2018, Vol. 39
纳米零价铁(nano zero-valent iron, NZVI)是工业废水处理和环境修复领域用于去除氯化污染物(如三氯乙烯等)、硝基芳香族化合物(如硝基苯等)和重金属(如砷等)的新型材料之一[1~3], 通常NZVI使用浓度的范围是1~5 g ·L-1[4].在厌氧条件下, NZVI对微生物的影响研究中, 同时存在促进作用和抑制作用的报道. He等[1]的研究发现, 厌氧颗粒污泥废水处理体系中, 当NZVI暴露浓度为30 mmol ·L-1, 产甲烷总量较空白组升高30%.然而, 纯培养体系中, 100 mg ·L-1NZVI即可对Escherichia coli菌落造成抑制[5].实验室模拟的厌氧废水处理体系中, 1 mmol ·L-1 NZVI(56 mg ·L-1NZVI)可使得产甲烷量下降20%, 30 mmol ·L-1(1 680 mg ·L-1)NZVI使甲烷产量减少69%[2].微米零价铁(zero-valent iron, ZVI)可缩短厌氧消化时间, 提高甲烷、氢气的产量[6, 7].
NZVI由于其具有独特的纳米尺寸, 因此表面活性高, 溶解速度快.一方面会产生大量亚铁离子, 可对部分微生物造成抑制, 1~10 mg ·L-1亚铁离子最高造成50%的产甲烷量的抑制[8]; 另一方面可产生更多的氢, 超过发酵、水解细菌和部分嗜氢产甲烷菌的氢阈值后可造成抑制[2, 8].另外, NZVI具有高比表面积, 易吸附在细胞表面或破坏细胞膜进入细胞内, 从而对微生物造成影响[2, 9]. 10 mg ·mL-1 NZVI抑制下, 由于金属纳米颗粒的包裹和纳米颗粒对细胞膜的破坏, B. subtitlis和P. fluorescens在纯培养过程中受到100%的抑制[10].然而, NZVI对细胞膜磷脂组成的影响目前鲜有研究, 微生物细胞膜磷脂组成的差异会造成微生物细胞物质运输过程及细胞向环境排放物质含量和种类的差异[11], NZVI对细胞膜磷脂组成的研究可为NZVI对细胞膜的影响机制提供新的依据. NZVI对微生物生理生化过程的其他抑制, 主要是产生活性氧、损伤酶蛋白和干扰细胞呼吸作用等[12~14].同时, 污泥胞外聚合物可受到NZVI的影响, He等研究发现[1], 30 mmol ·L-1 NZVI(1 680 mg ·L-1NZVI)使得胞外聚合物总量下降为空白组的77.7%, 胞外聚合物的下降加剧NZVI的抑制. ZVI在厌氧体系中溶解缓慢, 可产生氢气, 促进微生物酶的合成、酶促反应和EPS分泌, 可为厌氧微生物提供更适宜的消化环境[7, 12].
微生物群落在生物处理过程中扮演着至关重要的作用[15], NZVI暴露下微生物群落的改变, 可直接影响厌氧产甲烷过程. Yang等[2]通过qPCR的手段研究30 mmol ·L-1 NZVI暴露条件下厌氧群落的变化, 发现Methanobacteriales(目)的含量与空白组相比有显著性降低. Yu等的研究中[12], 10 g ·L-1 NZVI暴露下产乙酸Clostridia菌属和兼性嗜乙酸产甲烷Methanosarcina菌属相对丰度增加.然而, 厌氧系统是多种微生物群落互营共生形成的复杂体系, 目前NZVI影响厌氧体系微生物群落的研究仍较少, 且如何有效解析产甲烷活性和污泥特性与微生物群落间的关系, 值得深入探讨.
