2018, Vol. 39
2. 中建一局华江建设有限公司, 北京 100161
2. Huajiang Construction Company Limited of China Construction First Group, Beijing 100161, China
目前在中国北方农村或缺水地区, 传统的旱厕一直是主要的人体粪便卫生处理和储存方式[1].然而这种方式对环境与公共健康而言, 存在大量不利影响, 比如容易污染地下水和引起肠胃疾病[2].在缺水地区, 水冲厕所的推广是困难的, 而堆肥厕所是一项以好氧堆肥为基础的人粪便卫生处理技术, 被视为是最佳的替代技术[3].由于好氧堆肥处理粪便(堆肥厕所)不需要基础设施并可以廉价引进, 它的应用正变得越来越商业化, 特别有助于农村地区、自然公园和缺水地区卫生的改善[4, 5].好氧堆肥在处理粪便的同时, 可得到含有丰富营养物质如氮磷钾的堆肥产品, 可用作肥料和土壤调理剂.人粪便通常含有高浓度的激素和抗生素药物残留, 因此为避免二次污染, 粪便堆肥产品的安全性需要引起人们的重视.
抗生素广泛应用于人类疾病的预防和治疗[6].然而由于其生物利用率低, 30%~90%的抗生素不能在人体内代谢和降解, 以原药的形式随粪便和尿液排出体外, 其中一些仍具有生物活性[6, 7].好氧堆肥是粪便无害化处理和资源化利用的主要途径之一, 也是一种可行和有效的抗生素去除技术[8~10].四环素、喹诺酮和磺胺类抗生素等是人大量频繁使用的药物, 它们的最大日剂量能达到6 g·d-1, 并且排泄率最高可达90%[11].大量残留抗生素可以随人粪便进入堆肥反应器, 因此在堆肥时抗生素的残留是否会影响堆肥过程应进行考察.关于不同抗生素对堆肥过程影响的研究主要集中在对堆肥温度、pH、C/N和TOC等堆肥物化参数的影响[12, 13].针对抗生素对堆肥中微生物群落变化的研究较少且主要集中在堆肥过程中细菌、真菌和抗药性细菌等菌群数量的研究方面, 研究方法主要为传统培养法和碳素利用法[14~16].四环素是一种人常用抗生素[17], 了解其对堆肥过程的影响是非常必要的, 但直到现在还未发现相关的研究.此外, 以往的研究中抗生素浓度往往小于200 mg·kg-1, 因此, 较高浓度的抗生素对小规模的家庭堆肥过程的影响也应进一步了解.
在本研究中, 四环素以不同浓度被加标到人粪便和锯末的堆肥原料中, 利用高通量测序方法分析堆肥中的微生物群落结构变化, 主要目的是调查四环素对以家庭规模堆肥为基础的人粪便好氧堆肥过程及微生物群落演替的影响, 揭示堆肥过程中的微生物演变规律, 以期为含抗生素粪便堆肥无害化处理提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 实验材料标准品四环素盐酸盐(Tetracycline, TC, 纯度≥97.5%)购自Sigma-Aldrich公司.堆肥原料由人粪便和锯末组成.实验所用粪便取自校内某学生公寓, 其中四环素浓度低于检测限.人粪便收集处理后分装, 置于-20℃的冰箱中保存.作为空白载体和调理剂的锯末, 由西安市某木材加工厂提供, 筛选出粒径1~2 mm的锯末.人粪便和锯末的理化性质如表 1所示.
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表 1 人粪便和锯末的理化性质 Table 1 Physicochemical properties of the human feces and sawdust used in this study |
1.2 实验设计
本研究采用的实验装置如图 1所示.该反应器由2层柱状有机玻璃构成, 体积为25 L.为了维持好氧环境, 在每个反应器底部建立一个5 cm高的气室, 用金属支撑材料.在材料上打小孔既不使堆肥样品漏下又可保持通风环境.空气通过气泵进入气室, 通气量为1.5 L·min-1.反应器顶部加盖并在盖上钻孔以保持通风并可减少水分流失.反应器外层加保温材料.
