2018, Vol. 39
2. 中国科学院广州地球化学研究所, 广州 510640;
3. 中国科学院大学, 北京 100049
2. Guangzhou Institute of Geochemistry, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510640, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
矿山开采、金属冶炼、施肥和农药等是导致农田砷污染的主要原因[1].湖南石门雄黄矿区和湖南株洲冶炼厂周边农田土壤平均砷含量分别达到79.0 mg·kg-1(n=39)和36.8 mg·kg-1(n=34), 均超过《土壤环境质量标准》(GB 15618-1995)Ⅲ级标准[1, 2].水稻是东南亚重要的粮食作物, 也是我国主要粮食作物, 据研究报道, 我国水稻面积占全世界水稻面积的23%[3].我国热带亚热带红壤区是水稻的主产区, 涉及14个省区203万km2, 占全国土地总面积21%[4].有研究表明, 中国人均砷摄取量达到42 μg·d-1, 其中大米的砷占总砷日摄入量的60%[5].砷可导致肺损伤、外周神经损伤、皮肤病或心血管病等疾病, 其中无机砷(Ⅲ)毒性最大, 因而无机砷被国际癌症研究机构归类为第一类致癌物.因此稻田土壤砷污染使得以稻米为主食的居民健康受到严重威胁[6, 7].
据研究表明, 淹水管理过程是导致水稻对砷吸收量增加的关键环节[8]; 相反, 间歇式淹水管理则能有效地降低水稻土砷的释放[9], 这与水稻土铁的氧化还原密切相关[10].水稻土铁矿物是砷的贮存器并主要以无定型铁矿物结合态砷和结晶型铁结合态砷形态存在[10~12].同样, 水稻根表铁膜(水铁矿和针铁矿为主)可作为水稻土孔隙水与水稻之间的屏障, 抑制或降低土壤溶液砷进入根部[13].此外, 淹水缺氧条件下砷污染水稻土在外源添加不同铁矿物(水铁矿、针铁矿和赤铁矿)时, 均可促进水稻土可交换态和专属吸附态砷向无定型铁和结晶型铁结合态砷转化[11].相反, 大量研究报道淹水厌氧环境驱动下水稻土铁矿物的还原溶解是引起砷释放的主要原因[14].水稻土无定型铁氧化物与砷的关系即存在两种关系, 一方面无定型铁氧化物可充当砷的储存器[15], 另一方面可能是砷释放最主要的源头[16].这与水稻土无定型铁在淹水缺氧条件下处于亚稳状态以及水稻土颗粒物微界面环境密切相关, 因而铁的成矿或者还原溶解直接影响砷的环境化学行为[10, 17, 18].其中, 淹水缺氧条件是考察水稻土无定型铁氧化物稳定性, 放大微生物作用下水稻土颗粒物界面微环境改变以及驱动铁砷环境化学行为和归趋的重要控制因素.
为此, 本文采用砷污染水稻土于富集培养液中厌氧条件下富集培养, 探讨淹水缺氧条件微生物驱动作用下水稻土不同形态砷与培养液砷浓度以及水稻土无定型铁矿物与培养液砷浓度之间的关系, 以期为水稻土砷污染防治提供科学依据和理论指导.
1 材料与方法 1.1 供试土壤供试水稻土采自湖南郴州市炼银厂周边砷污染农田, 经自然风干, 研磨过100目筛后冷藏备用, 具体采样点分布图见图 1, 采样点经纬度, 各采集的水稻土理化性质和不同砷形态见表 1.
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图 1 研究区域和采样地点示意 Fig. 1 Map of the study area and sampling sites |
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表 1 各农田土壤采样点以及对应的不同形态砷浓度和理化性质1) Table 1 Concentration of different arsenic species and physicochemical properties of paddy soil sampling sites |
1.2 富集培养
水稻土采用灭菌处理的富集培养液[固(g):液(mL)比=1:5, 下同]富集培养, 经100%高纯氮气排氧25 min后, 用橡胶塞压紧瓶子, 立即用压铝盖密封, 然后将样品置于厌氧手套箱(25±2)℃(混合气成分：氮气85%, 二氧化碳10%和氢气5%)中进行避光培养1个月.富集培养液主要成分为：10 mmol·L-1 PIPES (pH=7.0)的生物缓冲溶液, 含有10 mmol·L-1NH4Cl、1.0 mmol·L-1KH2PO4、1.0 mmol·L-1MgCl2·6H2O、1.0 mmol·L-1CaCl2·2H2O、30 mmol·L-1NaHCO3, 1 mL微量矿物元素以及1 mL维他命, 主要目的是富集培养微生物, 以便促进水稻土铁砷还原[19].富集培养1个月, 第一阶段采样时间为第15 d, 第二阶段为第30 d.
