2018, Vol. 39
活性污泥胞外多聚物EPS作为活性污泥的重要组成部分, 主要来源于微生物分泌物、细菌表面脱落物质、细胞裂解产物、水解产物以及对周围环境中有机或无机物质的吸附, 其在污水生物处理系统中具有重要作用[1, 2]. EPS组成成分包括蛋白质、多糖、腐殖酸、核酸和脂类等, 其中蛋白质和多糖占EPS总量的70%~80%[3]. EPS具有独特的分层结构, 由外而内分别为溶解型EPS(soluble EPS, SEPS), 松散结合型EPS(loosely bound EPS, LB-EPS)和紧密结合型EPS(tightly bound EPS, TB-EPS)[4, 5]. EPS可在微生物细胞外部形成缓冲层来保护细胞, 为微生物生命活动提供相对稳定的生存环境[6, 7].聚合物架桥理论表明, EPS带有负电荷, 可与二价或三价阳离子相互吸引将废水中的游离细菌及悬浮物质通过网捕作用加以去除[8].任丽飞等[9]在污水处理系统外源加入Ca2+, 结果表明150 mg ·L-1的Ca2+可促进EPS产生, 改善活性污泥沉降性能; 含有铅、镉、锌等金属离子的工业废水进入活性污泥系统, EPS中带负电荷的基团如羧基、羟基等, 可与污水中的重金属离子相互作用提高污水处理厂出水水质[7].因此, 了解和研究EPS组分、基团及元素含量对改进活性污泥工艺性能非常关键.
活性污泥SEPS和LB-EPS通常采用离心法提取, EPS的不同提取方法一般针对TB-EPS而言[1, 10]. TB-EPS的提取方法分为物理法和化学法两大类.物理法主要包括离心、超声、加热等方法; 化学法根据加入的提取剂主要分为EDTA、NaOH、甲醛+NaOH、甲醛+EDTA、阳离子交换树脂(cation exchange resin, CER)等[1]. EPS的提取效率和组成与其所采用的提取方法密切相关[11].周俊等[10]采用加热法提取出活性污泥的TB-EPS主要组分为蛋白质, 谢丹瑜等[12]采用CER法提取出活性污泥的TB-EPS主要组分为多糖, EPS提法方法不同, 使得不同研究者的实验结果难以进行比较.尽管国内外有许多关于活性污泥EPS提取方法的研究, 为人们深入理解EPS的组成、提取技术奠定了重要的基础，但这些研究往往着眼于某种提取方法的条件优化[13], 或仅仅比较EPS提取总量及多糖、蛋白质等成分含量的差异[14], 对于提取方法如何影响EPS的有机物组分、官能团种类及元素含量等鲜见报道, 也未见将8种EPS提取方法一起进行比较.本研究运用离心法提取活性污泥SEPS和LB-EPS后, 采用国内外文献中提到的物理法(离心、超声、加热)和化学法(CER、EDTA、NaOH、甲醛+EDTA、甲醛+NaOH)提取活性污泥TB-EPS, 测定TB-EPS中多糖、蛋白质、DNA和元素含量, 同时借助红外光谱、三维荧光光谱及电感耦合等离子体质谱等分析手段全面比较提取方法对EPS组分、基团组成及元素含量的影响, 以期为研究者根据不同实验目的选择适宜的EPS提取方法提供方法指导.
1 材料与方法 1.1 实验用污泥本实验所用活性污泥为南京某城市污水处理厂二沉池回流污泥, 该污水处理厂采用A2/O脱氮除磷工艺.污泥取回后, 用超纯水(18 MΩ ·cm)洗涤2次, 然后用超纯水稀释至混合液污泥浓度(mixed liquor suspended solids, MLSS)为4 g ·L-1, 4℃保存, 用于后续EPS提取方法的比较.
