2018, Vol. 39
2. 首都师范大学首都圈水环境研究中心, 北京 100048
2. Research Center of Aquatic Environment in the Capital Region, Capital Normal University, Beijing 100048, China
河流是全球碳氮循环的输送通道, 不仅是陆地有机质参与生物地球化学循环的重要场所, 还是水-气界面二氧化碳(CO2)和甲烷(CH4)全球碳循环的重要环节[1~3].全球河流每年向大气排放1.5~26.8 Tg CH4, 成为CH4排放的热点区域[2, 4]. CH4在河流沉积物-水界面向水体扩散时, 约33%~99%的甲烷会被甲烷氧化菌消耗掉, CH4的氧化过程受到甲烷氧化菌、溶解氧等多种因素的共同影响[2, 5].由于受到溶解氧浓度的影响, 河流沉积物中甲烷的氧化过程主要为厌氧氧化过程(N-DAMO, nitrite-dependent anaerobic methane oxidation, 反硝化厌氧甲烷氧化), 即在厌氧环境下, 以NO2--N和NO3--N为电子受体, 将CH4氧化为CO2, 同步完成脱氮去CH4的过程[6]. N-DAMO细菌是隶属于NC10门且能同时参与碳、氮循环的新型细菌, N-DAMO功能细菌能原位利用厌氧消化产生的CH4深度脱氮[7].自然生态系统中N-DAMO细菌存在范围较广, 稻田土壤[8]、湿地[9]、湖泊沉积物[10]、河流[11]及废水淤泥[12]中均富集培养到了N-DAMO细菌, 但是人类活动沉积物中N-DAMO细菌的影响的研究仍存在不足.
人类活动的影响导致大量未经处理的硝酸盐和有机物质汇入河流, 导致河流中DOC/DIC及N/P浓度增高, 高浓度的污染物对河流中微生物的群落结构和物质转化的介导过程产生影响[9, 13~15].与自然河流相比, 城市河流中自然腐殖质少, 人为富里酸、蛋白类及氨氮、NOx浓度高, 城市河流中高浓度的有机质提高了微生物的有效性, 并为N-DAMO反应提供了有利的条件[6, 16].人类活动输入氮形态的差异对N-DAMO细菌氧化过程有影响.相关研究表明NOx能抑制N-DAMO细菌的厌氧氧化过程, NO2-对N-DAMO细菌的抑制性低于NO3-[17].河流沉积物中氨氮和TN是N-DAMO细菌氧化过程的决定性环境因素.目前普遍认为氨氮对N-DAMO细菌的氧化有抑制作用[11, 18], 由于NH4+-N与CH4有相似的分子结构, 其通过竞争甲烷单加氧酶系统相同的位点或降低甲烷氧化酶活性, 从而抑制N-DAMO细菌的氧化作用[19].
北运河是北京市主要的排污泄洪河道, 流经北京市人类活动最频繁的北部和东部地区, 受人类活动影响剧烈[20, 21], 是海河流域污染最严重的河流, 承担着城市河湖景观、休闲旅游和排水等重要功能[22].清河、坝河、通惠河、凉水河四大支流均分布着污水处理厂, 其中清河有肖家河和清河这2座污水处理厂; 坝河主要接纳北小河和酒仙桥这2座污水处理厂退水; 通惠河是城区雨水管网的排水河道, 接纳高碑店污水处理厂退水; 凉水河主要接纳方庄酒厂、吴家村、卢沟桥、小红门和亦庄开发区这5座污水处理厂退水, 凉水河是4大排水河道中接纳污水处理厂最多个, 受污水处理厂退水影响最大的支流, 氮磷处理效率低的污水处理厂的出水及未经处理废水直接汇入河道[23].作为北京市主要的排污河道, 大量未经处理的工农业废水、城市生活污水和污水处理厂的退水经过清河、坝河、通惠河和凉水河排入北运河, 导致水体氨氮含量严重超标[24~26].北运河流域内大大小小养殖场总计1 000多个, 未得到有效处理的养殖废水排入河道, 河道两侧人口居住集中, 大量垃圾沿岸堆放, 沿岸农田中低利用率的农药化肥随降雨和农田灌溉进入河道[27, 28], 由于河道水流缓慢, 沉积物大量淤积, 污染物质的沉降、吸附使得沉积物成为内源污染源[29], 人类活动强度大导致北运河工业污染、生活污染及农业面源污染严重.
目前对N-DAMO细菌的研究主要集中探讨不同淡水生态系统中N-DAMO细菌群落时空分布特征, 人类活动对N-DAMO细菌群落特征影响的研究还存在不足.本文选取北运河作为研究区域, 采用克隆文库的方法, 通过分析中游和下游区域沉积物理化指标及N-DAMO细菌16S rRNA和pmoA功能基因群落特征的差异, 分析人类活动对N-DAMO细菌群落结构、系统发育树, 种群之间的共生关系的影响, 探究人类活动对N-DAMO细菌关键环境因子的影响, 以期为进一步解释人类活动对河流大气-水界面甲烷释放的影响提供理论基础, 同时也为控制城市河流中甲烷气体的释放提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 样品采集本研究样品于2016年7月采集于北运河, 使用抓泥斗采集上覆水和底泥样品(0~5 cm)约1 kg.由于本文研究人类活动的影响, 故采样点主要布设在北运河北京段的中游和下游, 中游和下游均有人类活动干扰, 但是干扰程度存在差别.如图 1所示, 在北运河北京段上共设置7个采样点, 其中1~3号样点位于北运河北京段的中游, 4~7号样点位于北运河北京段的下游.
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图 1 北运河采样点分布示意 Fig. 1 Distribution of sampling sites in the North Canal |
采集到的样品在聚氯乙烯塑料瓶(已灭菌)-4℃储存, 24 h内运回实验室.所有样品分为两部分：一部分用冷冻干燥机(Alpha 1-2 LD plus; Martin Christ, Germany)烘干, 研磨过200目筛后用于理化分析; 另一部分样品放入-80℃超低温冰箱保存, 用于后续分子生物学实验.
