2018, Vol. 39
, CHEN Sheng-nan
, HUANG Ting-lin , ZHANG Hai-han , SHANG Pan-lu , ZHAO Zhen-fang , WANG Yue , TAN Xin-lin
随着国家对地下水开采的严格限制, 越来越多的水库成为主要供水水源.然而, 几乎所有水库都存在内源氮(N)素超标问题, 情况严重的已经丧失作为供水水源的功能[1~4].水库水体总氮超标能够诱发藻类异常增殖、导致水质恶化.因此, 如何削减水库水体氮素污染成为水环境领域的热点问题.其中, 微生物高效菌株脱氮技术是最具优势和发展前景的方法之一.传统的反硝化理论认为, 反硝化反应在有氧气存在的条件下会受到抑制, 不能发挥微生物脱氮的作用.
荷兰Robertson等[5]在除硫和反硝化处理系统出水中成功分离出了能够在好氧条件下进行反硝化作用的细菌Thiosphera pantotropha(现命名为Paracooccus sp.), 该菌株的发现开启了好氧反硝化细菌研究的新领域.好氧反硝化细菌能够在有氧(O2)的环境中将硝氮(NO3--N)和亚硝氮(NO2--N)还原为氮气(N2), 这就为天然水体中氮素的去除提供了崭新研究思路.传统的好氧反硝化细菌分离方法主要为间歇曝气法和选择性培养基法[6].虽然大量的好氧反硝化细菌(如：Pseudomonas stutzeri PCN-1[7]、Enterobacter cloacae HNR[8]、Bacillus sp. JM10[9])被相继发现、并成功分离, 目前通过传统的稀释涂布平板方法获得新的菌种难度日益增加.运用新的筛分技术成为获得新型高效反硝化菌的关键突破口, 姜怡等[10]发现用经超声波处理后土样分离放线菌, 放线菌的种类、数量显著增加, 并得到大量新功能菌株.本研究基于前期实验结果, 在采用间歇曝气和选择性培养基方法基础上, 对沉积物-菌悬液采用超声波处理, 显著提高了细菌筛出率.
有关好氧反硝化细菌的研究主要集中于从不同的生态环境中分离菌株, 探究不同环境因素对菌株脱氮效率的影响等方面.然而, 关于好氧反硝化菌胞内反硝化功能基因(narG、nirS和nosZ)表达研究较少.李小义等[11]采用Illumina HiSeq高通量测序技术对菌株的基因组进行测序, 成功获得菌株基因组草图, 分析了其反硝化基因, 初步揭示了该菌株的好氧反硝化分子机制.牟东阳等[12]对1株菌株在好氧条件下反硝化与缺氧条件下反硝化进行比较研究, 发现硝氮的反硝化速率在缺氧和好氧条件下基本相同, 但是亚硝氮的缺氧反硝化速率要高于好氧条件.然而, 在好氧与厌氧条件下, 关于探究菌株反硝化的脱氮特性和功能基因表达研究却鲜见报道.
本研究从西安市金盆水库表层沉积物中分离出1株高效反硝化细菌KK99, 对该菌进行16S rDNA分子鉴定, 探究了该菌株在好/厌氧条件下的脱氮特性以及narG、nirS和nosZ功能基因表达水平, 以期为揭示好氧反硝化菌脱氮机制提供科学依据, 并为复杂条件下污染环境微生物脱氮工程提供菌源保障.
1 材料与方法 1.1 沉积物和培养基2016年8月, 从西安市金盆水库采集表层沉积物用以分离好氧反硝化细菌.根据文献[13, 14]并稍作优化改进, 本实验所用培养基如下.
反硝化培养基(DM)[13]：丁二酸钠, 4.7 g·L-1; KNO3, 1 g·L-1; KH2PO4, 1.5 g·L-1; Na2HPO4·7H2O, 5.0 g·L-1; 微量元素溶液, 2 mL·L-1; MgSO4·7H2O, 0.1 g·L-1; pH 7.2.
