2018, Vol. 39
2. 合肥工业大学资源与环境工程学院, 合肥 230009;
3. 中国地质大学(北京)中国地质科学院, 北京 100083;
4. 河北省地下水污染机理与修复重点实验室, 石家庄 050061;
5. 中国地质调查局地下水污染机理与修复重点实验室, 石家庄 050061
2. School of Resources and Enviromental Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China;
3. Chinese Academy of Geological Sciences, China University of Geosciences(Beijing), Beijing 100083, China;
4. Key Laboratory of Groundwater Remediation of Hebei Province, Shijiazhuang 050061, China;
5. Key Laboratory of Groundwater Remediation of China Geological Survey, Shijiazhuang 050061, China
采油井场是石油污染最为集中的场地之一, 其来源于成井时期的井喷、钻井泥浆及开采过程中的漏油事故.这些石油不仅影响到周边农田的耕地和粮食安全, 若其迁移到地表或地下水体, 还会威胁生态和人体健康[1].石油能够被微生物降解已成为科学家们的共识.人们利用微生物这一特性, 为石油污染环境的修复做了大量工作[2~6].由于微生物之间存在着竞争和协作等相互关系[7], 微生物功能的发挥是在一定的群落结构进行的[8].因此, 石油污染与微生物群落结构的关系成为功能微生物资源开发方面关注的重点[9].人们研究了不同油田、不同污染程度、不同深度土壤的微生物群落结构[9, 10], 结果均显示, 石油含量是造成微生物群落结构差异的最主要因素.一般认为, 采油井场的石油污染多集中在土壤表层, 由于土壤的吸附作用和黏滞效应, 石油类污染物很难迁移进入深部土壤[11].因此, 人们对于该类场地的研究多集中在表层(0~50 cm), 而深层土壤, 尤其是采油井场不同深度土壤的微生物种群结构鲜有研究.
在以前的调查研究中发现, 采油井场的深部土壤(大于50 cm), 同样受到了不同程度的污染[12].该层位是表层落地原油进入含水层的必经通道.该区域土壤对石油的降解程度直接影响着地下水的水质安全程度.而石油的降解主要靠微生物的代谢作用[13].因此, 对深层土壤的微生物种群结构研究具有重要意义.微生物在降解石油烃的过程中需要包括氧气和硝酸盐等在内的电子受体[14], 还需要氮源等营养[15].相对于表层土壤, 深层土壤缺少氧气, 处于相对厌氧状态.并且一般污染场地污染时代比较久远, 微生物的生命活动消耗了大量的电子受体和氮源, 所以石油污染场地土壤一般处于贫营养和缺电子受体状态.因此, 深部土壤的微生物群落结构应该不同于井场表层土壤和未污染土壤.但是该环境下微生物群落结构有何特性, 这些微生物对石油烃的降解潜力如何, 这是需要回答的问题.
在以往的研究中, 人们注意到泥浆池是采油井场中重要污染源[16], 但对其的微生物群落结构研究较少.泥浆池部位土壤往往是高盐高油环境[17].该环境常被视作极端环境, 微生物存活难度大[18].该区域是否有石油降解菌, 能否支持以后的修复工作, 这也是需要研究的问题.
针对以上问题, 本研究选取中原油田某一废弃石油污染井场, 对油井旁持续污染区、井场曾经污染区、原泥浆池区和周边农田区这4个不同位置, 0~400 cm不同深度土壤进行调查取样.利用高通量测序技术, 对这些样品进行基于16S rRNA基因V4区序列进行测定, 结合土壤石油含量、三氮等物理化学性质的分析, 通过了解不同污染条件、不同深度下的微生物群落结构变化特征, 以期为后续修复方案的制定提供理论基础.
1 材料与方法 1.1 研究场地和取样本次研究选取中原油田某一废弃井场为研究对象.该井场建成于2000年, 仅开采1 a就因产量低而废弃.但迄今为止, 该井口一直有石油不断渗出, 对井口南部造成持续性严重污染.据了解, 该井在钻井过程中发生过井喷, 井喷方向为北向.在该井场的东北部, 有成井时的泥浆池, 其中可能存在大量的含油泥浆.成井以后, 该场地上部覆盖有20 cm的不含油土壤.井场的示意图如图 1所示.本研究在该油井南部持续污染区(W)、井场曾经污染区(S)、原泥浆池位置区域(M)和农田(F)布置了4个采样点.利用洛阳铲, 对这些采样点0~400 cm不同深度土壤样品进行了采集.其中一部分样品用无菌小刀放入无菌采样袋, 并置于干冰保温箱中进行保存, 并尽快运回实验室存于-86℃冰箱.该部分样品用于DNA提取及后续的测序分析.另一部分样品存入自封袋, 运回实验室自然风干, 用于测定其物化性质.