1.2 样品理化分析上覆水水质指标使用多参数水质仪(HYDROLABMS5, HACH, 美国)现场测定, 包括温度(T)、pH、溶解氧(DO)、盐度(salinity)等.沉积物中铵态氮(NH4+-N), 硝态氮(NO3--N), 亚硝态氮(NO2--N)和TP, 用2 mol·L-1 KCl溶液浸提, 浸提悬浮液离心过滤, 使用FIAstar连续流动进样分析仪(FIAstar 5000, FOSS, 丹麦)进行测定; TOC使用总有机碳分析仪进行测定(Liqui TOCⅡ, 德国); TN使用凯氏定氮仪(KDY-9830, 瑞邦兴业, 中国)进行测定.
1.3 DNA提取和pmoA基因PCR扩增沉积物样品DNA使用Power Soil DNA kit(Mo Bio Laboratories, Carlsbad, California, USA)试剂盒, 依据说明书提取. N-DAMO细菌的16S rRNA和pmoA功能基因巢式PCR扩增引物以及需要的主要温度程序见表 1.
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表 1 N-DAMO细菌的16S rRNA及pmoA功能基因提取所需引物和温度程序 Table 1 Primers and procedures for amplification of the 16S rRNA and pmoA genes |
1.4 克隆、测序及系统发育树分析
用Gel Extraction Kit (OMEGA Bio-tek, 美国)对PCR产物进行切胶纯化, 将回收产物与pEASY-T1载体(北京全式金生物技术有限公司)进行连接, 转入Trans1-T1Phage Resistant化学感受态细胞, 在氨苄青霉素平板上培养后进行蓝、白斑筛选, 并通过克隆检测引物进行菌液PCR, 挑选出阳性克隆子送至北京诺赛基因组研究中心有限公司测序.使用MOTHUR软件对N-DAMO细菌16S rRNA和pmoA功能基因分别以2%和3%的差异度划分独立操作单元(operational taxonomic units, OTUs)[33, 34], 计算香农多样性指数、辛普森指数和Chao1指数[35].使用MEGA 5软件[33]以邻位相连法(Neighbor-Joining)对本研究中目的序列和参比序列进行比对, 分别选取相似性较高的16S和pmoA序列作为参比序列, 使用MEGA 4软件以邻位相连法(Neighbor-Joining)构建系统发育树, 明晰其系统分类情况[33].
1.5 共存关系网络(Co-occurrence Network)分析使用R 3.3.2的Hmisc package 4.01, 对N-DAMO细菌的16S rRNA和pmoA的OTUs进行Spearman相关性分析计算R值和P值.选取R>0.6或R < 0.6显著相关的OTUs(P < 0.05), 使用Cytoscape 3.5.1软件对OTUs的相关结构进行可视化, 构建共存关系网络.通过Cytoscape软件的Network Analyzer插件[36]块对共存关系网络的拓扑结果进行分析, 通过Cytoscape软件的ClusterMaker插件[37]对共存关系网络进行模块化分析.
1.6 统计学分析使用STAMP软件[38]基于T-TEST方法计算两样本之间的差异.使用R 3.3.2的psych package 1.7.5[39]计算样本间微生物之间的共生关系, 并进一步使用Cytoscape 3.5.1软件[40]构建微生物的拓扑结构.使用R 3.3.2软件的Vegan package 2.4[41]冗余分析(RDA)计算生物群落与环境因子的相关性.通过mantel及partial mantel检验方法识别各环境因子的影响及贡献.采用SPSS(PASW statistics 18.0)软件对理化数据进行统计分析.
2 结果与分析 2.1 水质和沉积物理化指标差异北运河中游和下游水质及底泥理化结果如表 2所示, 对比分析北运河中游和下游水质以及沉积物理化参数结果如图 2所示.北运河下游NH4+-N和DO显著高于中游(T-test, P < 0.05), 中游C/N和pH显著高于下游(T-test, P < 0.05).中游NH4+-N占TN的58.70%, NO3--N占TN的16.67%, 下游NH4+-N占TN的81.33%, NO3--N占TN的8.05%, 北运河中NH4+-N为氮素的主要形态, 且其所占TN的比例显著高于NO3--N和NO2--N(T-test, P < 0.05).
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表 2 北运河中游和下游水质及沉积物中营养盐变化(平均值±标准差) Table 2 Nutrient variations in stream water and sediment from midstream and downstream sites (Means±SD) |
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图 2 基于T-test分析北运河中游和下游水质及沉积物营养盐差异 Fig. 2 Differences of nutrient variations in sediment samples from midstream sites and downstream sites |
北运河共扩增16S rRNA基因序列170条, 序列覆盖度均为0.91~0.98; pmoA功能基因序列259条, 序列覆盖范围均为0.95~0.99, 本研究北运河沉积物中扩增出来的N-DAMO细菌16S rRNA和pmoA功能基因序列具有代表性.如图 3, 基于2%的基因差异, 16S rRNA划分出2~6个OTUs(中游划分出3~5个OTUs, 下游划分出2~6个OTUs), 香农指数(Shannon)范围为0.27~0.77(中游为0.31~0.77, 下游为0.27~0.46), Simpson指数范围为0.47~0.88(中游为0.47~0.65, 下游为0.53~0.88).基于3%的基因差异pmoA功能基因划分出2~9个OTUs(中游划分出2~9个OTUs, 下游划分出3~8个OTUs), 香农指数(Shannon)指数范围为0.21~1.48(中游为0.24~1.48, 下游为0.21~0.69), Simpson指数范围为0.22~0.96(中游为0.22~0.88, 下游为0.31~0.77).北运河中游和下游沉积物中16S rRNA和pmoA功能基因的多样指标没有显著性的差异(T-test, P>0.05).基于Bray-Curtis距离算法对北运河中N-DAMO细菌16S rRNA和pmoA功能基因的Heatmap分析(OUTs数)显示16S rRNA和pmoA功能基因均聚为两类, 中游样点(1~3)以及下游样点(4~7)各自聚在一起(图 4).