1.2 EPS的提取方法分别取3份800 mL污泥样品, 在台式冷冻离心机(Centrifuge 5810R, Eppendorf)中4℃、2 000 r ·min-1离心15 min, 收集上清液, 上清液中含有SEPS.剩余污泥用去离子水再悬浮至原体积, 4℃、5 000 r ·min-1离心15 min, 收集上清液, 上清液中含有LB-EPS.剩余污泥用去离子水再悬浮至原体积, 4℃保存, 每份污泥均采取8种不同方法提取TB-EPS[4].
(1) 离心法 污泥在4℃、20 000 r ·min-1下, 离心20 min[5, 15].
(2) 超声法 污泥在超声仪(KQ-700DE, 昆山市超声仪器公司)中40 W超声2 min[11, 16].
(3) 加热法 污泥置于恒温水槽(HS-800D, 太仓科教器材厂), 80℃水浴加热10 min[15].
(4) CER法 树脂(Dowex 50WX8 hydrogen form, 100~200 mesh, Sigma-Alorich, 美国)投加量(以CER/VSS计)为75 g ·g-1, 然后在4℃、180 r ·min-1下, 摇瓶柜(HYL-A, 太仓强乐)振荡3 h[15].
(5) NaOH法 1 mol ·L-1 NaOH逐滴加入至污泥样品中, 调节污泥样品pH至11, 在4℃、180 r ·min-1下振荡3 h[17, 18].
(6) 甲醛+NaOH法 将0.6 mL的37%甲醛(体积分数)加入污泥中, 然后向污泥中逐滴加入1 mol ·L-1 NaOH调节pH至11, 在4℃、180 r ·min-1下振荡3 h[10, 18].
(7) EDTA法 2 % EDTA溶液(质量分数)与污泥样品1 :1(体积比)混合, 在4℃、180 r ·min-1下振荡3 h[16].
(8) 甲醛+EDTA法 将0.6 mL的37%甲醛加入污泥中, 处理后的污泥与2% EDTA溶液1 :1(体积比)混合, 在4℃、180 r ·min-1条件下振荡3 h[10].
经上述方法处理后的样品在4℃、20 000 r ·min-1, 离心20 min, 上清液即为TB-EPS, 0.45 μm微孔滤膜过滤, 4℃保存待用[3].
1.3 TB-EPS化学成分分析TB-EPS数量以总有机碳(total organic carbon, TOC)表示, 采用TOC分析仪(TOC-VCPN analyzer, Shimadzu, 日本)测定; EPS中多糖(polysaccharides, PS)采用苯酚-硫酸法测量, 以葡萄糖作为标准物质; 蛋白质(proteins, PN)采用考马斯亮蓝法测量, 以牛血清白蛋白作为标准物质; DNA采用二苯胺比色法测量, 以E. coli DNA作为标准物质[19].
1.4 三维荧光光谱分析TB-EPS三维荧光光谱(three-dimensional excitation-emission matrix fluorescence spectroscopy, 3D-EEM)采用荧光分光光度计(LS-55, Perkin-Elmer, 美国)测定.三维荧光光谱激发光源为氙弧灯, 激发波长 Ex以10 nm为增量从200 nm扫描到400 nm, 发射波长Em以0.5 nm为增量从300 nm扫描到550 nm, 激发和发射狭缝均为5 nm, 扫描速度为1 200 nm ·min-1[20].
1.5 红外光谱分析TB-EPS红外光谱(fouriertransform infrared spectrum, FT-IR)采用红外光谱仪(NEXUS 870FT, 日本)分析. EPS在-80℃冰箱(SANYO, 日本)冷冻24 h后置于冷冻干燥仪(Christ ALPHA 2-4 LD, 德国)干燥处理, 干燥后样品与KBr以质量比1 :100混合, 于玛瑙研砵研匀, 取约150 mg混合物压缩成薄片进行红外光谱分析.红外光谱分析仪扫描波长为4 000~400 cm-1, 扫描次数为32次, 分辨率为4 cm-1[21].