本研究以空白组和ZVI为对照, 考察了不同浓度梯度NZVI短期抑制下, 厌氧过程中产甲烷活性的变化, 并研究其对金属铁的溶解和污泥沉积, 污泥特性(包括产甲烷关键辅酶、ATP、活菌比和胞外聚合物), 细胞膜磷脂脂肪酸组成和厌氧微生物群落结构的影响, 以期为深入了解NZVI对厌氧系统微生物的影响及其机制提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 人工配水、NZVI(ZVI)和污泥来源人工配水:牛血清蛋白(相对分子质量60000, 模式蛋白)3 200 mg ·L-1, 葡聚糖(相对分子质量20000, 模式多糖)800 mg ·L-1, K2HPO4 1 000 mg ·L-1, CaCl2 ·2H2O 8 mg ·L-1, MgSO4 ·7H2O 11.5 mg ·L-1, 微量元素浓缩液1 mL.微量元素浓缩液, 包含FeCl3 ·4H2O 2 mg ·L-1, CoCl2 ·6H2O 2 mg ·L-1, Na2SeO3 ·5H2O 0.1 mg ·L-1, MnCl2 ·4H2O 0.05 mg ·L-1, ZnCl2 0.05 mg ·L-1, CuCl2 ·2H2O 0.05 mg ·L-1, NiCl2 ·6H2O 0.05 mg ·L-1, (NH4)6Mo7O24 ·4H2O 0.05 mg ·L-1和AlCl3 ·6H2O 0.09 mg ·L-1.人工配水采用4.0 mol ·L-1 NaOH溶液调节pH至7.2±0.2, 并使用高纯氮曝气30 min以去除配水中的溶解氧, 配水的COD浓度为(3 323±137)mg ·L-1.
NZVI和ZVI颗粒购买自上海阿拉丁生化科技股份有限公司. NZVI使用透射电镜进行分析, 颗粒大小为50~100 nm, ZVI粒径为150~200 μm.将NZVI和ZVI按照实验设计的浓度分散在人工配水中, 缺氧条件下使用超声清洗仪对其进行超声处理(25℃, 120 W, 40 kHz), 超声时间为30 min.
实验所用污泥采自江苏靖江某制药集团的工业UASB反应器, 呈黑色, 粒径为0.1~1 mm, VSS/SS值为0.81.污泥经过淘洗, 以葡萄糖为碳源的基质进行中温(35℃)培养, 活化3个月至污泥稳定.
1.2 NZVI毒性实验设计本实验在100 mL血清瓶进行, 分别加入分散NZVI与ZVI的人工配水60 mL和经过活化的厌氧污泥40 mL.实验设置空白组(不加抑制物); NZVI实验组, 分别为NZVI-100(100 mg ·L-1)、NZVI-1000(1 000 mg ·L-1)和NZVI-5000(5 000 mg ·L-1); ZVI实验组, 为ZVI-5000(5 000 mg ·L-1). NZVI浓度梯度设置参照文献[4]的报道, 每个实验组共设置3组平行.血清瓶顶空采用高纯氮吹扫5 min, 密封后置于35℃, 120 r ·min-1振荡培养箱中进行培养.
pH和氧化还原电位使用电极(美国梅特勒公司)进行分析. COD检测参照国标法[16].甲烷产量分析采用排液法[17], 使用4 mol ·L-1 NaOH溶液溶解生物气中的CO2.标准产甲烷活性(normalized methanogenic activity, NMA)为实验组相对于空白组的最大产甲烷速率的比例, 使用以下公式进行计算[18]:
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铁离子浓度采用电感耦合等离子体原子发射光谱法进行测定(iCAP 6000系列, 美国塞默飞世尔科技公司).各组取污泥进行扫描电镜和能谱分析(Quanta 250 FEG型, 美国FEI公司), 以分析表面元素.具体方法如下, 5 mL厌氧污泥, 离心后采用0.1 mol ·L-1磷酸盐缓冲液清洗3次, 后使用2.5%戊二醛溶液在4℃下固定12 h.固定后污泥经过清洗后使用乙醇(50%、70%、80%、90%、95%乙醇各脱水1次, 100%乙醇脱水3次, 每次脱水10 min)进行脱水, 冻干后进行扫描电镜和能谱分析.