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(a) 16S rRNA; (b)pmoA 图 3 北运河沉积物N-DAMO细菌16S rRNA及pmoA功能基因多样性指标 Fig. 3 16S and pmoA community OTUs, Chao1 estimator, Shannon index, and Simpson index |
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图 4 N-DAMO细菌16S rRNA及pmoA功能基因的Heatmap分析(基于Bray-Curtis距离) Fig. 4 Heatmap representing the differences of 16S rRNA and pmoA sequences between microbial communities in midstream and downstream samples, based on Bray-Curtis distance |
选取N-DAMO细菌16S rRNA(0.02的差异度)和pmoA功能基因(0.03差异度)具有代表性的基因序列进行系统发育树分析. 16S rRNA分为3个分支, 分别为ClusterⅠ、ClusterⅡ和ClusterⅢ [图 5(a)].其中ClustersⅠ有103条基因序列, 占据了整个基因序列的60.59%, 为最大的分支, 与河流湖泊以及水库沉积物中16S rRNA基因序列的同源性高, ClusterⅠ的分支中中游样点占72.82%, 下游样点占27.18%. ClustersⅡ共有47条基因序列, 全部来自下游样点, 占据了整个基因序列的27.65%, 为第二大分支, 与河流以及消落带沉积物中16S rRNA基因序列的同源性高. ClusterⅢ为16S rRNA最小的分支, 全部来自下游样点, 共有20条基因序列, 全部来自7号样点, 与白洋淀沉积物中16S rRNA基因序列的同源性高.
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图 5 北运河沉积物N-DAMO细菌16S rRNA及pmoA功能基因的系统发育树 Fig. 5 Phylogenetic tree of representative 16S rRNA and pmoA sequences from samples in the North Canal and reference sequences from GenBank |
pmoA功能基因分为4个分支, 分别为ClusterⅠ、ClusterⅡ、ClusterⅢ和ClusterⅣ[图 5(b)].其中ClustersⅠ为最大的分支, 包括108条基因序列, 占据了整个基因序列的41.70%, ClustersⅠ占所有基因序列65.74%(主要来自下游的5~7号点)与污水处理厂[5, 42]、生物反应器以及废水淤泥[12, 42]中N-DAMO细菌的pmoA功能基因序列的同源性较高. 33.02%的基因序列(主要来自中游的1~3号点)与河流[6, 43]及河口[44]沉积物中N-DAMO细菌的pmoA功能基因序列的同源性较高. ClusterⅢ为第二大分支(27.41%), 共71条基因序列其主要来自中游, 与消落带[45]及湖泊底泥中pmoA功能基因序列的同源性较高. ClustersⅡ共63条基因序列, 占据了整个基因序列的24.32%, 与河流湖泊沉积物[11]中pmoA功能基因序列的同源性较高. ClusterⅣ共17条序列, 为最小的分支, 与稻田土壤[46]中pmoA功能基因序列的同源性较高.
2.4 北运河中下游N-DAMO细菌Co-occurrence Network差异性通过Network分析对比北运河中游[图 6(a)]和下游[图 6(b)]沉积物中16S rRNA和pmoA功能基因, 通过计算拓扑结构参数描述OTUs之间的相关性(表 3).北运河中游微生物网络图中共有27个点, 33条相关线, 下游共有29个点, 171条相关线.中游中16S rRNA和pmoA功能基因彼此之间基本为负相关, 其与环境因子之间除C/N和NO3--N之外也均为负相关[图 6(a)], 下游中16S rRNA和pmoA功能基因彼此之间基本为正相关, 但是物种与环境因子之间基本为负相关[图 6(b)].与中游样点中16S rRNA和pmoA功能基因的OTU相比, 下游物种与环境因子之间的关联性更密切, 相关性更强, 环境因子的改变对物种的影响更强.对比分析中游和下游的拓扑结构参数(表 3), 中游和下游网络结构范围相同.中游网络结构的异质性更强以及特征路径更长, 下游中N-DAMO细菌有较强聚集性, 其中网络中心化程度和集聚系数均高于中游, 下游沉积物中N-DAMO细菌的集聚度更高, 网络结构更为复杂.
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圆点代表MOD细菌的OTUs, 线段代表相关性, P < 0.05 图 6 北运河沉积物N-DAMO细菌16S rRNA及pmoA功能基因的Co-occurrence network分析 Fig. 6 Co-occurrence network of 16S rRNA and pmoA sequences communities in the North Canal |
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表 3 北运河沉积物中游和下游拓扑结构参数 Table 3 Topological parameters of microbial networks from midstream and downstream samples |
2.5 北运河中下游16S rRNA和pmoA功能基因环境因子差异性
RDA分析显示北运河中游和下游沉积物中三态氮(NH4+-N, NO3--N, NO2--N)、TOC、DO和盐度与16S rRNA和pmoA功能基因的群落组成有很强的相关性(Monte Carlo test, P < 0.05, 图 7). 16S rRNA与环境因子的RDA分析, 前两个解释轴的解释度为66.10%(RDA1：54.18%, RDA2：11.92%), 依据Monte Carlo检验, 选取7个与解释轴有强相关的环境因子, 其中pH(0.99)、DO(0.93)、NO3--N(-0.89)、盐度(0.79)与CCA1轴有显著相关关系, NH4+-N (0.98)、NO2--N(0.97)、TOC(0.82)与CCA2轴有显著相关关系; pmoA功能基因与环境因子的RDA分析, 前两个解释轴的解释度为60.20%(RDA1：41.90%, RDA2：18.30%), 依据Monte Carlo检验, 选取6个与解释轴有强相关的环境因子, 其中NH4+-N(0.95)、DO(0.98)、盐度(0.89)与CCA1轴有显著相关关系, NO3--N (0.85)、NO2--N(-0.94)、TOC(-0.75)与CCA2轴有显著相关关系.依据Mantel检验, 分析各个环境因子对微生物分布的影响(表 4).其中NH4+-N和NO2--N均对沉积物中16S rRNA和pmoA功能基因有显著影响(P < 0.05).