1.6 元素含量分析TB-EPS中元素含量使用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS, NexION-300x, Perkin Elmer, 美国)分析, 测定Na、Mg、Ca、Mn、Cr、Co等15种元素[17].
1.7 数据统计和分析方法所有数据均采用3次重复的平均值±标准偏差来表示.数据统计和分析使用Excel 2016软件, 采用Origin 9.2软件绘图.
2 结果与讨论 2.1 TB-EPS化学组分提取量的比较8种不同的物理化学法所提取的污泥TB-EPS的总量(以TOC表征)见图 1(a), 蛋白质、多糖、DNA含量见图 1(b).不同提取方法提取TB-EPS的化学组分含量差别较大.从TB-EPS提取数量来看, 离心法提取的TB-EPS数量最低, 不适合EPS的后续组分分析, 一般将其作为其它提取方法的对照[16].超声法提取TB-EPS数量仅为2.87 mg ·L-1±0.11 mg ·L-1, 王淑莹等[22]认为实验采用槽式超声波发生器超声污泥, 与污泥的接触面积少, 污泥受到的剪切力较弱, 从而导致EPS剥离不彻底. EDTA和甲醛+EDTA提取TB-EPS数量高, Nguyen等[11]认为EDTA可与EPS中二价阳离子如Ca2+、Mg2+等螯合, 破坏了细胞间的主要结合机制, 对细胞产生极大损伤, 从而提取数量较高.蛋白质和多糖为EPS主要组成成分, 对污泥的颗粒化、絮凝及脱水等性能影响较大[8].张丽丽等[23]认为污泥絮凝能力与蛋白质含量呈正相关. Adav等[24]则认为由于多糖中存在负电官能团促进了污泥絮凝.从多糖提取数量看, 甲醛+EDTA法提取量最高, 为270.63 mg ·L-1±26.15 mg ·L-1, 约是离心、超声法的75倍; 从蛋白质提取数量看, EDTA法提取数量最高, 为26.02 mg ·L-1±1.97 mg ·L-1, 超声法提取蛋白质, 其含量低于检测限.除离心法外, 其它提取方法所提取的污泥TB-EPS中多糖含量都高于蛋白质含量, 这与谢丹瑜等[12]的研究结果一致.
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图 1 不同提取方法提取后污泥TB-EPS各组分含量 Fig. 1 Composition of the extracted TB-EPS by different methods |
在微生物细胞溶解数量最少、不导致EPS结构变化的前提下获得最大的EPS提取量, 是EPS提取所应遵循的原则, 一般采用DNA含量来衡量EPS提取过程中细胞溶解破碎程度[1].由图 1(b)可看出, EDTA法及甲醛+EDTA法提取的TB-EPS中DNA含量较高, 分别为192.80 mg ·L-1±9.82 mg ·L-1和139.4 mg ·L-1±15.76 mg ·L-1, 表明这两种方法对污泥微生物细胞破坏严重, 使得细胞内物质外释, 对提取成分造成污染[25].与EDTA法、NaOH法相比, 加入甲醛使得TB-EPS中DNA含量变小, 这表明甲醛可以固定细胞, 并能与细胞膜中的蛋白质和核酸结合, 抵制细胞溶解[11].离心法和超声法提取的TB-EPS中DNA含量较低, 分别为0.53 mg ·L-1±0.15 mg ·L-1和0.40 mg ·L-1±0.00 mg ·L-1, 表明该方法对细胞破坏程度较轻.综合看来, 加热法提取组分数量多且对污泥微生物细胞破坏程度较低, 在EPS提取过程不引入外源物质, 是一种较为合适的EPS提取方法.