1.3 分析方法土壤砷的形态提取采用改进的Wenzel提取法[20, 21], 具体提取步骤为：可交换态砷(F1)采用0.05 mol·L-1 (NH4)2SO4溶液(土壤与提取液比为1:30)室温下振荡2 h, 提取两次; 专属吸附态砷(F2)采用土壤与提取液(0.05 mol·L-1 NH4H2PO4)比为1:25 (g:mL)于室温下振荡12 h; 无定型铁结合态(F3)利用0.2 mol·L-1 (NH4)2C2O4/H2C2O4(pH=3.0)固液比为1:25于室温避光条件下振荡4 h; 结晶型铁结合态(F4)的提取利用0.2 mol·L-1 (NH4)2C2O4/H2C2O4和0.1 mol·L-1 C6H8O6混合液(pH=3.0), 在见光水浴30 min, 温度为96℃条件下提取.其中, 每种砷形态提取后均采用0.05 mol·L-1 NaCl溶液冲洗, 以避免每步提取过后残余砷.各形态提取中, 提取液在3 000 r·min-1离心分离15 min, 且上层液利用0.45 μm滤膜过滤以便砷浓度分析.砷浓度测定利用2%硼氢化钾和0.5%氢氧化钾作为还原剂以及浓盐酸为载液, 且添加5%硫脲和5%抗坏血酸将提取砷(Ⅴ)还原, 并采用原子荧光(AFS-52)进行测定.
土壤无定型铁采用2.0 mol·L-1 (NH4)2C2O4溶液(pH=3.0±0.02)以土壤与提取液比为1:50在20℃下避光振荡2 h[22]; 盐酸提取态铁(Ⅱ)的分析采用5 mmol·L-1 HCl提取, 将离心分离过滤后的提取液放入HEPES缓冲液以防止氧化[12].每次提取后, 将泥浆混合液在3 000 r·min-1离心速度离心分离15 min, 随即将上层液用0.22 μm滤膜过滤; 其中, 经过滤的上层液用于铁(Ⅱ)的测定, 其方法参照菲洛嗪法[12], 并采用紫外分光光度计(UV-1800, 岛津)分析测定.
1.4 数据分析本研究采用SPSS19.0统计分析软件分析进行单因素方差分析实验, 当P＜0.05时, 为显著, 否则为不显著.
2 结果与分析 2.1 培养液中铁砷浓度由图 2可知, 水稻土经富集培养后, 土壤砷不断释放, 第二阶段各土壤溶液中总砷浓度相比于第一阶段均显著提高(P＜0.05), 其中S03、S04、S05、S08、S09、S10和S11增幅最大, 分别提高1.34、1.36、0.96、1.08、1.42、1.10和1.74 mg·L-1; 同样, Fe2+出现与砷一致的变化现象, Fe2+浓度均显著提高(P＜0.05), 且增幅相比于砷的变化均较大.说明厌氧条件下有利于水稻土铁矿物的还原溶解和砷的释放, 这可能与先前大量研究表明淹水缺氧条件下水稻土界面微环境中存在铁矿物还原溶解驱动砷的释放的结果相一致[19].同样, 这与进一步的研究证实厌氧淹水管理是导致水稻土砷释放和相继地水稻砷吸收累积的关键环节相符[23].
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同一采样点铁砷浓度中不同字母表示有显著差异（P＜0.05） 图 2 各土壤样品富集培养液中铁和砷浓度 Fig. 2 Iron and arsenic concentration in enrichment solution of soil samples |
由图 3可知, F1+F2均与两个阶段土壤培养液中砷的浓度呈显著正相关关系, 第一阶段和第二阶段相关系数分别为r=0.736, P＜0.05和r=0.630, P＜0.05.表明水稻土砷的释放主要来源于土壤可交换态砷(F1)和专属吸附态砷(F2), 前者最不稳定, 后者在PO43-的作用下与专属吸附态砷产生竞争吸附作用而促进砷的释放, 这与PO43-与砷酸盐的性质有关, 可与砷酸盐竞争铁矿物等吸附载体的吸附点位.在本研究中富集培养液存在PO43-, 一定程度上有利于水稻土砷的释放.这与先前大量研究报道水稻土颗粒物微界面砷在P的交互作用下可以促进砷释放的研究报道相似[24].而F3均与两个阶段的培养中砷不存在显著相关性, 但是相关系数r从0.292增长至0.421, 相应地P也从0.310降低至0.133, 说明水稻土无定型铁结合态砷处于亚稳状态, 初始阶段无定型铁不易被还原而引起砷的释放, 后期则可能在微生物的驱动下发生铁矿物还原溶解而引起砷释放.这也说明土壤可交换态砷和专属吸附态砷对土壤砷释放的贡献最大.