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图 7 北运河沉积物中N-DAMO细菌16S rRNA及pmoA功能基因与环境因子的RDA分析 Fig. 7 Analysis of the correlation between 16S rRNA and pmoA sequences and environmental factors |
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表 4 N-DAMO细菌群落组成与环境因子相关关系的Mantel检验 Table 4 Mantel correlations highlight the relationships shared between environmental traits and community composition |
3 讨论 3.1 人类活动对N-DAMO细菌群落组成的影响
人类通过农业生产活动及城市化进程改变了自然生态系统中土地的利用方式[47], 土地利用方式的改变, 影响着流域中营养盐及有机质的输入和输出[48].农药化肥的过度使用增加了NO3--N、NH4+-N和P等营养盐的输入[49], 也增加了城市生活污水及生活垃圾渗滤液的汇入[50].营养盐负荷的增加导致水质的降低, 改变了河流中微生物的群落结构和微生物对物质转化的介导作用[3, 51]. N、P的有效性限制了沉积物微生物的自养和异养过程[52].北运河是流经北京市的城市河流, 多条支流(坝河, 通惠河和凉水河)流经北京市的主城区, 河流水体污染严重, 主要污染物为N, P和有机污染物[53, 54].本研究发现, 北运河下游沉积物中NH4+-N和DO的浓度显著高于中游, 而中游C/N和pH较高, 下游主要为中游样点来水以及重污染支流凉水河支流的汇入, 使其污染物的浓度累计达到最高值.有研究表明北运河污染物主要来自工业废水的排放, 其次为生活污水和农业面源污染, 其中总氮和氨氮的负荷主要来自凉水河支流的汇入[54].这解释了北运河下游NH4+-N含量显著高于中游的原因. N-DAMO细菌是在厌氧条件下以NO2--N, NO3--N为电子受体, 将CH4氧化为CO2的过程[6]. N-DAMO细菌能利用厌氧硝化产生的CH4进行深度脱氮, 同时降低碳源的需求[7].因此城市河流中大量的N、P的输入为N-DAMO反应提供了有利的条件[6].本研究通过Heatmap分析发现, N-DAMO细菌的16S和pmoA功能基因中游和下游样点均分别聚在一起, 这与沉积物中营养盐的分布特征密切相关.
共存网络关系结构(co-occurrence network)可以用来评估复杂生态系统中微生物之间以及微生物和环境因子之间的相互关系[55, 56], 可以进一步描述微生物的栖息地环境特征与微生物群落之间的聚集关系[57, 58].网络结构拓扑图中点的分布以及点与点之间的相互关系能影响系统的稳定性[58, 59].下游高度连通的物种网络表明, 与中游相比下游N-DAMO细菌物种之间有较强的共生关系.由于下游N-DAMO细菌OTUs较为复杂的共生关系, 小的干扰均会对下游N-DAMO细菌产生较大的影响.模块化程度(modularity)>0.4表明网络拓扑图已经形成模块化[60], 更高的模块化程度能反映出更强的生态位分化程度[58].网络结构参数中的聚集系数(clustering coefficient)及特征路径长度(characteristic path length)表征网络关系图中节点与节点之间紧密联系的程度, 集聚系数越大, 点与点之间的特征路径长度越短, 物种之间联系越紧密, 受到环境变化的干扰程度越强[61, 62].与其他物种相比, 处于同一个模块内的种群之间更紧密的联系, 生态位的分化能导致物种具有较高的模块化程度[60].本研究中, 与中游的集聚系数和特征路径长度相比, 下游集聚系数更高和特征路径长度更短, 表明沉积物中N-DAMO对环境变化的敏感程度有空间变化特征, 人类活动更强、污染物浓度更高的下游沉积物中N-DAMO细菌对环境变化更敏感, 受环境变化的干扰程度更强.人类活动通过对北运河水体的影响, 进一步影响了北运河沉积物中N-DAMO细菌的群落组成结构.
3.2 人类活动对N-DAMO细菌相关环境因子的影响人类活动(施肥、城市化、排污)极易影响到河流系统中营养盐、有机质及生物有效性, 并会进一步对微生物的来源产生影响[63].北运河为北京市的城市河流, 主要受到工业废水、污水处理厂出水、生活污水和农业面源的污染, 其中工业废水的排放是北运河污染的主要来源[54].工业废水及污水处理厂出水的汇入对北运河沉积物中微生物的来源产生影响.鲍林林等[25, 29]对北运河沉积物中的脱氮功能微生物和氨氧化微生物群落特征的研究均表明脱氮功能微生物和氨氧化微生物菌群与污水处理厂废水和活性污泥中发现的类群同源性高.本研究中, N-DAMO细菌的pmoA功能基因主要与污水处理厂[5, 42]、生物反应器以及废水淤泥[12, 42]中N-DAMO细菌的pmoA功能基因序列的同源性较高, 这与鲍林林等的研究结果一致.浑河为流经抚顺和沈阳两大重工业城市的城市河流, 主要受到工业废水和生活污水的污染严重[64].浑河作为辽河流域的城市河流与北运河的污染类型较为相似, 均为污染严重的城市河流.对浑河沉积中N-DAMO细菌的系统发育树分析显示, 其沉积物中获得的16S rRNA和pmoA基因序列与从污水处理厂活性污泥作为接种物获得的基因序列有较高的相似性[6].北运河和浑河N-DAMO细菌的系统发育树分析结果的一致性表明工业废水和污水处理厂出水对N-DAMO细菌群落结构和细菌来源产生影响.