2.2 TB-EPS的三维荧光光谱分析三维荧光光谱可表征EPS中的荧光物质, 包括芳香族蛋白质类、腐殖酸类和富里酸类物质, 但无法表征多糖组分[20]. 8种方法提取活性污泥TB-EPS的三维荧光光谱见图 2. 表 1列出了TB-EPS三维荧光光谱的荧光参数包括峰位、荧光强度等.不同的提取方法其对应的TB-EPS荧光峰强度有较大差别.离心法、超声法、EDTA法和甲醛+EDTA提取出的TB-EPS中未检测出荧光物质, 原因可能是这些方法对TB-EPS中荧光物质提取效果不高[26]. Comte等认为[16], EDTA会污染提取出的EPS, 从而导致EPS中蛋白质、腐殖质类物质分析困难.如图 2所示, 加热法、CER法、NaOH法和甲醛+NaOH法提取的污泥TB-EPS三维荧光图谱中Peak A、B和C强度很高, 表明这4种方法对芳香族蛋白质类物质有较好的提取效果, 但对富里酸类和腐殖酸类物质提取效果不佳, 仅表现出微弱峰或向外延伸的肩峰. Peak A属于高激发波长类色氨酸, Peak B仅在CER法提取的TB-EPS中检测出, 属于类酪氨酸[27], Peak C属于高激发波长类色氨酸和蛋白物质, 主要是可溶性的微生物代谢产物[28]. Peak D的中心位置约为Ex/Em=330~350/422~466, 为分子量较大, 结构复杂, 芳构化程度较高的有机物[27]. Peak E的中心位置约为Ex/Em=260~280/450~464, 为富里酸类荧光峰[21].相对于其它提取方法, CER法提取的TB-EPS荧光峰都出现了不同程度的红移, 结合图 1看出CER对活性污泥细胞有较明显的破坏, 胞内物质溶出导致与其它方法提取的TB-EPS成分存在差别[29].对于芳香族蛋白质类物质提取效率, CER法＞甲醛+NaOH法＞NaOH法＞加热法; 对于腐殖酸类物质, CER法＞NaOH法＞甲醛+NaOH法＞加热法; 对于富里酸类物质提取效率, NaOH法＞甲醛+NaOH法＞CER法＞加热法, 综合分析, CER法对活性污泥TB-EPS的芳香族蛋白质和腐殖酸类物质有较好的提取效果, NaOH法对富里酸类物质提取效果较好.
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图 2 不同提取方法提取活性污泥TB-EPS的三维荧光光谱图 Fig. 2 EEM fluorescence spectra of the activated sludge TB-EPS for different extraction methods |
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表 1 TB-EPS三维荧光光谱分析结果[21] Table 1 Fluorescence spectra parameters of the TB-EPS samples |
2.3 TB-EPS红外光谱分析
红外光谱吸收峰的位置可以用来表征物质具有的化学键及官能团, 强度可用于进行相对定量分析[21]. 图 3显示了8种方法提取TB-EPS的红外光谱图, 主要特征吸收峰的位置包括[15, 16]: 3 359~3 479 cm-1处的峰可归属于蛋白质的N—H伸缩振动和碳水化合物结合水及样品中残留水分导致的—OH伸缩振动; 2 890~2 934 cm-1的可见弱峰为蛋白质、碳水化合物和腐殖酸的脂肪链的CH2对称和不对称伸缩振动; 1 628~1 662 cm-1处峰为典型蛋白质(酰胺Ⅰ)物质的C＝O伸缩振动; 1 315~1 475 cm-1处峰为醇、酚物质的C—H面内弯曲振动和C＝O伸缩振动; 914~1 107 cm-1处峰表示多糖类物质的—OH伸缩振动; 低于900 cm-1处峰为指纹区, 多为硫、磷基团.这些物质及基团的存在对去除污水中金属离子有很大的作用[30].