1.3.2 溶解性有机物分析挥发性脂肪酸(volatile fatty acids, VFAs)采用气相色谱(7890A, 美国安捷伦公司)检测, 测定条件参照文献[19]的报道, 并有所修改.具体如下, 使用DB-FFAP柱和FID检测器; 进样口温度为200℃, 检测器温度250℃; 柱温80℃保持5 min, 后以10℃ ·min-1的速度阶段升温至160℃, 随后在160℃保持3 min; 进样量为1 μL.溶解性蛋白以牛血清蛋白作为标准物质, 采用Brandford法测定[20]; 溶解性多糖以葡萄糖作为标准物质, 采用苯酚-硫酸法进行测定[21].
1.3.3 污泥生理生化性能分析辅酶F420的提取和测定参考Ashby等[22]的方法.辅酶M的提取和测定参考Elias等[23]的方法, 采用高效液相色谱法测定.活菌比使用LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability试剂盒(美国英杰公司)测定[24, 25].活菌计算公式为:
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式中, N0为总荧光计数, N为绿色荧光计数.
ATP含量使用BacTiter-GloTM reagent试剂盒(美国普洛麦格公司)测定[26], 全功能酶标仪(Synergy H4, 美国伯腾公司)测定相对光强度单位, ATP标准品购买自美国普洛麦格公司.
污泥胞外聚合物的提取使用热提法[27].取污泥5 mL清洗并使用0.1 mol ·L-1磷酸盐缓冲液重悬, 在80℃水浴加热15 min, 离心取上清液, 测定胞外聚合物中蛋白和多糖的含量.
1.3.4 微生物细胞膜磷脂脂肪酸分析各实验组取污泥进行细胞膜磷脂脂肪酸组成分析, 提取方法根据周丽娜等[28]的方法.经过提取和纯化的磷脂脂肪酸, 使用气相色谱(7890A, 美国安捷伦公司)检测, 结果采用MIDI Sherlock Microbial Identification System软件分析.
1.3.5 微生物群落分析各实验组取污泥进行微生物群落分析, 采用16S rRNA基因高通量测序MiSeq平台(美国Illumina公司)进行检测.污泥样品离心后弃掉上清液, 采用FastDNA® SPIN Kit for Soil(美国MB公司)提取DNA, 提取后的DNA分别对细菌16S rRNA V1V2区基因和古生菌16S rRNA基因进行PCR扩增.经琼脂凝胶电泳鉴定PCR产物后, 采用纯化试剂盒(Cycle-Pure Kit, 美国OMEGA Bio-tek公司)纯化后送至江苏中宜金大分析检测有限公司进行MiSeq平台测序.
1.4 数据统计分析方法MiSeq数据经Sickle及Mothur降噪后, 经过RDP分类处理, 并采用R软件绘制热图.显著性分析采用单因素方差分析, 当P < 0.05判定两组间存在显著性差异, 使用SPSS 18.0软件进行分析, 其中标注*代表此实验组与空白组相比P < 0.05.物种数据的主成分分析(principle component analysis, PCA)使用Past 3.01软件分析.物种数据和环境数据间的相关性分析采用冗余分析(redundancy analysis, RDA), CANOCO 4.5软件进行分析.不同参数之间相关性分析采用皮尔逊指数(rp)判断, 使用SPSS 18.0软件分析.
2 结果与讨论 2.1 NZVI对产甲烷性能及有机物去除的影响图 1是不同NZVI(ZVI)抑制条件下累积产甲烷量和比产甲烷活性情况.从中可见, 空白组、ZVI组累积产甲烷量相近, 分别为(83.0±0.9)mL和(82.9±1.0)mL, 而投加100、1 000、5 000 mg ·L-1的NZVI组累积产甲烷量分别下降为空白组的96.2%、91.2%和83.1%.标准产甲烷活性(NMA)方面, 5 000 mg ·L-1 NZVI条件下该值为空白组的82.3%, 但5 000 mg ·L-1 ZVI提高了厌氧体系标准产甲烷活性(是空白组的1.2倍).本研究结果发现, 纳米级铁存在下可抑制厌氧系统中甲烷的产生. Yang等的研究发现[2], 1 mmol ·L-1NZVI可使得产甲烷量下降超过20%, 30 mmol ·L-1 NZVI使甲烷产量减少69%.但相同浓度微米级铁可以促进产甲烷, 这是因为微米级铁可为厌氧微生物提供更适合的产甲烷环境, 并可以成为产甲烷菌的电子供体[12].