城市污水的排放导致河流水体处于高TOC和NO3--N的状态[14].原位生物地球化学循环与不同物质酶的催化作用形成了不同的氮素形态[65].北运河高浓度的氨氮一部分来自支流中工业废水的汇入一部分来自农业灌溉的输入[54].有研究表明输入氮形态及氮浓度水平的不同对甲烷氧化过程的影响是不同的, 甲烷氧化菌在低渗透压下具有最佳的氧化活性, 而较高的渗透压会对甲烷氧化菌活性产生抑制[66].本研究的结果显示, 北运河中游和下游沉积物中N-DAMO细菌的16S rRNA和pmoA功能基因均与NH4+-N有较强的相关性. NH4+-N能引起甲烷单加氧酶、氨氧化菌以及甲烷氧化菌间的竞争性抑制作用, NH4+-N能进一步引起的羟胺和亚硝酸盐间的非竞争性抑制作用[67]. NH4+-N对N-DAMO细菌氧化抑制作用的机理在于NH4+-N和CH4有相似的分子结构, 通过竞争甲烷氧化酶系统相同的位点或降低甲烷氧化酶活性, 从而对甲烷氧化起到抑制作用[18].除此之外, 自然生态系统中厌氧氨氧化细菌(ANAMMOX)和N-DAMO细菌可以共存, 水体中NH4+-N能促进ANAMMOX的生长, 而ANAMMOX通过硝化厌氧氨氧化过程生成的NO2--N限制N-DAMO细菌的生长[68].除NH4+-N对甲烷氧化产生抑制性作用, NO3--N和NO2--N也会对厌氧甲烷氧化过程起抑制作用, 而且NO2--N对N-DAMO氧化的抑制作用要弱于NO3--N的抑制作用[32].当以NO3--N为电子受体时ANAMMOX和N-DAMO细菌可以协同作用, ANAMMOX与N-DAMO竞争氧化酶位点, 且前者的竞争优势强于后者, 进一步抑制N-DAMO反应[68].实验室厌氧条件下, 探究N-DAMO和ANAMMOX的反应过程, ANAMMOX与N-DAMO细菌有一定的耦合作用, 其中ANAMMOX对NO3--N还原反应占主导地位, 其对NO3--N和NO2--N竞争优势均强于N-DAMO细菌[69].本研究中RDA分析结果显示, NO3--N和NO2--N与N-DAMO细菌16S rRNA和pmoA功能基因均有较强的相关性.环境中NO3--N能通过影响NO2--N进一步影响N-DAMO细菌的群落结构[70].钱塘江沉积物中N-DAMO细菌的研究显示, 沉积物中NH4+-N和TN是N-DAMO细菌的决定性因素, 并且NO2--N和C/N也会影响N-DAMO细菌的群落结构[11].本研究中, 由于人类活动加剧了NH4+-N、NO3--N和NO2--N的汇入, 高浓度的NH4+-N和NO3--N加剧了对N-DAMO细菌群落结构的影响. ANAMMOX与N-DAMO细菌的耦合作用是复杂的过程, 本文没有对ANAMMOX细菌进行研究, 需要在下一步的工作中探究城市河流中ANAMMOX与N-DAMO细菌的耦合作用对河流CH4释放的影响.
4 结论(1) 人类活动导致北运河中NH4+-N、NO3--N和NO2--N负荷的增加, NH4+-N为北运河沉积物中氮素的主要存在形态, 下游沉积物中NH4+-N浓度显著高于中游.高浓度的污染物质对N-DAMO细菌16S rRNA和pmoA功能基因的群落结构和N-DAMO细菌间的共生关系产生影响.
(2) 人类活动的干扰影响北运河沉积物N-DAMO细菌OTUs之间联系的紧密程度.人类活动干扰程度较大, 污染物浓度较高的下游沉积物中N-DAMO细菌对环境变化更敏感, 其受环境变化的干扰程度更强.
(3) 人类活动对N-DAMO细菌16S rRNA和pmoA功能基因高同源细菌的来源有影响, 高同源细菌的来源与北运河沉积物中高浓度营养盐(NH4+-N、NO3--N、NO2--N和TOC)的来源一致.中游和下游与N-DAMO细菌16S rRNA和pmoA功能基因有显著响应关系的环境因子为NH4+-N及NO3--N, 其与北运河主要污染物质相一致.
| [1] | de Angelis M A, Lilley M D. Methane in surface waters of Oregon estuaries and rivers[J]. Limnology and Oceanography, 1987, 32(3): 716-722. DOI:10.4319/lo.1987.32.3.0716 |
| [2] |
王晓锋, 袁兴中, 陈槐, 等. 河流CO2与CH4排放研究进展[J]. 环境科学, 2017, 38(12): 5352-5366. Wang X F, Yuan X Z, Chen H, et al. Review of CO2 and CH4 emissions from rivers[J]. Environmental Science, 2017, 38(12): 5352-5366. |
| [3] | Qu X D, Ren Z, Zhang H P, et al. Influences of anthropogenic land use on microbial community structure and functional potentials of stream benthic biofilms[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 15117. DOI:10.1038/s41598-017-15624-x |
| [4] |
翟俊, 马宏璞, 陈忠礼, 等. 湿地甲烷厌氧氧化的重要性和机制综述[J]. 中国环境科学, 2017, 37(9): 3506-3514. Zhai J, Ma H P, Chen Z L, et al. Review on the importance and mechanisms of anaerobic oxidation of methane in wetlands[J]. China Environmental Science, 2017, 37(9): 3506-3514. |
| [5] | Ma R, Hu Z, Zhang J, et al. Reduction of greenhouse gases emissions during anoxic wastewater treatment by strengthening nitrite-dependent anaerobic methane oxidation process[J]. Bioresource Technology, 2017, 235: 211-218. DOI:10.1016/j.biortech.2017.03.094 |
| [6] |
王佳, 宋永会, 彭剑峰, 等. 浑河底泥反硝化厌氧甲烷氧化菌群落结构时空特征[J]. 环境科学研究, 2015, 28(11): 1670-1676. Wang J, Song Y H, Peng J F, et al. Spatial-temporal distribution and community structure analysis of nitrite-dependent anaerobic methane-oxidizing bacteria in the sediments of the Hun River[J]. Research of Environmental Sciences, 2015, 28(11): 1670-1676. |
| [7] |
赵荣, 朱雷, 吴箐, 等. 亚硝酸盐型甲烷厌氧氧化过程影响因素研究[J]. 环境科学学报, 2017, 37(1): 178-184. Zhao R, Zhu L, Wu Q, et al. Effect of environmental factors on nitrite-dependent denitrifying anaerobic methane oxidation[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2017, 37(1): 178-184. |
| [8] | Shen L D, Liu S, Huang Q, et al. Evidence for the cooccurrence of nitrite-dependent anaerobic ammonium and methane oxidation processes in a flooded paddy field[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(24): 7611-7619. DOI:10.1128/AEM.02379-14 |
| [9] | Chen S L, Chen J F, Chang S, et al. Aerobic and anaerobic methanotrophic communities in urban landscape wetland[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2018, 102(1): 433-445. DOI:10.1007/s00253-017-8592-y |
| [10] | Yang J, Jiang H C, Wu G, et al. Co-occurrence of nitrite-dependent anaerobic methane oxidizing and anaerobic ammonia oxidizing bacteria in two Qinghai-Tibetan saline lakes[J]. Frontiers of Earth Science, 2012, 6(4): 383-391. DOI:10.1007/s11707-012-0336-9 |
| [11] | Shen L D, Liu S, Zhu Q, et al. Distribution and diversity of nitrite-dependent anaerobic methane-oxidising bacteria in the sediments of the Qiantang River[J]. Microbial Ecology, 2014, 67(2): 341-349. DOI:10.1007/s00248-013-0330-0 |