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（a）和（c）为第一阶段；（b）和（d）为第二阶段 图 3 水稻土砷形态与土壤砷释放的相关性分析 Fig. 3 Correlation analysis of paddy soil arsenic species and soil arsenic release |
由图 4可知, 土壤盐酸提取态铁(Ⅱ)与土壤培养液中总砷均存在显著正相关性, 相关系数分别为r=0.577(P＜0.05)和r=0.635(P＜0.05), 表明盐酸提取态铁(Ⅱ)与土壤砷存在耦合释放的现象.目前, 有研究证实盐酸提取态铁(Ⅱ)占土壤无定型铁的5%, 且为无定型铁最为活跃的部分, 容易在淹水缺氧条件下释放[25].相反, 由图 4(c)和4(d)可知, 土壤无定型铁与培养液砷存在负相关关系, 分别为r=-0.428(P=0.126)和r=-0.564(P＜0.05), 说明无定型铁在淹水缺氧条件下对砷具有截留贮存作用.这与Hu等[13]研究报道水稻土无定型铁对砷具有截留和屏障作用的结果相一致.同样, 这也表明盐酸提取铁(Ⅱ)与无定型铁二者性质的差异性, 主要集中表现在对水稻土砷的环境化学行为的影响.
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（a）和（c）为第一阶段；（b）和（d）为第二阶段 图 4 土壤不同形态铁与土壤砷释放的相关性分析 Fig. 4 Correlation analysis of different iron species and soil arsenic release |
长期食用砷污染大米会给人类带来一系列健康问题, 如癌症、皮肤损害、神经障碍等[26].深入研究砷在水稻土铁氧化物微界面的环境化学行为对治理和缓解水稻土砷污染以至降低人类健康风险具有重要意义.水稻土中铁矿物是砷的主要吸附载体, 对砷的环境化学行为和归趋有重要影响.水稻种植经历的淹水厌氧阶段有助于铁还原微生物还原铁矿物, 从而导致吸持在铁矿物表面的砷释放到水稻土溶液中, 增大水稻土砷对水稻的可给性, 这是导致水稻对水稻土砷大量吸收累积的关键环节.
水稻土富集培养过程, 第二阶段各水稻土溶液中的砷浓度与Fe2+浓度均远大于第一阶段时的浓度, 这与先前的研究中表明淹水缺氧条件是驱动水稻土颗粒物界面微环境中砷不断释放, 提高厌氧水稻土溶液中的砷浓度的现象相符合[18].且与进一步研究证实水稻土长期厌氧处理的模式是导致水稻大量累积砷的关键因素相一致[27].相似地, Zecchin等[28]指出长期持续淹水是驱动水稻土中Geobacteraceae族铁还原菌属丰度显著提高的关键条件, 且砷(Ⅴ)持续从铁矿物中释放.本研究中, (F1+F2)与两种水稻土培养液中砷的浓度均呈显著相关性(r=0.730, P＜0.05和r=0.657, P＜0.05), 这与Liu等[12]的研究表明水稻土在F1与F2都与大米谷粒砷含量呈显著正相关(P < 0.001)相似. F3与水稻土溶液中砷的浓度不呈显著相关性(r=0.292, P=0.310; r=0.421, P=0.133), 这表明无定型铁处于亚稳状态, 初始阶段水稻土砷释放主要来源于有效态和专属吸附态砷的释放, 而后一阶段则可能潜在无定形铁结合态砷释放的现象.同样地, Somenahally等[29]采用间歇式淹水处理水稻, 发现根际土孔隙水总砷浓度约比厌氧淹水处理时降低了86%, 且在厌氧淹水处理的水稻土具有更高丰度的地杆菌、希瓦氏菌和厌氧黏细菌等异化铁还原菌. Wang等[30]则指出水稻土中Geobacter、Anaeromyxobacter、Desulfosporosinus和Pedobacter等铁还原菌丰度的上升与铁(Ⅱ)和砷释放量的增加紧密相关. Das等[31]进一步研究证实不同水管理模式中, 水稻土铁还原菌的丰度依次为：淹水厌氧处理＞干湿交替处理＞不淹水处理(落干处理), 同时水稻土孔隙水总砷浓度的大小与水稻土铁还原菌丰度呈一致性, 依次为淹水处理>干湿交替处理>不淹水处理.相似地, Bennett等[32]指出淹水厌氧水稻土溶液中铁(Ⅱ)和As(Ⅲ)的浓度呈极显著正相关, 而As(Ⅲ)是厌氧水稻土中砷的主要形态; 本研究与之前的研究相似, 水稻土溶液中砷浓度与铁(Ⅱ)浓度同样呈显著相关性(r=0.577, P＜0.05; r=0.613, P＜0.05)). Wang等[30]和Chen等[33]一步指出生物炭可作为电子穿梭体促进水稻土铁砷耦合还原而提高砷释放量与铁(Ⅱ)浓度. Honma等[34]进一步指出厌氧水稻土溶液中溶解态铁(Ⅱ)与水稻土溶液中总溶解性砷浓度存在二次函数关系, 其关系式为[As]=-0.002 4[Fe(Ⅱ)]2+0.312 5[Fe(Ⅱ)]+3.588 6, 这说明了随着土壤溶液铁(Ⅱ)浓度提高, 土壤砷的释放量增大, 都进一步证实了土壤溶液砷浓度的不断提高可能和铁氧化物的还原溶解有关.基于本研究过程, 不能持续提供营养物质足以支持铁砷还原微生物的长期活动, 因而可能存在铁砷还原现象停滞的现象, 这也说明持续淹水厌氧过程才是主要驱动水稻土砷释放的关键因素.同样, 尽管移动性较小的As(Ⅴ)在铁矿物表面被微生物直接还原为移动性更强的As(Ⅲ)而进入溶液也是溶液相砷浓度提高的一种途径, 但铁矿物还原溶解导致吸持的砷释放进入溶液是水稻土溶液砷浓度提高的最为重要机制[35].其中, 铁还原微生物在驱动处于亚稳状态的铁矿物的还原溶解扮演着重要角色.