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图 1 不同实验组产甲烷性能的比较 Fig. 1 Cumulative methane production under the different conditions |
厌氧反应结束时, NZVI-1000和NZVI-5000组出水COD浓度为空白组的1.52和2.06倍, 而NZVI-100和ZVI-5000组与空白组的出水COD浓度相近, 为(153.3±11.3)~(154.7±6.7)mg ·L-1[图 1(b)]. NZVI-5000组的出水总VFAs(乙酸占93.2%)、蛋白和多糖浓度是空白组2.5、2.9和1.8倍, NZVI-1000组总VFAs(乙酸占85.9%)浓度是空白组的1.5倍, 而ZVI-5000组仅出水VFAs和蛋白浓度升高(表 1).这表明, 随着NZVI浓度增加, 代谢中间产物的累积呈现由产甲烷过程受抑制(低浓度NZVI)延伸到水解酸化过程受抑制(高浓度NZVI)的过程. Yang等也发现[2], 随着NZVI暴露浓度的提高, 厌氧产甲烷受到的抑制加剧, 推测为随着环境中纳米铁浓度升高, 溶解态铁离子浓度升高, 对厌氧产甲烷菌和水解菌关键酶活性产生影响[8]. NZVI-100组和ZVI-5000组中溶解态铁浓度低, 且ZVI可促进厌氧微生物酶促反应及EPS分泌[12], 因此其出水COD浓度与空白组相近(未受抑制).
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表 1 出水有机物成分比较/mg ·L-1 Table 1 Comparison of the organic matter composition in the supernatant/mg ·L-1 |
2.2 NZVI(ZVI)铁的溶解及沉淀
金属离子的释放及其在污泥表面的沉积是金属纳米颗粒抑制厌氧系统的主要途径[29, 30]. 图 2(a)中, 第5 d时, NZVI-1000和NZVI-5000组铁离子浓度分别为(0.961±0.044)mg ·L-1和(1.852±0.160)mg ·L-1, 是空白组铁离子浓度的3.8和7.4倍; ZVI-5000组的上清液铁离子浓度略高于空白组.各实验组中第20 d铁离子浓度均较5 d时明显下降, 推测原因为铁离子的微生物利用和离子的共沉淀作用.与此同时, 第20 d时各组中pH和氧化还原电位的峰值也出现在纳米级的NZVI-5000组, pH值为7.98±0.27, 氧化还原电位值为(-316±17)mV, 且投加铁颗粒的实验组pH值均比空白组高. NZVI-5000组的氧化还原电位最低, 说明该实验组溶解性铁主要以亚铁离子存在, 并会导致厌氧系统中亚铁离子的吸附和沉淀[2].
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(a)上清液铁离子浓度; (b)20 d时pH值和ORP值; (c)20 d时污泥表面元素分析 图 2 不同实验组上清液铁离子浓度和污泥表面金属元素分析的比较 Fig. 2 Comparison of dissolved iron concentrations and ultimate analysis of the anaerobic sludge after the treatments by EDS analysis |
第20 d时, 采用扫描电镜和能谱分析了污泥表面原位铁沉淀和NZVI嵌入[图 2(c)和图 3].由图 3扫描电镜照片显示, 除NZVI-5000组外, 其余实验组污泥表面形貌复杂, 存在球菌、杆菌及由胞外聚合物形成的孔道, 而NZVI-5000组污泥表面胞外聚合物有所减少, 并出现片状沉淀结构.能谱分析污泥表面元素组成的结果表明[图 2(c)], NZVI-5000组表面铁元素所占质量分数为11.92%, 是空白组的6.2倍, 但该组其他元素含量与其余实验组无明显差异, 推测NZVI在污泥表面主要以嵌入形式沉积. 5 000 mg ·L-1 NZVI实验组片状沉淀推测为亚铁离子与磷元素形成共沉淀, 该沉淀形式在已有研究中有所报道[2].铁在污泥表面的沉积, 影响微生物营养物质的传质过程, 导致污泥中铁的逐渐累积, 从而增加NZVI对厌氧污泥的抑制程度.