| [12] | Luesken F A, van Alen T A, van der Biezen E, et al. Diversity and enrichment of nitrite-dependent anaerobic methane oxidizing bacteria from wastewater sludge[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 92(4): 845-854. DOI:10.1007/s00253-011-3361-9 |
| [13] | Abell J M, Özkundakci D, Hamilton D P, et al. Relationships between land use and nitrogen and phosphorus in New Zealand lakes[J]. Marine and Freshwater Research, 2010, 62(2): 162-175. |
| [14] | Daniel M H B, Montebelo A A, Bernardes M C, et al. Effects of urban sewage on dissolved oxygen, dissolved inorganic and organic carbon, and electrical conductivity of small streams along a gradient of urbanization in the Piracicaba River basin[J]. Water, Air, and Soil Pollution, 2002, 136(1-4): 189-206. |
| [15] | Mulholland P J, Helton A M, Poole G C. Stream denitrification across biomes and its response to anthropogenic nitrate loading[J]. Nature, 2008, 452(7184): 202-205. DOI:10.1038/nature06686 |
| [16] | Hosen J D, McDonough O T, Febria C M, et al. Dissolved organic matter quality and bioavailability changes across an urbanization gradient in headwater streams[J]. Environment Science & Technology, 2014, 48(14): 7817-7824. |
| [17] | Wang Y, Zhu G B, Harhangi H R, et al. Co-occurrence and distribution of nitrite-dependent anaerobic ammonium and methane-oxidizing bacteria in a paddy soil[J]. FEMS Microbiology Letters, 2012, 336(2): 79-88. DOI:10.1111/fml.2012.336.issue-2 |
| [18] | Scheutz C, Kjeldsen P. Environmental factors influencing attenuation of methane and hydrochlorofluorocarbons in landfill cover soils[J]. Journal of Environmental Quality, 2004, 33(1): 72-79. DOI:10.2134/jeq2004.7200 |
| [19] |
胡敏杰, 仝川, 邹芳芳. 氮输入对土壤甲烷产生、氧化和传输过程的影响及其机制[J]. 草业学报, 2015, 24(6): 204-212. Hu M J, Tong C, Zou F F. Effects of nitrogen input on CH4 production, oxidation and transport in soils, and mechanisms:a review[J]. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(6): 204-212. DOI:10.11686/cyxb2014313 |
| [20] |
荆红卫, 张志刚, 郭婧. 北京北运河水系水质污染特征及污染来源分析[J]. 中国环境科学, 2013, 33(2): 319-327. Jing H W, Zhang Z G, Guo J. Water pollution characteristics and pollution sources of Bei Canal river system in Beijing[J]. China Environmental Science, 2013, 33(2): 319-327. |
| [21] | Ren Y F, Xu Z W, Zhang X Y, et al. Nitrogen pollution and source identification of urban ecosystem surface water in Beijing[J]. Frontiers of Environmental Science & Engineering, 2014, 8(1): 106-116. |
| [22] |
杜伊, 胡玮璇, 王晓燕, 等. 北京市北运河水体中化学需氧量组分含量及其可生化性研究[J]. 湿地科学, 2017, 15(3): 470-477. Du Y, Hu W X, Wang X Y, et al. Concentrations of chemical oxygen demand fractions and their biodegradability in waters of Beiyun River, Beijing[J]. Wetland Science, 2017, 15(3): 470-477. |
| [23] |
郭婧, 荆红卫, 李金香, 等. 北运河系地表水近10年来水质变化及影响因素分析[J]. 环境科学, 2012, 33(5): 1511-1518. Guo J, Jing H W, Li J X, et al. Surface water quality of Beiyun Rivers basin and the analysis of acting factors for the recent ten years[J]. Environmental Science, 2012, 33(5): 1511-1518. |
| [24] | 单铎. 北运河氨氮降解系数测算研究[D]. 北京: 首都师范大学, 2013. |
| [25] |
鲍林林, 王晓燕, 陈永娟, 等. 北运河沉积物中主要脱氮功能微生物的群落特征[J]. 中国环境科学, 2016, 36(5): 1520-1529. Bao L L, Wang X Y, Chen Y J, et al. Diversity, abundance and distribution of nirS-type denitrifiers and anammox bacteria in sediments of Beiyun River[J]. China Environmental Science, 2016, 36(5): 1520-1529. |
| [26] |
张汪寿, 李晓秀, 王晓燕, 等. 北运河武清段水污染时空变异特征[J]. 环境科学学报, 2012, 32(4): 836-846. Zhang W S, Li X X, Wang X Y, et al. Temporal and spatial variations of water pollution in Wuqing section of Beiyunhe River[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2012, 32(4): 836-846. |
| [27] |
姜娜, 冯绍元, 郑艳侠, 等. 北京市北运河流域地表水环境问题分析与治理对策[J]. 中国农村水利水电, 2010(6): 9-11. Jiang N, Feng S Y, Zheng Y X, et al. An analysis of problems and countermeasures for the surface water environment pollution of the North Canal watershed in Beijing[J]. China Rural Water and Hydropower, 2010(6): 9-11. |
| [28] |
陈永娟, 胡玮璇, 庞树江, 等. 北运河水体中荧光溶解性有机物空间分布特征及来源分析[J]. 环境科学, 2016, 37(8): 3017-3025. Chen Y J, Hu W X, Pang S J, et al. Spatial distribution characteristics and source analysis of dissolved organic matter in Beiyun River[J]. Environmental Science, 2016, 37(8): 3017-3025. |
| [29] |
鲍林林, 陈永娟, 王晓燕. 北运河沉积物中氨氧化微生物的群落特征[J]. 中国环境科学, 2015, 35(1): 179-189. Bao L L, Chen Y J, Wang X Y. Diversity and abundance of ammonia-oxidizing prokaryotes in surface sediments in Beiyun River[J]. China Environmental Science, 2015, 35(1): 179-189. |