同步硝化-反硝化培养基(SND)[13, 14]：丁二酸钠, 4.7 g·L-1; KNO3, 1 g·L-1; NH4Cl, 0.3 g·L-1; KH2PO4, 1.5 g·L-1; Na2HPO4·7H2O, 5.0 g·L-1; 微量元素溶液, 2 mL·L-1; MgSO4·7H2O, 0.1 g·L-1; pH 7.2.
微量元素溶液[13]：乙二胺四乙酸(EDTA), 100mg·L-1; ZnSO4, 4.4mg·L-1; CaCl2, 11 mg·L-1; MnCl2·4H2O, 10.2 mg·L-1; FeSO4·7H2O, 10 mg·L-1; (NH4)6Mo7O24·4H2O, 2.2mg·L-1; CuSO4·5H2O, 3.2 mg·L-1; CoCl2·6H2O, 3.2 mg·L-1.
DM固体培养基[13]：丁二酸钠, 4.7g·L-1; KNO3, 1 g·L-1; KH2PO4, 1.5g·L-1; Na2HPO4·7H2O, 5.0g·L-1; 微量元素溶液, 2 mL·L-1; MgSO4·7H2O, 0.1g·L-1; pH 7.2.琼脂粉10g·L-1.
1.2 菌株的分离在传统的间歇曝气法、选择性培养基方法协同的基础上, 添加超声波预处理的方法进行分离好氧反硝化细菌.将金盆水库采集的表层沉积物(0~20 cm)200 mL放入装有500 mL液体DM培养基的1 L烧杯中, 放入若干玻璃珠, 在摇床上培养(130 r·min-1, 20 min), 以打散沉积物制成悬液.然后通过空气泵进行间歇曝气, 控制溶解氧在4~6mg·L-1.每隔3 d补充新鲜的液体DM培养基, 持续间歇曝气20 d.第21 d时, 分别取10 mL菌悬液到6个装有3 mL液体DM培养基的无菌试管中.为了提高菌株分离效率, 将上述装有沉积物-水混合液的无菌试管放入槽式超声波清洗器中[15](KQ-500DE, 温度设定为20℃; 超声功率设定为40%, 其额定功率为500 W), 分别处理0、10、20、30、40和50 s.
从用超声波处理过的沉积物-水混合液(菌悬液)中, 取1 mL放置到9 mL灭菌水的试管中, 混合均匀, 然后用涂布平板划线10倍稀释法分离好氧反硝化细菌.将平板上长出的菌落进行3~4次纯化, 得到纯菌.挑取纯化后的纯菌株单菌落至液体DM培养基中至其长到对数期, 将其再次按体积比10%接种到装有150 mL液体培养基的250 mL锥形瓶中测其脱氮特性.共分离得到120株反硝化细菌, 其中菌株KK99脱氮特性最优, 因此选取KK99进行深入研究, 菌株保存在西安建筑科技大学环境微生物技术研究所.
1.3 菌株SEM分析和16S rDNA鉴定扫描电镜(SEM)观察：取菌液1.5 mL在10 000 r·min-1条件下离心10 min, 使用3%的戊二醛溶液固定24 h后, 通过扫描电镜(JSM-5800, Japan JEOL)拍摄观察菌株细胞形态[16].在空军军医大学测定分析.
采用细菌基因组DNA提取试剂盒(Omega, USA)提取菌株KK99 DNA进行16S rDNA测序.本实验的PCR扩增所用引物对为细菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[17]. PCR扩增反应体系：DNA模板(10 ng); 10×Buffer (含2.5 mmol·L-1 Mg2+) 5.0 μL; DNA聚合酶(5 u·μL-1)1.0 μL; dNTP(10 mmol·L-1 1.0 μL; 27f引物(10 μmol·L-1)1.5 μL; 1492r引物(10 μmol·L-1)1.5 μL; ddH2O 39.0 μL补足50.0 μL.无菌操作台中用手指轻弹PCR小管、充分混匀, 在PCR扩增仪(Bio-Rad, C1000, USA)上进行PCR反应：预变性5 min(95℃), 变性30 s(95℃), 退火30 s(60℃), 延伸1.5 min(72℃), 循环35次, 延伸7 min(72℃), 12℃ forever. PCR扩增产物(约1 400 bp)经1.5%琼脂糖凝胶电泳(EB染色)确定条带后, 送至上海美吉生物公司进行测序分析.