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图 1 堆肥反应器结构示意 Fig. 1 Schematic diagram of the ecological composting reactor |
初始人粪便和锯末按照1:2.5(基于干重)进行混合, 每个堆肥反应器中加入0.3 kg人粪便和0.75 kg的锯末(均为干重), 调节C:N为24:1.在整个堆肥过程中, 含水率维持在60%左右.四环素作为治疗药物, 成人日剂量为1~2 g, 并且排泄率为80%~90%[11].单独的商业用家庭堆肥装置的反应器中装有4 kg锯末[8], 以一个病人每天四环素的最高日剂量(2 g)和排泄率(90%)计算, 堆肥反应器中四环素的浓度能达到450 mg·kg-1, 随着人粪便的增加, 堆肥反应器中四环素浓度进一步升高.值得注意的是在中国抗生素滥用现象非常严重, 更多的抗生素也可以通过食物链进入人体[18].根据TC的添加浓度, 堆肥实验共设4个处理:CK(不添加TC)、TC100(100 mg·kg-1 DW TC)、TC250(250 mg·kg-1 DW TC)、TC500(500 mg·kg-1 DW TC).堆肥实验在室温28℃的环境中进行.每个处理重复3次.
在21 d的堆肥中每天2次对堆料搅拌混匀.每天定时采集搅拌混匀的样品.将采集的样品分为两部分, 一份存于4℃冰箱, 用于化学分析和酶活性测定; 另一份保存于-80℃, 用于分子生物学分析.取堆肥第2 d(升温期)、6 d(降温期)、21 d(腐熟期)的样品用于微生物群落分析. 4种不同堆肥处理在堆肥温度变化的3个阶段(升温期、降温期、腐熟期)被标记为CK-1、CK-2、CK-3、TC100-1、TC100-2、TC100-3、TC250-1、TC250-2、TC250-3、TC500-1、TC500-2和TC500-3.
1.3 理化参数分析方法4种不同堆肥处理中的堆体温度每天监测2次, 在堆体的上层、中层、下层测定, 以平均值作为当天堆体温度.样品含水率用烘干法测定.其他堆肥参数如pH、水溶性碳(WSC)、NH4+-N、NO3--N和种子发芽率(GI)的测定方法参照文献[12]中描述的方法.每次测定均设3次平行实验, 取平均值, 最大误差限＜5%.
1.4 脱氢酶活性(DHA)测定DHA的测定通过还原氯化三苯四唑(TTC)到三苯基甲月替(TPF)得到, 方法可参考Feng等的研究[19].简单来说, 2 g样品与2 mL 1% TTC溶液(溶解到0.5 mol·L-1 Tris-HCl缓冲液, pH=7.6)和2 mL去离子水混合, 在37℃的黑暗环境中培养6 h.随后样品与100 mL甲醇混合提取TPF, 150 r·min-1 (20℃)离心1 h, 取有机溶剂层在485 nm比色.不添加TTC作为对照. DHA以mg·(g·h)-1(以TPF计)表示.
1.5 微生物分析 1.5.1 样品处理及DNA提取称取200 mg的样品, 放入灭菌的2 mL离心管中, 加入1 mL 70%乙醇, 振荡混匀, 10 000 r·min-1室温离心3 min, 弃置上层液体.加入1×PBS溶液, 振荡混匀, 10 000 r·min-1室温离心3 min, 弃置上层液体.倒置2 mL管于吸水纸上1 min, 直至没有液体流出.将样品管放入55℃烘箱10 min, 使残留酒精完全挥发, 保证后续实验操作.具体DNA提取步骤参照OMEGA试剂盒(E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit, USA)的说明. DNA提取后, 用琼脂糖凝胶检测DNA完整性.