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图 1 调查场地及取样示意 Fig. 1 Diagrammatic sketch of the site and sampling locations |
取回的土样送回实验室后自然风干, 研磨, 过2 mm筛子后进行物化性质测试.土壤石油含量的测定采用超声-紫外法[19]. pH值和电导率(EC)分别采用pH计和电导率仪测定水土比为5 :1的水溶液读数; 含水量(MC)用105℃烘干法; 铵(NH4+)采用靛酚蓝分光光度法; NO2-采用重氮-偶合分光光度法; NO3-采用紫外分光光度法.其中石油和三氮(NH4+、NO2-和NO3-)含量测定两次.具体方法详见文献[20].
1.3 DNA提取、PCR扩增、MiSeq文库构建与测序将样品在冰上融化后, 充分混匀并离心, 取0.5 g湿土, 利用MP的FastDNATM Spin Kit for Soil试剂盒进行DNA抽提, 利用1%琼脂糖凝胶电泳对DNA质量进行检测, 用Nano Drop 2000对其进行质量浓度测定.利用兼顾细菌和古菌的扩增引物, 515F(GTGYCAGCMGCCGCGGTAA)和806R(GGACTA CNVGGGTWTCTAAT), 对16S rRNA基因的V4区进行扩增, 片段大小约为291bp[21].试剂为TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase, 扩增仪为ABI GeneAmp® 9700型, 体系为20μL.将扩增后的产物进行回收, 利用美吉生物公司的MiSeq测序平台进行测序.
1.4 数据统计分析首先进行测序数据的质控过滤与拼接, 具体方法和参数如下[22]:过滤reads尾部质量值20以下的碱基, 设置50bp的窗口, 如果窗口内的平均质量值低于20, 从窗口开始截去后端碱基, 过滤质控后50bp以下的reads, 去除含N碱基的reads.根据PE reads之间的overlap关系, 将成对reads拼接成一条序列, 最小overlap长度为10bp.拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2, 筛选不符合序列.根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品, 并调整序列方向, barcode允许的错配数为0, 最大引物错配数为2.在此过程中使用软件为FLASH和Trimmomatic.
对优化序列的非重复序列(不含单序列), 按照97%相似性聚类进行可操作单元(operational taxonomic unit, OTU)聚类, 在聚类过程中去除嵌合体, 得到OTU的代表序列.按最小样本序列数进行样本序列抽平.为了得到每个OTU对应的物种分类信息, 采用RDP(ribosomal database project) classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学比对, 在phylum(门)和genus(属)分类水平上统计各样本的群落组成, 物种分类数据库为silva128/16S[23].
基于该分类, 在属(gene)水平上进行了群落组成分析, 在OUT水平上进行了α多样性分析和β多样性分析. α多样性分析主要有反映群落丰富度的Chao、ACE和Sobs指数, 反映群落多样性的Shannon和Simpson指数, 以及反映测序深度的覆盖度. β多样性分析采用Weighted normalized unifrac距离算法的主坐标分析(PCoA).在该分析的基础上, 按照取样点位置, 把样品分为W、S、M和F这4个组.为分析物种、环境和样品之间的关系, 对分组样品进行了典型关联分析(CCA).为了了解不同物种在组间的差异, 利用克氏秩和检验法, 在OUT水平上, 对样品进行了组间差异显著性检验分析, 其中, 显著性P值多重检验校正方法采用fdr, CI计算方法采用scheffe.这些分析在I-sanger云平台(http://www.i-sanger.com/)完成.
2 结果与分析 2.1 物理化学性质根据文献分析方法, 对采集样品的物化性质进行测定, 结果如表 1所示. W点的上部(深度小于100 cm)和M点的中部(50~100 cm)受到了石油的严重污染.井场W、S、M点的电导率明显高于F点, 证明该井场的这些部位曾受到过油盐污染, 这与前期调查结果相一致.但是S点50 cm及其以下样品具有较低的石油含量, NO3-含量也明显偏低, 证明该点的石油烃发生了较为强烈的自然衰减.因为微生物对石油烃的降解过程中, 要利用电子受体[24].而NO3-是除O2之外的最佳电子受体[14].电子受体的减少证明了自然衰减的发生[25]. M点样品EC及pH值较高, 是一个高盐碱性极端环境.其NH4+含量低, 而NH4+是微生物的最佳氮源[26], NH4+的减小说明该极端环境中仍有微生物的生长. W点有石油的持续渗入, 其表层20 cm处的土壤NO3-和NO2-表层含量较高, 可能有外来的NH4+或NO3-输入. 20 cm以下土壤硝酸盐含量较低, 而硝酸盐具有较强的随水迁移能力, 说明该氮源输入后可能降水量较小, 不足以使硝酸盐迁移到下部土壤.该点50 cm及以下样品NO3-含量较低而石油含量中等, 可能正在发生着石油烃的微生物降解.