1.4 好/厌氧反硝化性能测定用接种环挑取固体平板上菌株KK99的单菌落到液体培养基DM中, 经过36 h的培养, 将其按体积比10%接入装有150 mL液体DM培养基的250 mL锥形瓶和装有300 mL液体DM培养基的500 mL抽滤瓶中. 1组实验是将装有培养基和菌液的锥形瓶用无菌透气封口膜封住, 置于恒温振荡培养箱中培养(30℃, 130 r·min-1).另1组实验是通过对抽滤瓶充氮气来保证厌氧环境, 并用溶氧仪检测其DO为0 mg·L-1, 然后快速塞上不透气橡胶塞, 最后通过3次抽真空再次确保厌氧条件, 置于恒温培养箱中培养(30℃).两组实验分别做3组平行(n=3).每隔3 h取样, 用以测定D600、总氮(TN)、氨氮(NH4+-N)、硝氮(NO3--N)、亚硝氮(NO2--N)和总有机碳(TOC)浓度.
1.5 同步硝化反硝化性能的评估本研究以硝酸盐氮和氨氮为氮源研究该菌株在好氧条件下的同步硝化反硝化特性.将活化的菌株KK99的菌液按体积比10%接种至装有150 mL液体DM培养基的250 mL锥形瓶中, 于恒温振荡培养箱中培养(30℃, 130 r·min-1).每隔3 h取样, 用以测定D600, 总氮(TN)、氨氮(NH4+-N)、硝氮(NO3--N)、亚硝氮(NO2--N)和总有机碳(TOC)浓度.
1.6 好/厌氧条件下功能基因的表达提取菌株的DNA作为16S rDNA的扩增模板.分别以3种反硝化功能基因(narG、nirS和nosZ)为qPCR的扩增基因. narG、nirS和nosZ基因qPCR扩增所用引物如表 1所示[18~21].
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表 1 基因扩增引物序列 Table 1 Gene amplification primer sequences |
qPCR反应体系如下：10 μL的Master Mix体系(2×SYBR Green); DNA模板10 ng; 正向引物1 μL; 反向引物1 μL; ddH2O补足20 μL.反应体系配好后, 将PCR管放入IQ5定量PCR仪(Bio-Rad, USA), 反应条件如下：预变性6 min(95℃), 变性30 s(95℃), 退火30 s(60℃), 延伸90 s(72℃), 循环35次, 延伸5 min(72℃), 绘制溶解曲线, 根据与16S rDNA的比值, 计算功能基因相对表达量(%).所有样品3次平行实验(n=3).
1.7 好/厌氧反硝化氮平衡分析反硝化细菌通过两种作用消耗氮素, 包括同化作用和反硝化作用.在整个反硝化过程中, 细菌D600值的增加也表明同化作用的发生.为了分析菌株KK99在好/厌氧反硝化过程中的氮平衡, 分别将菌液接种至装有150 mL液体DM培养基的250 mL锥形瓶和装有300 mL液体DM培养基的500 mL抽滤瓶中, 在好氧和厌氧条件下培养48 h.参考Huang等[22]的方法并稍作改进, 菌株反硝化总氮去除率通过初始培养基的总氮量减去反应结束后剩余的总氮量来计算.首先用超声波细胞破碎仪(Scientz-IID)处理菌液, 使菌体内部的氮素释放出来, 从而测定剩余的总氮量.样品在8 000 r·min-1下离心10 min, 将其上清液经0.22 μm醋酸纤维滤膜过滤, 滤液用以测定反应结束后剩余的溶解态总氮、硝氮、亚硝氮和氨氮.计算方法如下：①菌体内部氮=(超声波处理后)总氮-(过滤后)溶解态总氮; ②溶解态有机氮=溶解态总氮-硝氮-亚硝氮-氨氮; ③氮损失=(初始总氮-剩余硝氮-剩余亚硝氮-剩余氨氮-剩余溶解态有机氮-剩余细胞体内氮)/初始总氮×100%[22].