1.5.2 PCR扩增利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量, 以确定PCR反应应加入的DNA量. PCR所用的引物融合了MiSeq测序平台的V3-V4通用引物(融合341F引物:CCCTACACGACGCTCTT CCGATCTG(barcode)CCTACGGGNGGCWGCAG, 融合805R引物:GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGA GAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC). PCR反应体系为:微生物DNA(10 ng·μL-1)2 μL; 正向引物(10 μmol·L-1)1 μL; 反向引物(10 μmol·L-1)1 μL; 2×Taq master Mix 15 μL, 补无菌Mili-Q水至30 μL.
扩增条件为:94℃预变性3 min, 94℃变性30 s, 45℃退火20 s, 65℃延伸30 s, 重复5个循环; 94℃变性20 s, 55℃退火20 s, 72℃延伸30 s, 重复20个循环; 引入Illumina桥式PCR兼容引物, 95℃预变性30 s, 95℃变性15 s, 55℃退火15 s, 72℃延伸30 s, 重复5个循环, 最后72℃保温5 min. PCR结束后, 使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测目的片段扩增效果.每个样品设置两组平行实验.纯化回收所需的PCR产物, 利用Qubit 2.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量.
1.5.3 测序结果处理利用Illumina MiSeq平台进行微生物高通量分析测定.测序数据采用Flash软件融合双末端序列, 而后通过各样品barcode使数据回归样品, 并对各样本序列做质量控制.去除非靶区域序列及嵌合体.采用RDP classifier将序列进行物种分类, 对每个样本和每个物种单元分类进行序列丰度计算, 构建样本和物种分类单元序列丰度矩阵.将多条序列根据其序列之间的距离来对它们进行聚类, 并将相似性大于0.97的序列定义为一个操作分类单元(OUT).最后计算各种物种多样性指数, 衡量样本物种多样性.
1.6 数据处理与分析数据的统计分析采用Microsoft Excel 2016进行处理和制图, 采用SPSS Statistic 19.0软件进行统计分析.利用单因素方差分析法(ANOVA)进行不同样品差异显著性检验, 差异显著性水平为0.05.
2 结果与讨论 2.1 堆肥温度变化温度是影响好氧堆肥进程的主要因素, 它反映了堆肥过程中微生物活性的变化, 是堆肥无害化的主要标志之一.对家庭尺度堆肥来说, 由于其规模小散热严重, 因此堆肥过程中很难维持较高的温度[20]. 4种不同堆肥处理的温度变化如图 2所示, 变化过程可分为升温期、降温期和腐熟期这3个阶段. CK、TC100、TC250和TC500处理都在堆肥的第3 d达到最高温度, 分别为55.6、50.5、48.2和45.3℃.不管是在堆肥升温期还是降温期, CK处理的堆肥温度明显高于其他处理, 表明高的TC浓度对微生物群落的代谢能力有抑制影响[21].在堆肥后期, 所有处理达到一个相对稳定的温度并接近室温.此时CK和TC100处理的堆肥温度低于TC250及TC500处理的温度, 可能是随着堆肥时间的增加, 堆肥环境会产生抗性种群[21], 增加了堆料中微生物的代谢活性[8], 不同代谢活动产生的热量使各个处理的温度变化不一致.