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表 1 场地土壤石油含量、物理化学性质和提取DNA质量浓度 Table 1 Oil contents, physico-chemical parameters, and DNA concentrations in soils at the site |
2.2 稀释曲线与α多样性指数分析
样本序列抽平后, 每个样本得到38 942个序列.根据序列数和OUT数目、Shannon指数绘制稀释曲线(图 2).从图 2中可以看出, 在该测序深度上, 样品的稀释曲线在0.97相似性水平下趋于平坦, 覆盖度大于0.98, 显示了本次测序具有很好的覆盖度, 数据可靠性高.
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图 2 OTU和Shannon指数稀释曲线 Fig. 2 Rarefaction curves of operational taxonomicunits and Shannon indices |
表 2展示了该场地样品的α多样性指数随位置和深度的变化情况.其中Chao、Ace和Sobs指数用于分析群落物种丰富程度, 它的数值越大, 表示物种种类越多. Shannon和Simpson指数是反映分析群落的多样性的两个指数, 它们不仅反映物种丰富度, 还指示了物种的均匀度. Shannon数值越大, 表示该样品中的物种多样性越高, 而Simpson指数反之[27].总体上来看, Chao、Ace、Sobs和Shannon指数随着深度的增加而增加, 油井旁(W)和泥浆池(M)土样的指数普遍小于其它采样点土样.而Simpson指数与上述4个指数的变化规律正好相反.这表明了表层和含油量高的土样物种多样性较低.从DNA提取质量浓度(表 1)可以看出, 对于微生物量而言, 表层土壤大于深部土壤, 这与多样性指数相反.表层土壤由于有充足的氧气而使微生物大量繁殖, 但是这会使优势物种得到大量繁殖, 减少了物种的多样性.尤其是石油含量较高的油井50 cm上部土壤, 由于石油的微生物毒害性, 物种丰富度大量减少, 而剩余的嗜油菌等物种大量繁殖.
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表 2 样品α多样性指数 Table 2 Microbial α-diversity in samples |
2.3 种群组成及相关性分析
各样品在门水平上的种群组成如图 3所示.从整体上看, 除了农田100 cm和200 cm样品外, 其它样品的Proteobacteria、Chloroflexi和Actinobacteria丰度之和均超过了50%.尤其W点的表层0~50 cm土壤, 其丰度之和超过了80%. Actinobacteria在不同采样点的丰度变化值比较小. Proteobacteria在W和M采样点有较高的丰度.而Chloroflexi在除150和200 cm外的W点样品中具有相对较高的丰度.在F点的样品中, Proteobacteria、Actinobacteria和Thaumarchaeota丰度随着深度的增加而减少, 而Chloroflexi、Nitrospirae(除300 cm)、一门未分类菌(unclassified)和其它丰度小于2%菌门(others)的丰度随着深度的增加而增加.其它采样点没有发现菌门随深度变化而有规律的变化特征.
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(a)W; (b)S; (c)M; (d)F 图 3 不同采样点在门水平(丰度＞2%)的微生物种群结构 Fig. 3 Microbial community members at the phylum level (abundance>2%) in samples collected at different locations |
各采样点在属水平上的群落组成如图 4所示.从中可以看出, 相比于其它样品, 油井(W)采样点50 cm之上土壤的群落结构较为特殊, 其norank_ f__Anaerolineaceae(Chloroflexi门)和Marinobacter (Proteobacteria门)两个菌属丰度之和大于45%.
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图 4 不同采样点在属水平(丰度＞2%)的微生物种群结构 Fig. 4 Microbial community members at the genus level (abundance>2%) in samples collected at different locations |
对这两个属在种水平上进行分类. norank_ f_Anaerolineaceae在这3个土壤中均为Anaerobic digester metagenome, 而在其它样品中均属于未分类种(norank). Anaerobic digester metagenome最初发现于厌氧消化池中, 能够降解糖和蛋白质等有机物[28].也有科学家发现它能够降解短链烷烃[29]. Marinobacter属在这3个土壤中OTU序列和Marinobacter hydrocarbonoclasticus strain有99%的相似度, 可以认为是同种微生物, 该菌耐盐, 并能够降解多种烃类[30].