1.8 菌株生长和脱氮特征测定用于总氮测定的样品首先用超声波细胞破碎仪(Scientz-IID)进行处理, 然后在4℃、8 000 r·min-1下离心10 min, 上清液过0.22 μm的醋酸纤维滤膜, 滤液用于测定总氮(TN).未经超声波处理的样品用于溶解态的硝氮(NO3--N)、氨氮(NH4+-N)、亚硝氮(NO2--N)和总有机碳(TOC)测定.总氮(TN)测定采用碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法, 硝氮(NO3--N)测定采用紫外分光光度法, 亚硝氮(NO2--N)测定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法, 氨氮(NH4+-N)测定采用纳氏试剂比色法[23], 菌体生长的测定采用浊度法(D600, UVmini-1240). TOC采用总有机碳测定仪分析(TOC-L), pH和DO采用HQ30d测定(美国, Hach).每个指标重复3次(n=3).
2 结果与讨论 2.1 反硝化细菌分离及鉴定经过前期的富集、初筛和复筛, 从西安市金盆水库沉积物中筛选得到1株高效好氧反硝化细菌.通过扫描电镜图 1可知, 该菌株为杆状细菌, 其大小约为(1.5~2.0) μm×(0.4~0.5) μm.无鞭毛和芽孢.
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图 1 好氧反硝化细菌KK99的扫描电镜照片 Fig. 1 Photograph of the aerobic denitrifying bacterial strain KK99, obtained using SEM |
将PCR反应扩增完成后的产物进行测序, 将测序结果通过Blast程序与GenBank数据库中的数据进行比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bast.cgi), 利用MEGA 5.05, 以N-J法绘制菌株的系统发育树(图 2).得到与该菌种序列相似性最大的菌种信息, 即为鉴定结果.该菌株与施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)有99%的相似性.菌株命名为施氏假单胞菌(P. stutzeri KK99).测序结果已上传至GenBank数据库, 登录号为(MG906823).
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图 2 菌株同相近序列采用NJ法构建的系统进化树 Fig. 2 Phylogenic tree of the KK99 strain and similar sequences constructed by neighbor-joining method |
以硝酸盐氮为唯一氮源研究菌株的好氧反硝化特性, 将活化好的菌液按体积比10%接种到装有培养基的锥形瓶中, 在恒温振荡培养箱培养(30℃, 130 r·min-1). 图 3展示了菌株KK99好氧反硝化特性及生长曲线.在3~24 h, 可以观察到D600显著增加, 从0.03增加到0.60.在24 h时, 大约有99.47%的硝氮和85.08%的总氮被去除. 24~30 h细菌生长变缓慢.在0~30 h阶段, 菌株KK99的平均反硝化速率(以NO3--N计, 下同)是4.23 mg·(L·h)-1. TOC的下降趋势与硝氮和总氮的趋势类似. 30 h后, 菌株进入衰亡期, D600开始下降.在整个反硝化反应的初期, 伴随着硝氮的降低, 亚硝氮也开始有了较为明显的积累现象, 在9 h的时候达到了最大值23.65mg·L-1, 而后又逐渐下降, 在15 h时下降为0.06 mg·L-1.这与Ji等[24]的结果相一致, 与肖继波等[25]的研究结果差异较大.此外, 在早期阶段, 随着硝氮的去除, 菌株产生了一部分氨氮.类似的现象在土壤中也被发现[26].