| [30] | Luesken F A, Zhu B L, van Alen T A, et al. PmoA primers for detection of anaerobic methanotrophs[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(11): 3877-3880. DOI:10.1128/AEM.02960-10 |
| [31] | Shen L D, Wu H S, Liu X, et al. Cooccurrence and potential role of nitrite-and nitrate-dependent methanotrophs in freshwater marsh sediments[J]. Water Research, 2017, 123: 162-172. DOI:10.1016/j.watres.2017.06.075 |
| [32] | Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4:molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution, 2007, 24(8): 1596-1599. DOI:10.1093/molbev/msm092 |
| [33] | Schloss P D, Handelsman J. Introducing DOTUR, a computer program for defining operational taxonomic units and estimating species richness[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(3): 1501-1506. |
| [34] | Schloss P D, Westcott S L, Ryabin T, et al. Introducing mothur:open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(23): 7537-7541. DOI:10.1128/AEM.01541-09 |
| [35] | Assenov Y, Ramírez F, Schelhorn S E, et al. Computing topological parameters of biological networks[J]. Bioinformatics, 2008, 24(2): 282-284. DOI:10.1093/bioinformatics/btm554 |
| [36] | Su G, Kuchinsky A, Morris J H, et al. GLay:community structure analysis of biological networks[J]. Bioinformatics, 2010, 26(24): 3135-3137. DOI:10.1093/bioinformatics/btq596 |
| [37] | Widder S, Besemer K, Singer G A, et al. Fluvial network organization imprints on microbial co-occurrence networks[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111(35): 12799-12804. DOI:10.1073/pnas.1411723111 |
| [38] | Parks D H, Tyson G W, Hugenholtz P, et al. STAMP:statistical analysis of taxonomic and functional profiles[J]. Bioinformatics, 2014, 30(21): 3123-3124. DOI:10.1093/bioinformatics/btu494 |
| [39] | Revelle W. Psych: procedures for personality and psychological research, Northwestern University, Evanston, Illinois, USA[EB/OL]. https://CRAN.R-project.org/package=psych.html, 2017-04-20. |
| [40] | Oksanen J, Guillaume Blanchet F, Friendly M, et al. Vegan: community ecology package. R package version 2. 4-3[EB/OL]. https://CRAN.R-project.org/package=vegan.html, 2017-08-16. |
| [41] | Ho A, Vlaeminck S E, Ettwig K F, et al. Revisiting methanotrophic communities in sewage treatment plants[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2013, 79(8): 2841-2846. DOI:10.1128/AEM.03426-12 |
| [42] | Yan P Z, Li M C, Wei G S, et al. Molecular fingerprint and dominant environmental factors of nitrite-dependent anaerobic methane-oxidizing bacteria in sediments from the Yellow River estuary, China[J]. PLoS One, 2015, 10(9): e0137996. DOI:10.1371/journal.pone.0137996 |
| [43] | Chen J, Zhou Z C, Gu J D. Complex community of nitrite-dependent anaerobic methane oxidation bacteria in coastal sediments of the Mai Po wetland by PCR amplification of both 16S rRNA and pmoA genes[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(3): 1463-1473. DOI:10.1007/s00253-014-6051-6 |
| [44] | Wang Y, Huang P, Ye F, et al. Nitrite-dependent anaerobic methane oxidizing bacteria along the water level fluctuation zone of the Three Gorges Reservoir[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2016, 100(4): 1977-1986. DOI:10.1007/s00253-015-7083-2 |
| [45] |
周蓉, 祝贵兵, 周磊榴, 等. 稻田土壤反硝化厌氧甲烷氧化菌的时空分布与群落结构分析[J]. 环境科学学报, 2015, 35(3): 729-737. Zhou R, Zhu G B, Zhou L L, et al. Spatial-temporal distribution and community structure analysis of nitrite-dependent anaerobic methane-oxidizing bacteria in paddy soil[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2015, 35(3): 729-737. |
| [46] | Foley J A, DeFries R, Asner G P, et al. Global Consequences of land use[J]. Science, 2005, 309(5734): 570-574. DOI:10.1126/science.1111772 |
| [47] | Erol A, Randhir T O. Watershed ecosystem modeling of land-use impacts on water quality[J]. Ecological Modelling, 2013, 270: 54-63. DOI:10.1016/j.ecolmodel.2013.09.005 |
| [48] | Walsh C J, Roy A H, Feminella J W, et al. The urban stream syndrome:current knowledge and the search for a cure[J]. Journal of the North American Benthological Society, 2005, 24(3): 706-723. DOI:10.1899/04-028.1 |
| [49] | Paul M J, Meyer J L. Streams in the urban landscape[J]. Annual Review of Ecology and Systematics, 2001, 32: 333-365. DOI:10.1146/annurev.ecolsys.32.081501.114040 |
| [50] | Kohler T J, Heatherly Ⅱ T N, El-Sabaawi R W, et al. Flow, nutrients, and light availability influence Neotropical epilithon biomass and stoichiometry[J]. Freshwater Science, 2012, 31(4): 1019-1034. DOI:10.1899/11-141.1 |