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图 3 污泥表面扫描电镜照片(×12 000) Fig. 3 SEM images of the anaerobic sludge(×12 000) |
辅酶M和辅酶F420是产甲烷过程中的关键辅酶, 并且可作为判断产甲烷过程的生物指示物[31]. 图 4(a)比较了不同NZVI(ZVI)条件下产甲烷辅酶的含量.结果表明, 5 000 mg ·L-1 NZVI抑制了辅酶M和辅酶F420浓度, 分别降为空白组的61.6%和40.2%(P < 0.05), 而NZVI-100和ZVI-5000组的辅酶M含量与空白组相近、辅酶F420含量显著高于空白组(P < 0.05).辅酶F420在厌氧产甲烷过程中的主要生化作用是作为F420还原氢化酶系统的电子载体, 目前发现的氢化酶主要是[Ni-Fe]氢化酶、[Fe-Fe]氢化酶和[Fe-S]氢化酶, 铁作为辅助因子可以刺激氢化酶的活性, 氢化酶活性的增强能间接促进辅酶F420的合成[31].文献[32]报道了加入10 g ·L-1 ZVI的厌氧反应器中, 辅酶F420的浓度为控制组的2.11倍. Wang等[33]的研究发现在218.4 mg ·L-1 NZVI暴露条件下, 厌氧辅酶F420活性增加, 与本文NZVI-100组辅酶F420活性增加结果相近.但在高浓度纳米颗粒存在条件下, 如10 920 mg ·L-1 MgO纳米颗粒和Ag纳米颗粒暴露条件下辅酶F420活性显著性下降[33].
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(a)辅酶M和辅酶F420; (b)活菌比和ATP含量、胞外蛋白(PN)和多糖浓度(PS) 图 4 不同实验组第20 d时微生物生理生化性能的比较 Fig. 4 Effects on microbiological activity and physiological traits at 20 d under the different conditions |
ATP是评价厌氧细胞生理活性的指标之一, 其差异与产甲烷差异存在对应关系[34, 35]. 图 4(b)是不同抑制条件下污泥活菌比和微生物ATP含量.由图 4(b)可见, NZVI浓度>1 000 mg ·L-1, 微生物活菌比和微生物ATP含量均较空白组显著性下降(P < 0.05);当NZVI浓度升高到5 000 mg ·L-1时, 其活菌比和ATP含量分别降为空白组的79.7%和48.5%.结果反映了NZVI可使厌氧微生物细胞活性下降, 并破坏细胞膜导致细胞死亡. Yang等[2]报道了NZVI浓度超过1 mmol ·L-1, 会造成细胞膜完整性损伤, 从而影响产甲烷量.另有研究报道CeO2纳米颗粒对厌氧处理系统的毒性机制主要为物理穿透及其对细胞膜的损伤[36]. Mu等[29]的研究发现随着厌氧体系ZnO浓度的增加, ATP含量下降. ZVI组活菌比和ATP含量与空白组相比没有显著性差异.
胞外聚合物通常可保护微生物抵抗外部因素的影响, 但在高浓度抑制物存在条件下, 胞外聚合物含量下降, 可加剧抑制[29, 37].胞外聚合物可以与NZVI反应, 加剧NZVI的腐蚀, 从而减轻NZVI的抑制[1].第20 d时, ZVI添加可略微增加胞外多聚物含量, 这是由于铁可促进细菌分泌胞外聚合物, 增加污泥密度[6]. NZVI组的胞外蛋白和胞外多糖含量均下降, 其中NZVI-100、NZVI-1000组的PS分别降为空白组的73.0%和55.4%(P < 0.05), NZVI-5000组PN和PS浓度为空白组的20.7%和22.6%. He等[1]研究了NZVI对厌氧颗粒污泥的影响时发现, 30 mmol ·L-1NZVI(1 680 mg ·L-1NZVI)可使得胞外聚合物总量下降为空白组的77.7%, 与本实验结果相似. Mu等[29]研究了ZnO纳米颗粒对厌氧生物废水处理系统的影响时发现, ZnO纳米颗粒对胞外蛋白抑制明显, 其浓度较空白组下降69.6%.本研究中, NZVI-5000组胞外聚合物含量大幅下降, 可加剧NZVI对厌氧系统的影响.