对比不同取样点可以发现, 场地(S)50~350 cm和农田(F)所取土样具有较为相似的种群结构.菌属以norank_ f_Anaerolineaceae、Nitrospira(Nitrospirae门)、一种未分类细菌(unclassified_norank_d_Bacteria)、norank_ f_Gemmatimonadaceae(Gemmatimonadetes门)、norank_c_Acidobacteria (Acidobacteria门)、norank_c_S085(Chloroflexi门)、norank_ f_OM1_clade(Actinobacteria门)等细菌为主, 并且这几种菌丰度相差不大.在这些菌属中, 除norank_ f_Anaerolineaceae外, 其余均未在严重污染土样中(W点的0~50 cm样品)高丰度出现.对比石油含量还可以发现, 这些样品的石油含量较低, 并且没有出现石油降解指示菌, 如Marinobacter和Alkanindiges.因此, 该群落结构指示了较为健康的土壤生态结构.这也表明, 场地中部历史污染土壤, 在没有持续性石油污染情况下, 土壤中的石油能够发生自然衰减而使土壤得到修复.
PCoA分析(图 5)可以看出样本之间群落组成的差异性.不同的颜色表示不同类型取样点, 不同形状表示不同的采样深度.从图 5中可以看出, 相对于形状, 同一种颜色较为集中. W样品主要分布于PC1轴的负值区域, M样品分布于PC1轴的零值左右, 而S和F样品分布于PC1轴的正值区域.这说明, 相对于不同深度, 不同取样点是造成菌群结构的最主要影响因素.
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图 5 不同采样点不同深度样品PCoA分析 Fig. 5 Principal coordinate analysis plot of samplescollected at different locations and depths |
W的100 cm以上样品PC1值严重偏负, 与其它样品偏离较远.这些样品石油含量较高, 受石油的影响, 菌群中丰度较大的菌多以石油降解或石油耐受菌为主.农田(F点)耕作层(深度小于50 cm)和S点20 cm处, 由于长期耕作或近地表, 具有较为充足的氧气, 和深部土样优势菌有较为明显的差异.除了M的200 cm以上部位和W的400 cm样品外, 所有点100 cm及以下土样的菌群结构较为一致.若该场地无污染, 在不同位置所采集微生物样本应该和农田采样点具有相似的群落结构.而受石油污染影响, 不同污染区域的菌群结构不同.因此, 该场地微生物群落结构受石油含量和深度共同影响.
由于不同取样点是造成菌群结构的最主要影响因素, 因此, 同一取样点的土样归为一组, 共分为W、S、M和F这4组.根据分组绘制OTU分布韦恩图(图 6).从图 6中可以看出, 这4个采样点共有OTU数目为2131个, M、W、S和F独有OTU数目分别为275、140、104和49个.每个采样点独有OTU数目远小于共有数目, 说明该场地的微生物种类大体上一致的. M点受到石油、盐和泥浆的多重作用, 具有最多数目的独有OTU.而W和S正接受, 或曾经受到过石油污染, 具有较多数目的独有OTU.而F没受到污染, 具有较少的独有OTU.这表明, 石油等污染在较小程度上改变了微生物物种种类.
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图 6 OTU分布维恩图 Fig. 6 Venn diagram showing the distributionof operational taxonomic units |
利用克氏秩和检验法, 在OUT水平上, 对W、S、M和F这4组样品进行了组间差异显著性检验分析, 图 6展示了有统计学差异的前10的OTU.从中可以看出, OTU7762、OTU9858、OTU3447、OTU8701、OTU7765和OTU6181组间样品具有极其显著的统计学差异(P < 0.001), 其序列经过NCBI BLAST比对, 对应的物种依次为: Anaerobic digester metagenome(99%)、Marinobacter hydrocarbonoclasticus strain(99%)、一种未培养古菌克隆BC-F(Uncultured archaeon clone BC-F)(96%)、Marinobacter hydrocarbonoclasticus strain(99%)、Alkanindiges sp.(99%)和Uncultured desulfuromonadales bacterium(99%).其中OTU7762、OTU9858、OTU8701和OTU7765在W采样点中的丰度远大于其余3个采样点, 其对应的Anaerobic digester metagenome[29](99%)、Marinobacter hydrocarbonoclasticus strain[30]和Alkanindiges sp.[31](99%)均属于石油降解菌. OTU3447在M采样点中的丰度远高于其他3组, 其对应的物种为Uncultured archaeon clone BC-F(96%), 是与石油污染的滨海沉积物有关的古菌[32], 说明其可能为耐盐烃类降解菌. OTU6181分布丰度从大到小依次为S、F、M和W, 其对应的微生物desulfuromonadales bacterium中的H16属, 和硫代谢有关, 石油影响了该菌的繁殖. OTU7811组间样品具有显著的统计学差异(P < 0.01), 仅在含油样品W和M中大量出现, 其对应的物种为Anaerolineaceae科, 可能也与石油烃降解相关. OTU7352、OTU3693和OTU9577具有统计学差异(P < 0.05). OTU7352对应奇古菌门下的SCG(soil crenarchaeotic group)纲, 丰度从大到小依次为F、S、M(W).可见, 该菌对石油较为敏感. OTU3693对应的物种为Acidimicrobiales目下的OM 1_clade属bacterium_YC-LK-LKJ36 种(99%), 该种从盐湖中分离出来, 为中度嗜盐菌[33], 该菌指示了土壤盐分的高低. OTU9577对应甲基杆菌属(Methylobacter), 主要消化以甲烷为代表的化合物[34].该物种在W采样点中丰度较高(图 7), 在S中有少量分布, 说明这些位置的样品有较为充裕的简单甲基化合物.这些石油降解菌在石油污染土壤的大量出现, 显示了该场地石油烃自然衰减的巨大潜力.