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图 3 不同提取方法提取活性污泥TB-EPS的红外光谱图 Fig. 3 FT-IR spectra of the activated sludge TB-EPSfor different extraction methods |
由图 3(a)看出, 采用离心、超声和加热法提取TB-EPS得到的红外图谱峰型相似, 表明物理法提取TB-EPS对其主要官能团种类影响不明显, 但主要官能团的红外吸收峰强度按照离心、超声、加热法依次增加, 表明这些官能团的含量随着提取方法不同而增加, 这与D'Abzac等[15]的研究结果一致.由图 3(b)和3(c)可以看出, 采用化学法提取TB-EPS的峰型和峰强间区别较大.甲醛+EDTA和EDTA法提取的TB-EPS红外光谱在3024~3028 cm-1处出现氨基物质的N—H伸缩振动峰, 低于1 600 cm-1处的峰型比其它提取方法的红外谱图复杂, Liu等[31]认为EDTA与EPS之间可能会形成络合物, EDTA-EPS络合物不能通过膜过滤去除, 从而保留在TB-EPS中, 对TB-EPS官能团种类影响较大.
2.4 TB-EPS中元素含量分析在活性污泥法处理金属废水的过程中, EPS起重要作用, 其表面存在的羟基、羧基、羰基等带有负电荷的基团可以与金属离子络合, 达到吸附去除的效果[30]. 8种提取方法得到的活性污泥TB-EPS中元素含量见图 4. TB-EPS中元素含量与所采用的提取方法相关.总体上, 化学法提取出的TB-EPS中含有更高的元素含量, EDTA法及甲醛+EDTA法对TB-EPS中大部分元素提取效率均较高, 如Mn、Fe、Pb、Cd、Zn等, 但对于As, CER法提取效率最高, 对于Mo, 加热法提取效率最高.
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图 4 不同方法提取的活性污泥TB-EPS中大量元素和微量元素含量 Fig. 4 Major elements and trace elements contents in the TB-EPS extracted by different methods |
从图 4(a)可看出, 加热及超声法对TB-EPS中大量元素提取量较低, 原因是加热或超声处理会破坏细胞外基质, 导致捕获的无机离子被释放, 在提取过程中形成沉淀而无法在TB-EPS中检测[15]. NaOH法、甲醛+NaOH、EDTA法和甲醛+EDTA方法提取的TB-EPS中Na含量最高, 原因是这4种提取方法所加试剂中均含有Na+, 对测试结果造成了一定干扰. NaOH法和甲醛+NaOH法对大量元素Ca、Fe、Mg、Mn提取含量较低, 这可能是在提取过程中, Ca、Fe、Mg、Mn等金属阳离子易与OH-反应生成氢氧化物形式的沉淀而无法持留在EPS中[17]. 图 4(b)表明, 在TB-EPS中微量元素含量最高的是Zn, 其次为Cu, 这与Bourven等[17]的实验结果一致. Sun等[32]的研究表明羟基、羧基和氨基等是参与好氧活性污泥EPS对Zn和Co的吸附的主要官能团.由于TB-EPS中羟基和膦酰基的作用, 其对Cu的吸附效果较好[30]. Guibaud等[33]的研究表明活性污泥微生物EPS对Cd、Pb和Ni吸附能力顺序为: Pb>Ni>Cd, 与本研究结果一致, 参与吸附反应的主要官能团是羧基和含磷基团.
3 结论(1) 甲醛+EDTA法、EDTA法提取的TB-EPS数量较多, 离心法、超声法较低, 但甲醛+EDTA法、EDTA法和CER法对活性污泥微生物细胞DNA有较明显的破坏.
(2) 离心法、超声法、EDTA法和甲醛+EDTA法提取的TB-EPS中未检测出荧光物质, 物理提取方法对TB-EPS官能团种类没有明显影响, 但化学方法对TB-EPS峰型和峰强影响明显, 加入的化学试剂可能与TB-EPS络合, 显示出特异性吸收峰.
(3) 与物理法相比, 化学法提取的TB-EPS中Na、Mg、Ca、Mn等15种元素含量更高, 但化学试剂NaOH、EDTA的加入导致TB-EPS中Na含量显著增加.
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