C2、C3各处理的nosZ基因拷贝数对比CK处理分别提高了85.4%、45.7%、28.3%, 且增幅随着生物炭施用量的增加而减小, 其中C1、C2、C3处理与CK相比差异显著(P＜0.05), 但C4处理与CK相比差异未达到显著性水平(P>0.05).实验末期, C1处理显著提高了土壤nosZ基因拷贝数(P＜0.01), 其它生物炭处理的nosZ基因拷贝数对比CK未达到显著性水平(P>0.05).
图 5(d)为各处理土壤(nirK+nirS)/nosZ比例.实验初期, C1、C4处理土壤(nirK+nirS)/nosZ的比例与CK相比, 具有显著性差异(P < 0.05).实验末期, 除C3处理对比CK降低了土壤(nirK+nirS)/nosZ比例外, 其他处理与CK相比均显著提高了土壤(nirK+nirS)/nosZ比例(P < 0.05).
2.4 N2O排放通量与各因素的相关关系分析N2O排放通量与土壤理化指标和各功能基因丰度的相关性分析见表 2.3月29日, N2O的排放通量与土壤AOA丰度和nirS基因丰度呈极显著负相关关系(P < 0.01), 与其它土壤理化指标以及其它基因的拷贝数均未达到显著性水平(P>0.05).6月5日, N2O排放通量与土壤NH4+-N呈显著正相关关系(P < 0.05), 与土壤含水量、nosZ基因的拷贝数呈极显著正相关关系(P < 0.01), 与其它因子以及其它基因的拷贝数均未达到显著水平(P>0.05).
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表 2 N2O排放通量与各因素的相关关系分析1) Table 2 Correlation analysis of N2O fluxes and various factors |
2.5 生物炭施用量与各功能基因丰度的相关关系分析
生物炭施用量与各功能基因丰度的相关关系分析见表 3.3月29日, AOA和nirS基因丰度与生物炭施用量呈极显著正相关关系, nirK基因丰度与生物炭施用量呈显著正相关.AOB和nosZ基因丰度与生物炭施用量呈显著负相关关系.6月5日, AOA丰度与生物炭施用量呈显著负相关关系, AOB丰度与生物炭施用量表现为显著正相关关系, nirS、nirK、nosZ基因丰度与生物炭施用量的相关性未达到显著性水平.
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表 3 生物炭施用量与各功能基因丰度的相关关系分析 Table 3 Correlation analysis of biochar application rate and functional gene abundance |
3 讨论
许多研究表明, 施用生物炭能够改变土壤理化性质如土壤pH、土壤含水量等[32, 33], 并通过吸附土壤中的铵态氮从而减少硝化作用的底物[34].本实验中, 虽然施用生物炭改变了土壤pH和土壤NH4+-N、NO3--N含量, 但与大田实验相比, 土壤含水量、土壤pH、NH4+-N、NO3--N含量与N2O排放通量以及生物炭施用量未表现出显著相关关系, 可能的原因是, 盆栽实验布置初期, 肥料一次性施入, 土壤养分和水分含量均较高, 短时间内整个土壤系统养分循环尚未得到平衡, 因此导致N2O排放通量与土壤理化指标不相关的结果.而在实验后期, 土壤养分消耗殆尽, 硝化反硝化作用进行缓慢, 土壤NH4+-N、土壤水分成为N2O排放的限制因子, 所以与N2O排放通量表现出显著的正相关关系.
我国北方旱地土壤春季土壤含水量较低, 硝化过程是N2O的主要来源, 反硝化作用产生的N2O较少[35].并且, 许多研究表明硝化作用主导了N2O排放[36, 37].盆栽试验结果显示, 生物炭的施用刺激了AOA和AOB的丰度的变化, 且AOA与生物炭施用量极显著正相关, AOB与生物炭施用量显著负相关.本实验中, AOA-amoA基因的拷贝数远大于AOB-amoA, 即AOA的丰度较AOB高1~2个数量级, 这一发现与前人研究[38]中碱性土壤条件下AOA丰度明显高与AOB的结果一致.不同环境中都能检测到高丰度的AOA, 但AOA对土壤硝化作用的贡献存在较大争议, 有研究发现当土壤中氨氧化微生物中AOA占据主导地位时[39], 施用生物炭会抑制氨氧化作用, 在实验前期, C3处理AOA丰度最高, 并且AOA丰度随生物炭施用量的增加而增加, AOA丰度与N2O排放通量呈极显著负相关表明, AOA-amoA基因的增多减少了N2O排放.实验前期, 生物炭处理的AOB丰度均保持较低水平.说明生物炭的施用导致AOA十分活跃, AOA与AOB形成竞争关系, 消耗了底物, 并对调节N2O排放起到重要作用.实验后期, 对照及低量生物炭处理AOA的数量高于其它各处理, 生物炭施用量与AOA丰度表现为显著负相关, 与AOB表现为显著正相关, 说明长期来看, 生物炭能促进AOB生长, 并抑制AOA生长, 与潘逸凡[26]的研究结果相同.对比基因丰度的前后变化不足以说明氨氧化微生物对生物炭的响应机制, 还需要针对土壤中AOA和AOB群落结构变化来进一步研究, 生物炭施用量如何影响氨氧化过程还需要更多研究来评估.