与含砷铁矿物的还原溶解引起砷释放的研究报道相反, 大量研究同样证实无定型铁氧化物可以对砷起截留和库存作用，且能降低水稻对砷的吸收累积.在含砷水溶液中, 无定型水铁矿被证实可以吸附砷而大幅度降低砷在水环境中被直接还原的速率, 其中液相As(Ⅴ)和0.2 g·L-1水铁矿悬液中的As(Ⅴ)在Shewanella putrefaciens strain CN-32介导下的还原半衰期分别为3 h和227 h[36].这说明铁矿物对砷的抑制和降低砷被直接还原的作用.相似地, 在水稻土环境中同样表明无定型铁矿物对砷具有吸附截留作用.钟松雄等[11]通过不同铁矿物对砷的固定化作用研究, 发现水稻土无定型铁含量与水稻土溶液中砷的含量呈显著负相关(r=-0.895, P=0.006), 且无定型铁含量和F3呈显著正相关(r=0.879, P=0.009). Liu等[12]进一步研究表明, 无定型铁含量与大米谷粒和秸秆中的砷含量呈显著负相关, 分别为r=-0.838, P < 0.001和r=-0.705, P＜0.001, 说明水稻土无定型铁的存在能取得抑制水稻土砷被水稻吸收累积的关键作用, 而另一方面, 有研究表明, 耕种期间淹水水稻土中无定型铁矿物中只有少于1%的草酸铵提取铁被还原[37].本研究中, 土壤无定型铁与培养液砷存在负相关关系, 即第一阶段和第二阶段分别为r=-0.428(P=0.126)和r=-0.564(P＜0.05), 这与前人的研究报道相符, 证实在淹水缺氧条件下无定型铁矿物对砷具有截留贮存作用.这与无定型铁矿物具有巨大的比表面积, 砷可以在其表面形成外圈螯合物或直接与其表面未饱和的羟基进行配体交换形成稳定的内圈螯合物有关[11, 38].
本文的研究结果表明F1+F2对溶液中砷浓度提高的贡献是主要的, 而F3主要是水稻土中砷的储藏库, 但F3处于亚稳状态, 其还原只占小部分.无定型铁矿物具有巨大的比表面积和表面未饱和的羟基功能团决定着无定型铁矿物对砷的贮存作用[11].铁还原微生物使铁氧化矿物还原是驱动砷释放的主要原因, 这种地球生物化学作用机制决定着砷的生物化学行为.通常, 无定型铁矿物的还原主要与厌氧淹水环境、时间和铁还原微生物所需的营养物质等有关.相比于间歇式淹水和落干处理, 处于亚稳状态的水稻土无定型铁矿物在长期持续淹水处理的条件下可能发生更为明显地还原溶解现象, 这可能在有氧环境条件下降低水稻土铁还原微生物丰度或者复氧过程促进亚铁氧化紧密相关.
4 结论(1) 水稻土经富集培养后, 第二阶段培养液中铁(Ⅱ)、砷浓度相比于第一阶段均显著地提高(P＜0.05), 且相关性分析表明富集培养液中砷主要来源于水稻土可交换态砷(F1)和专属吸附态砷(F2), 而短期内水稻土无定型铁结合态砷(F3)在第一阶段没有出现释放的现象.
(2) 水稻土盐酸提取铁(Ⅱ)与砷释放在两个阶段均表现出显著正相关关系, 而水稻土无定型铁与培养液砷浓度均呈负相关关系, 表明水稻土无定型铁矿物能有效地截留和储存无定型铁结合态砷从而有效地降低砷释放.
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