2.4 NZVI对微生物细胞膜磷脂脂肪酸的影响微生物细胞膜磷脂组成的差异会造成微生物细胞物质运输过程及细胞向环境排放物质含量和种类的差异[38].细菌细胞膜不饱和脂肪酸和支链脂肪酸的增加, 可使得细胞膜流动性增加[11], 同时, 细胞膜流动性的变化也是细胞实现自我防护的重要方法[39].由图 5(a)可见, 运行至20 d时, 不同实验组污泥支链脂肪酸和不饱和脂肪酸的质量分数为: ZVI-5000(21.18%)>空白组(19.37%)>NZVI-1000(16.69%)>NZVI-5000(15.94%)>NZVI-100(12.08%).可以看出, 加入ZVI的实验组支链脂肪酸和不饱和脂肪酸含量会较空白组提高, 但是加入NZVI后会使该含量降低. 图 5(b)可知, 各实验组中磷脂脂肪酸碳链长度均以C16和C18为主. C16和C18的含量在纳米铁NZVI加入后, 均比空白组增加.反之短链C13~C15含量, 相对空白组降低.由表 2可见, 纳米零价铁组中, C14:0、C15:0和C15:0 a的含量均较空白组有所下降, NZVI-5000组中其相对丰度分别为空白组的81.6%、67.5%和66.2%, 而纳米零价铁组C18:0含量较空白组均增加.微米级铁组中, C15:0、C15:0 a、C15:0 i和C16:0含量均较空白组升高.
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(a)微生物细胞膜磷脂脂肪酸组成; (b)磷脂脂肪酸碳原子数量 图 5 不同抑制组微生物细胞膜磷脂脂肪酸的比较 Fig. 5 Comparison of phospholipid fatty acids of the microbes under the different conditions |
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表 2 各反应器中厌氧污泥整体PLFA 1)/% Table 2 Whole PLFA profiles for the anaerobic sludge under the different treatments/% |
另外, 外界环境的改变也会使得细胞膜磷脂内部组成发生变化[39].在NZVI抑制条件下, 厌氧细菌细胞膜磷脂组成产生调整, 细胞膜流动性降低, 且碳链长度有增加的趋势.
2.5 NZVI对微生物群落的影响图 6是采用16S rRNA基因高通量测序技术分析的厌氧污泥微生物群落结构组成.从中可见, 门水平的厌氧细菌群落主要由Thermotogae、Firmicutes、Chloroflexi、Actinobacteria、Proteobacteria、Bacteroidetes和Synergistetes组成.添加纳米铁和微米铁颗粒均使Thermotogae和Firmicutes门的相对丰度下降, 且其随着NZVI增加量增加丰度呈下降趋势(NZVI-5000组相对丰度分别为空白组的23.9%和61.5%). NZVI-5000组中, Chloroflexi门相对丰度最高, 是空白组丰度(6.68%)的4.0倍; 微米级铁组的Proteobacteria门相对丰度最高, 为空白组丰度(12.00%)的2.2倍.