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图 3 菌株KK99好氧反硝化特性及生长曲线 Fig. 3 Aerobic denitrification performance and growth curve of the KK99 strain |
以硝酸盐氮为唯一氮源研究菌株的厌氧反硝化特性, 将活化好的菌液按体积比10%接种到装有培养基的抽滤瓶中, 在恒温培养箱培养(30℃). 图 4展示菌株KK99厌氧反硝化特性及生长曲线.在初始的3 h, 菌株生长处于迟缓期, 硝氮浓度从127.20 mg·L-1缓慢降到113.71 mg·L-1.紧接着, 在3~24 h之间, 硝氮浓度从113.71 mg·L-1急剧降到1.90 mg·L-1, 在0~24 h期间平均反硝化速率是5.22 mg·(L·h)-1.菌体的生长与硝氮的去除基本保持一致.与好氧反硝化类似, 在厌氧反硝化前期亚硝氮有个短暂的积累, 但很快消失.总氮和TOC的降解具有类似的趋势. 24 h时, 总氮的去除率为89.05%.在24 h后, 总氮浓度维持在稳定的水平.厌氧反硝化系统中菌密度D600显著小于好氧反硝化系统菌密度.在厌氧条件下, 反硝化消耗的TOC显著小于好氧条件下的.
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图 4 菌株KK99厌氧反硝化特性及生长曲线 Fig. 4 Anaerobic denitrification performance and growth curve of the KK99 strain |
综上可知, 菌株KK99在好氧和厌氧条件下均能进行反硝化作用.硝氮的反硝化速率在厌氧与好氧条件下基本相同, 但在厌氧条件的总氮去除率高于好氧条件.菌株可以为微污染水体富营养化控制和总氮削减工程应用提供菌源保障.
2.3 菌株同步硝化反硝化特性为考察菌株KK99在好氧条件下的同步硝化反硝化性能, 将该菌株按体积比10%接种于同步硝化-反硝化培养基(SND)中, 置于恒温振荡培养箱中培养(30℃, 130 r·min-1).如图 5所示, 菌株经过短暂的迟缓期, 大约3 h后菌体生长活跃, 随后菌密度D600急剧增高, 到24 h菌密度D600达到最大0.80.此过程为菌体生长对数期.生长24 h后, 菌密度呈现减少趋势, 进入衰亡期.直至54 h时, D600降至0.51.在初始的3 h之内, 菌株对总氮和硝氮的去除比较少.而当菌株进入对数期, 总氮和硝氮的浓度开始急剧下降, 分别从170 mg·L-1降到48.60 mg·L-1和从121.29 mg·L-1降到0.15mg·L-1. 24 h时, 总氮去除率为76%.在0~24 h内, 氨氮从76.60 mg·L-1降到20.25 mg·L-1.研究表明该菌株能够在好氧条件下进行同步硝化反硝化.脱氮主要发生在细菌对数生长期, 这一结论与之前的文献报道相一致[27, 28].
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图 5 菌株KK99同步硝化反硝化特性及生长曲线 Fig. 5 Simultaneous nitrification and denitrification performance and growth curve of the KK99 strain |
反硝化过程一般有4步反应.通过NO3--N→NO2--N→NO→N2O→N2四步反应将硝酸盐氮(NO3--N)转化为氮气(N2).反应分别由硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、氧化氮还原酶和氧化亚氮还原酶催化实现生物脱氮, 相对应的功能基因分别为nar、nir、nor和nos.