| [51] | Tank J L, Dodds W K. Nutrient limitation of epilithic and epixylic biofilms in ten north American streams[J]. Freshwater Biology, 2003, 48(6): 1031-1049. DOI:10.1046/j.1365-2427.2003.01067.x |
| [52] |
单保庆, 菅宇翔, 唐文忠, 等. 北运河下游典型河网区水体中氮磷分布与富营养化评价[J]. 环境科学, 2012, 33(2): 352-358. Shan B Q, Jian Y X, Tang W Z, et al. Temporal and spatial variation of nitrogen and phosphorus and eutrophication assessment in downstream river network areas of North Canal River watershed[J]. Environmental Science, 2012, 33(2): 352-358. |
| [53] |
陈永娟, 庞树江, 耿润哲, 等. 北运河水系主要污染物通量特征研究[J]. 环境科学学报, 2015, 35(7): 2167-2176. Chen Y J, Pang S J, Geng R Z, et al. Fluxes of the main contaminant in Beiyun River[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2015, 35(7): 2167-2176. |
| [54] | Gotelli N J, McCabe D J. Species co-occurrence:a meta-analysis of J. M. diamond's assembly rules model[J]. Ecology, 2002, 83(8): 2091-2096. DOI:10.1890/0012-9658(2002)083[2091:SCOAMA]2.0.CO;2 |
| [55] | Fuhrman J A. Microbial community structure and its functional implications[J]. Nature, 2009, 459(7244): 193-199. DOI:10.1038/nature08058 |
| [56] | Barberán A, Bates S T, Casamayor E O. Using network analysis to explore co-occurrence patterns in soil microbial communities[J]. The ISME Journal, 2012, 6(2): 343-351. DOI:10.1038/ismej.2011.119 |
| [57] | Freedman Z B, Zak D R. Atmospheric N deposition alters connectance, but not functional potential among saprotrophic bacterial communities[J]. Molecular Ecology, 2015, 24(12): 3170-3180. DOI:10.1111/mec.13224 |
| [58] | Fuhrman J A, Steele J A. Community structure of marine bacterioplankton:patterns, networks, and relationships to function[J]. Aquatic Microbial Ecology, 2008, 53(1): 69-81. |
| [59] | Newman M E J. Modularity and community structure in networks[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, 103(23): 8577-8582. DOI:10.1073/pnas.0601602103 |
| [60] | Montoya J M, Pimm S L, Solé R V. Ecological networks and their fragility[J]. Nature, 2006, 442(7100): 259-264. DOI:10.1038/nature04927 |
| [61] | Saavedra S, Stouffer D B, Uzzi B, et al. Strong contributors to network persistence are the most vulnerable to extinction[J]. Nature, 2011, 478(7368): 233-235. DOI:10.1038/nature10433 |
| [62] | Williams C J, Frost P C, Morales-Williams A M, et al. Human activities cause distinct dissolved organic matter composition across freshwater ecosystems[J]. Global Change Biology, 2016, 22(2): 613-626. DOI:10.1111/gcb.13094 |
| [63] |
陈艳丽, 范远东, 孙鹏. 应用模糊综合评判法评价浑河干流水质[J]. 水生态学杂志, 2012, 33(2): 39-42. Chen Y L, Fan Y D, Sun P. Fuzzy comprehensive evaluation on water quality of mainstream of Hun River[J]. Journal of Hydroecology, 2012, 33(2): 39-42. |
| [64] | Allison S D, Martiny J B H. Resistance, resilience, and redundancy in microbial communities[J]. Proceedings of the National academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105(S1): 11512-11519. |
| [65] |
丁维新, 蔡祖聪. 氮肥对土壤氧化甲烷的影响研究[J]. 中国生态农业学报, 2003, 11(2): 50-53. Ding W X, Cai Z C. Effect of nitrogen fertilizers on methane oxidation in soils by methanotrophs[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2003, 11(2): 50-53. |
| [66] | Siegert M, Taubert M, Seifert J, et al. The nitrogen cycle in anaerobic methanotrophic mats of the Black Sea is linked to sulfate reduction and biomass decomposition[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2013, 86(2): 231-245. DOI:10.1111/fem.2013.86.issue-2 |
| [67] | Ding Z W, Ding J, Fu L, et al. Simultaneous enrichment of denitrifying methanotrophs and anammox bacteria[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98(24): 10211-10221. DOI:10.1007/s00253-014-5936-8 |
| [68] | Hu S H, Zeng R J, Haroon M F, et al. A laboratory investigation of interactions between denitrifying anaerobic methane oxidation (DAMO) and anammox processes in anoxic environments[J]. Scientific Reports, 2015, 5: 8706. DOI:10.1038/srep08706 |
| [69] | Wang J Q, Shen L D, He Z F, et al. Spatial and temporal distribution of nitrite-dependent anaerobic methane-oxidizing bacteria in an intertidal zone of the East China Sea[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2017, 101(21): 8007-8014. DOI:10.1007/s00253-017-8521-0 |
| [70] | Fu L, Ding J, Lu Y Z, et al. Nitrogen source effects on the denitrifying anaerobic methane oxidation culture and anaerobic ammonium oxidation bacteria enrichment process[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2017, 101(9): 3895-3906. DOI:10.1007/s00253-017-8163-2 |