反硝化过程中, nirK、nirS和nosZ基因是被研究最多的反硝化功能基因.添加生物炭能够影响nirK、nirS和nosZ基因的相对丰度, 进而促使这3种基因型的反硝化细菌在反硝化作用中发挥了重要的作用.本实验中在N2O大量排放的实验前期, nirS、nirK基因与生物炭施用量显著正相关.虽然nosZ基因的拷贝数均高于对照, 但是nosZ基因与生物炭施用量显著负相关.说明生物炭施用量增加有利于nirS和nirK基因型反硝化细菌繁殖.实验前期, CK处理的nirK拷贝数处于较低水平, 生物炭处理对比CK处理则可以数倍地提高nirK基因的拷贝数, 其中C2、C3处理对比CK处理极显著提高了nirK基因的拷贝数, 说明土壤中nirK基因对中低量生物炭的响应更为敏感.但在实验后期, 处理的nirK基因丰度与生物炭施用量不具有显著相关关系, 可能原因是土壤中nirK基因丰度普遍较低, 易受pH以及其它环境因素的影响.反硝化作用中nirS基因为优势功能基因, 数量远高于nirK基因与潘逸凡[26]的研究一致.在王晓辉等[24]的盆栽试验中发现施用生物炭可显著提高nirK基因型反硝化细菌的丰度, 而在本实验中, 前期水肥充足时均可提高nirK、nirS和nosZ基因的拷贝数, 但是在实验后期土壤养分消耗殆尽以及含水量较低的情况下, 各处理的反硝化功能基因丰度均有所降低.在中性和偏碱性的土壤中N2O排放量与nosZ基因的拷贝数有着很大的相关性, 生物炭诱导的反硝化菌nosZ基因丰度增加使反硝化过程进行完全, 解释了生物炭对于N2O的减排潜力[27].但也有研究表明在DNA水平上反硝化基因(nirS、nirK、nosZ)与N2O排放无显著相关性, 但在mRNA水平上显著相关[40].在本实验中nirS基因的拷贝数与N2O排放极显著负相关, 而其它反硝化基因与N2O排放相关性较弱, 在本实验中C1处理的nosZ基因明显高于对照, 但排放量与对照接近, 并没有表现出减排作用.杨柳青[41]的研究发现施肥后AOB丰度增加形成了较强的N2O排放峰, 并且AOB与nirS拷贝数的减少与N2O减排同时发生与本实验结果相似.有研究表明, 生物炭添加极大促进了nosZ基因的转录数, N2O年排放量与nirS基因、nirK基因显著正相关[42], 施用生物炭可增加AOB、nirS基因和nirK基因丰度从而间接促进N2O排放, 同时增加nosZ基因丰度直接促进N2O还原[25].但在本实验后期, 生物炭处理的反硝化功能基因nosZ明显高于对照并与N2O排放通量表现为极显著负相关关系, 说明DNA水平上的nosZ基因拷贝数并不能完全代表土壤微生物的N2O还原酶的活性以及能力, N2O排放与硝化反硝化微生物生理活动的潜在关系还需要从RNA水平以及酶水平进行深入研究.
总之, 施用生物炭不仅为土壤中微生物提供了较多的碳源、氮源等营养物质, 同时生物炭的孔隙结构和水肥吸附作用可为土壤中微生物提供较为良好的栖息环境.但由于土壤中微生物种类繁多, 不同种群、不同功能的相关微生物对生物炭的响应机制差异较大, 关于生物炭对硝化反硝化相关功能微生物多样性的影响还需要深入研究.
4 结论(1) 施用低量生物炭(5%)能够促进土壤N2O排放, 施用中、高量生物炭能够抑制土壤N2O排放, 且生物炭用量为15%时减排效果最佳.
(2) 生物炭施用初期, AOA、nirS和nirK基因丰度与生物炭剂量呈现显著正相关关系, AOB和nosZ基因丰度与生物炭剂量呈显著负相关关系; 实验末期, AOA基因丰度与生物炭剂量呈显著负相关关系, AOB基因丰度与生物炭剂量表现为显著正相关关系.
(3) 生物炭施用初期, N2O排放通量与AOA、nirS基因呈现极显著负相关关系, 与AOB、nirK、nosZ基因丰度并未达到显著性水平, 说明在土壤含水量较高的条件下, N2O的产生受AOA、nirS基因丰度控制调节; 在实验末期, N2O排放通量与nosZ基因呈现极显著正相关关系, 与AOA、AOB、nirK、nirS基因丰度并未达到显著性水平, 说明在土壤含水量较低的条件下, N2O的产生主要受nosZ基因丰度控制调节.
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