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(a)细菌门水平种群群落分析; (b)细菌属水平种群群落分析(热图和色彩差值说明样品细菌属水平相对丰度(丰度>0. 10%), 色彩差值数据计算基于相对丰度的lg值); (c)古生菌属水平种群群落分析(气泡大小基于样品古生菌属水平相对丰度的lg值) 图 6 不同实验组微生物群落组成分析 Fig. 6 Analysis of microorganisms' community structure under the different conditions |
细菌属水平上, 空白组中, Kosmotoga和Sarcina为优势菌属, 其相对丰度分别为18.19%和7.70%.另外在空白组中, 其他主要菌属Petrimonas、Bacillus、Brooklawnia、Desulfomicrobium、Nakamurella、Pseudomonas、Zoogloea、Dechloromonas、Flavobacterium和Janthinobacterium相对丰度分别为1.02%、0.96%、0.91%、0.70%、0.44%、0.20%、0.19%、0.11%、0.10%和0.05%. Kosmotoga属于Thermotogae门, 可利用碳水化合物、蛋白质和丙酮酸作为碳源[40]; Sarcina属于Firmicutes门.添加纳米铁和微米铁颗粒均使Kosmotoga和Sarcina丰度下降, 并且二者的相对丰度随NZVI浓度升高而降低(NZVI-5000组的相对丰度分别下降为4.33%和1.27%). Desulfomicrobium属于Proteobacteria门, 为硫酸盐还原菌, 可将有机物不完全氧化为乙酸[41]. Desulfomicrobium相对丰度随NZVI浓度升高而降低, NZVI-5000组中其相对丰度降为0.21%;该菌在添加ZVI后相对丰度下降, 其相对丰度下降为0.38%.
纳米零价铁和微米级铁实验组中, 部分微生物相对丰度高于空白组, 如NZVI-1000组中, Nakamurella、Dechloromonas和Zoogloea相对丰度分别为4.31%、1.54%和1.79%;而其在NZVI-5000组中相对丰度与空白组相近. NZVI-5000组中, Bacillus、Petrimonas和Brooklawnia相对丰度分别升高为2.33%、2.51%和1.23%. Wei等发现[42], Bacillus subtilis为厌氧消化中水解菌, 可在含铁培养基中生长, 且在培养基中加入硫酸铁, 可以提高其生物活性. Petrimonas和Brooklawnia分别属于Bacteroidetes和Actinobacteria门, 在厌氧消化中可利用糖类生成乙酸、CO2和H2, 从研究结果可见其对高浓度NZVI有很好的耐受性. ZVI组中相对丰度升高的菌属为Pseudomonas、Janthinobacterium和Flavobacterium, 相对丰度分别升高至6.50%、2.39%和1.33%.由于其均为革兰氏阴性菌, 其中Pseudomonas和Janthinobacterium属于Proteobacteria门, Pseudomonas可在含铁矿石和铁氧化物上生长[43], Janthinobacterium为典型的反硝化菌株, 可在亚铁环境中生长[44]; Flavobacterium属于Bacteroidetes门, 文献[45]报道其可以铁盐作为电子供体还原硝酸盐, 对微米级铁的耐受使得这3种菌在ZVI实验组丰度上升.
古生菌属水平中, 空白组优势嗜氢产甲烷菌属为Methanobacterium(44.79%), 优势嗜乙酸产甲烷菌为Methanosaeta(28.24%), 且该两属在NZVI组和ZVI组中呈现相反的变化规律. NZVI-5000组中, Methanobacterium相对丰度降低为39.50%, Methanosaeta相对丰度升高为31.83%.在ZVI-5000组中Methanobacterium相对丰度升高至45.64%, Methanosaeta相对丰度下降至24.72%.同时, NZVI-5000组中, Methanospirillum和Methanosarcina相对丰度分别下降为空白组的37.3%和33.3%. Methanolobus在ZVI-5000组中的相对丰度较空白组升高1.6倍. Yang等[2]使用qPCR手段分析NZVI对厌氧产甲烷菌的影响时发现, 30 mmol ·L-1 NZVI条件下Methanobacteriales(目)的含量与空白组相比有显著性降低, 嗜氢产甲烷菌受到抑制, 原因为NZVI产氢速率远高于30 mmol ·L-1 ZVI, 超过了该类型菌的氢耐受阈值, 本文的结果与Yang等[2]的报道一致.厌氧体系中ZVI可缓慢溶解产氢, 同时可以直接(比如铁元素)或间接(比如氢)的为微生物转移电子[46], 这也是本研究中ZVI实验组优势嗜氢产甲烷菌Methanobacterium丰度上升的原因, 同时也是ZVI促进甲烷生成的原因.