由图 6可知, 膜结合硝酸盐还原酶功能基因narG在好氧和厌氧条件下的表达量比较低, 因此在基因表达水平上, 该酶起的作用比较小.这可能是好氧反硝化细菌中硝酸盐还原酶主要是周质硝酸盐还原酶(Nap), 而周质硝酸盐还原酶(Nap)既能在好氧条件下进行反硝化又能在厌氧条件下进行反硝化[6].膜内narG的功能是在厌氧及低氧条件下进行硝酸盐呼吸作用, 对氧气比较敏感, 主要在厌氧反硝化微生物脱氮中发挥主要作用.而对于此菌株, 在厌氧条件下, 溶解氧浓度会抑制功能基因narG的表达, 相对表达量要低.与其他硝酸盐代谢不同的显著性标志反应是将亚硝酸盐转化为一氧化氮的过程.是整个反硝化过程中的限速步骤[29]. O2的存在对于NO2--N的反硝化速率具有一定的抑制作用.从图 6可以看出, 在厌氧条件下, 功能基因nirS的表达量要显著高于好氧条件.因此, 功能基因nirS在厌氧条件起主要的作用.功能基因nosZ的作用是将N2O转化为N2.以往的一些研究表明O2的存在会抑制nos的活性, 但是本研究发现在好氧条件下nosZ的表达丰度比在厌氧条件下的更高. Bell等[30]认为nos对O2不敏感, 在有氧条件下nos仍然具有活性.这与本研究结果相一致. 图 6表明, 在好氧条件, 功能基因nosZ起主要的作用; 功能基因的检测解释了菌株在厌氧、好氧条件下均能进行反硝化, 但同时又有区别的原因.
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图 6 厌/好氧条件下菌株KK99的反硝化功能基因表达 Fig. 6 Denitrifying functional gene expression of KK99 strain in the anaerobic/aerobic condition |
氮平衡分析研究氮素转化途径, 菌株KK99好氧反硝化脱氮的氮平衡分析结果见表 2.菌株KK99厌氧反硝化脱氮的氮平衡分析结果见表 3.在以硝酸盐氮为氮源时, 菌株KK99在好氧和厌氧两种条件下对总氮的去除率分别达到约83.33%和约90.64%.培养48 h后, 好氧反硝化系统中, 12.53%±1.21%的硝氮转化成了胞内氮.而在厌氧反硝化系统中只有6.40%±0.63%硝氮转化为胞内氮.表明在好氧条件, 同化作用脱氮所占的比例大于厌氧条件, 这一结果与上面的D600结果也相符, 好氧条件下的D600要大于厌氧条件.另外, 厌氧条件下, 总氮去除率高于好氧条件, 牟东阳等[12]的研究结论发现菌株在缺氧条件的脱氮率大于好氧条件的.在整个好氧反硝化过程中, 83.33%的总氮的损失表明菌株具有很强的脱氮能力, 据此推测, 大约83.33%的氮以气体的形式去除掉, 高于好氧反硝化菌株Pseudomonas stutzeri ZF31的脱氮率[22].表明菌株脱氮主要是其反硝化作用, 而不是同化作用.
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表 2 菌株KK99好氧反硝化过程的氮平衡分析 Table 2 Nitrogen balance analysis during the aerobic denitrification process of KK99 strain |
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表 3 菌株KK99厌氧反硝化过程的氮平衡分析 Table 3 Nitrogen balance analysis during anaerobic denitrification process of KK99 strain |
3 结论
(1) 分离筛选得到1株高效反硝化细菌, 经形态学观察和16S rDNA序列分析鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri), 命名为P. stutzeri KK99.
(2) 在好/厌氧条件下, P. stutzeri KK99细胞内功能基因nosZ和nirS表达量较高, 分别在好/厌氧条件下驱动反硝化作用, narG在两种条件下的表达均较低.
(3) 氮平衡分析表明, 培养48 h, 在好/厌氧条件下, 菌株KK99总氮去除率约为83.33%、90.64%.同化作用氮所占比例分别为12.53%±1.21%、6.40±0.63%.
(4) 在好/厌氧条件下, P. stutzeri KK99均具有高效脱氮效率, 能够在好氧条件下进行同步硝化反硝化.该菌株将为微污染水体富营养化控制和总氮削减工程应用提供菌源保障.
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