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图 7 组间差异显著性检验分析 Fig. 7 Statistical significance of differences between groups |
为了寻求样品、物种和环境变量之间的关系, 对样品数据做了CCA分析, 结果如图 8所示.从环境因子来看, 石油含量、电导率(EC)、三氮(NH4+、NO2-和NO3-)含量与采样深度的夹角为钝角, 其关系为负相关[35], 说明这些石油、盐离子和氮素都来源于地表, 通过下渗进入到土壤深部.石油含量和电导率正相关, 说明石油和盐分同源. CCA分析图的主轴CCA1几乎与石油含量轴平行, 且箭头最长, 说明石油含量是影响微生物种群结构的最主要因素. W点样品沿三氮轴分布, 说明三氮对其种群结构影响较大.而M点样品沿EC轴分布, 证明盐度对其种群结构有较大影响[36].而F和S大部分点样品聚在一起, 说明其有较为相似的种群结构和环境因子.从物种(OTU)分布来看, 大部分优势物种集中在一起, 并且与F和S点的样品点具有较近的距离, 说明健康土壤物种具有相似的种群结构.有几个特殊的物种(OTU)分布在高油高盐样品区域, 其中, OTU9858和OTU7762距离高含量石油污染的W点20 cm和50 cm样品较近, OTU7811距离W点100 cm样品较近, OTU3447和OTU3693距离M点的50 cm样品较近.其序列经过NCBI BLAST比对, OTU9858和OTU7762对应的物种Marinobacter hydrocarbonoclasticus strain和Anaerobic digester metagenome都具有烃降解能力. OTU7811对应的物种属于Anaerolineaceae科未分类菌, 可能具有烃降解能力[29]. OTU3447对应的物种为Uncultured archaeon clone BC-F(96%), 是与石油污染的滨海沉积物有关的古菌[32]. OTU3693对应的物种为Acidimicrobiales目下的OM 1 _clade属bacterium_YC-LK-LKJ 36 种(99%), 该种从盐湖中分离出来, 为中度嗜盐菌[33].因此, 这几种分布在高油或高盐样品点周围的特殊物种(OTU)具有降解石油烃的能力或具有嗜盐性.
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图 8 样品、环境因子和OTUs关系CCA分析 Fig. 8 Canonical correlation analysis plot of relationships between samples, environmental factors, and operational taxonomic units |
(1) 石油含量和盐度是影响该场地微生物群落结构的最主要环境因子.
(2) 在石油持续输入情况下, 表层聚集有大量的石油和石油烃降解微生物.土壤深部(深度＞50 cm)仍然有石油污染, 并且有石油烃降解微生物存在.该处微生物群落结构与农田健康土壤有很大不同.
(3) 泥浆池污染区域受盐度和石油影响, 聚集有嗜盐噬油古菌.该处土壤微生物群落结构也不同于农田健康土壤.
(4) 历史污染区域土壤具有较低的石油含量, 其群落结构和农田健康土壤相似, 说明了在没有持续性石油污染条件下, 石油烃会经自然衰减作用而使土壤得到修复.
(5) 因此, 该石油污染井场具有丰富的石油烃降解微生物, 对于类似石油污染场地的修复, 应在污染源控制的同时, 制定合理措施来充分发挥场地自身微生物降解石油的潜力.
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