2.6 群落结构与微生物生理生化指标和膜磷脂组成的相关性分析微生物群落组成相似度主成分分析见图 7(a), 从中可见, 空白组位于第一象限, 微米级铁组位于第二象限, 纳米级铁组位于第三、四象限.主成分分析中, 样品间距离长短反映了样品间群落组成的相似度, 距离越短, 相似程度越高.最短的相关性距离为NZVI-1000和NZVI-5000组, 说明两实验组具有最高的微生物群落相似度, 其次为NZVI-100和NZVI-1000组.而空白组, NZVI实验组和ZVI实验组间相关性距离较长, 且最大相关性距离为空白组和NZVI-5000组, 说明在NZVI和ZVI存在的条件下, 厌氧体系中微生物群落组成发生较大变化.
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图 7 不同实验组微生物群落间的关系及微生物群落与微生物生理生化性能和膜磷脂组成间的关系 Fig. 7 Principal component analysis illustration of communities and redundancy analysison the correlation of communities with different environmental variable |
图 7(b)是群落结构与污泥生理生化性能和细胞膜磷脂组成的相关性冗余分析. RDA1和RDA2分别代表 51.8%和32.3%的总差异.辅酶M、ATP、活菌比、PN和PS间存在显著的正相关关系(rp>0.820, P < 0.05), 并且其与辅酶F420也成正相关关系, 表明在NZVI(ZVI)抑制条件下, 关键辅酶、细胞膜完整性和活性、胞外聚合物的影响共同导致了微生物生理生化性能的下降.同时, 累积产甲烷量与辅酶M、活菌比、ATP、PN和PS间存在显著正相关关系(rp>0.928, P < 0.05); NMA与辅酶F420、辅酶M和ATP呈显著正相关关系(rp>0.795, P < 0.05), 并与不饱和脂肪酸与支链脂肪酸含量呈现正相关关系.这证明NZVI对微生物生理生化性能和细胞膜磷脂组成的影响, 是造成产甲烷量及速率下降的主要原因.
NMA与Janthinobacterium、Pseudomonas、Flavobacterium、Methanobrevibacter和Methanospirillum呈显著正相关关系(rp>0.820, P < 0.05), 与Methanosaeta呈显著负相关关系(rp=-0.928, P < 0.05).辅酶F420与Methanomethylovorans呈显著正相关关系(rp=0.847, P < 0.05). ATP含量与Bacillus和Methanosaeta呈显著负相关关系(rp < -0.820, P < 0.05).另外, Nakamurella、Bacillus、Trichococcus和Petrimonas与NZVI组存在正相关关系, 说明此类菌对NZVI有潜在的耐受性; Pseudomonas、Janthinobacterium和Flavobacterium与ZVI组存在正相关关系, ZVI的存在可增加此类菌的相对丰度.
3 结论(1) 厌氧累计产甲烷量随着NZVI暴露浓度的升高而下降, ZVI组累积产甲烷量与空白组无显著差异, 但NMA较空白组显著上升.污泥表面铁及铁氧化物的沉积为NZVI对产甲烷过程产生影响的原因之一.
(2) NZVI-5000组中, 辅酶M、辅酶F420、活菌比、ATP和EPS含量均较空白组有显著性降低(P < 0.05), ATP含量随着NZVI暴露浓度的升高而下降; ZVI-5000组辅酶M含量与空白组相近, 辅酶F420含量显著高于空白组(P < 0.05).
(3) 厌氧细菌膜磷脂中支链脂肪酸和不饱和脂肪酸含量变化为ZVI-5000(21.18%)>空白组(19.37%)>NZVI-1000(16.69%)>NZVI-5000(15.94%)>NZVI-100(12.08%), NZVI组细胞膜流动性降低, C18:0等长链脂肪酸含量较空白组均增加.
(4) 主成分分析和冗余分析表明, 在NZVI和ZVI存在的条件下, 厌氧体系中微生物群落组成发生较大变化; 累积产甲烷量与辅酶M、活菌比、ATP、PN和PS间存在显著正相关关系(rp>0.928, P < 0.05), Nakamurella、Bacillus、Trichococcus和Petrimonas与NZVI组存在正相关关系, 说明此类菌对NZVI有潜在的耐受性.
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