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图 2 堆肥过程中温度的变化 Fig. 2 Variation of temperature in composting |
判定堆肥无害化过程及达到稳定化的标准为腐熟度[3], 这可反映生物化学稳定度及有机物降解情况, 是堆肥产品的质量指标.种子发芽实验是测定堆肥生理毒性和腐熟度大小的一种直接又快速的方法.有研究指出, 当GI大于80%时, 就可以判定堆肥腐熟, 其毒性被认为已降解至植物能忍耐的水平[22].由表 2可知, CK处理最先满足这个条件, 它的最终GI值为145.8%, 紧跟着为TC100(116.2%)、TC250(95.5%)和TC500(80.2%). Bernai等[23]的研究中用WSC含量来评价堆肥的腐熟, 其含量标准是不高于17 g·kg-1. 4种不同堆肥处理中WSC的变化趋势与温度的变化是相似的, 堆肥结束时, CK处理的WSC含量最低(14.39 g·kg-1), 紧接着分别为TC100(15.83 g·kg-1)、TC250(20.46 g·kg-1)和TC500(25.07 g·kg-1). CK和TC100处理的WSC含量明显低于17 g·kg-1的标准.评价堆肥腐熟度的标准较多, 但至今仍未有权威性的定论, 当其单独作为评价腐熟度标准时, 几乎所有的参数都存在不完善之处.对堆肥腐熟度的评价一般结合了物理学、化学和生物学指标包括堆肥温度、pH、WSC、GI和微生物活性等可被广泛接受的指标.总体而言通过以上的研究发现堆肥中高浓度的抗生素的加入延缓了堆肥的腐熟, TC浓度高达500 mg·kg-1时, TC阻碍了人粪便好氧堆肥过程并影响堆肥产物的腐熟.
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表 2 4种不同堆肥处理中物化参数在堆肥升温、降温和腐熟阶段的变化 Table 2 Changes in physicochemical parameters for composting treatments |
2.3 脱氢酶活性分析
DHA能直接反映生物细胞对基质降解能力的强弱, 是表征微生物的活性和功能多样性的重要指标, 并可为堆肥的腐熟提供信息[24].由图 3可知, 不同处理的最高DHA(以TPF计)分别为CK[12.96 mg·(g·h)-1]、TC100[14.04 mg·(g·h)-1]、TC250[11.67 mg·(g·h)-1]和TC500[8.69 mg·(g·h)-1].堆肥初期DHA的快速增加是由能被脱氢酶催化影响的不稳定的有机物的氧化反应引起的[24].在堆肥的初始阶段, TC100处理的DHA高于CK处理, 表明堆肥过程中低浓度(100 mg·kg-1)的TC促进了脱氢酶的活性, 这可能是由于抗生素的毒物兴奋效应(hormesis)[25].堆肥中残留的抗生素通过影响微生物的活性和数量, 进而影响微生物分泌酶的能力及酶活性大小. Wei等的研究发现[25], 向土壤施加100 mg·kg-1的四环素, 促进了土壤中细菌菌落和真菌群落的增加及活性.与其他处理相比, TC500处理的DHA是明显低的, 可能是因为高浓度抗生素抑制了微生物数量生长及微生物活性.堆肥中高浓度的TC对DHA的抑制从而导致了对有机物分解的抑制.在堆肥腐熟阶段, DHA降低, 这意味着大部分的有机物已被微生物降解并转换成一个稳定的物质, 呼吸过程减慢[26].
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图 3 不同堆肥处理中脱氢酶活性变化 Fig. 3 Changes in activities of dehydrogenase during human feces aerobic composting with different treatments |
不同堆肥处理微生物群落多样性测定结果如表 3所示, 13个堆肥样品中获得356 794个有效序列.通过聚类分析, 在相似度为97%水平下共得到7 813个OTUs.全部堆肥样品的文库覆盖率均高于0.987, 满足对微生物多样性要求.为了反映群落内的物种多样性, 计算了包括香农和辛普森多样性指数在内的α多样性指数. α多样性指数可用来评价堆肥中微生物丰富度和群落均匀度, 香农指数值越大, 辛普森指数值越小, 表明微生物均匀度越高[27].比较不同堆肥处理的香农指数和辛普森多样性指数可知, TC100处理的两种多样性指数相对较高, 这可能是由于四环素的“毒物兴奋效应”促进了微生物群落的活性和多样性[28].在堆肥腐熟阶段, TC500处理的香农和辛普森指数低于其他3个处理.此外, 随着TC添加浓度的升高, 微生物群落的多样性指数逐渐下降, 这可能是由于一些微生物对高浓度抗生素的敏感性, 从而抑制了微生物的数量和活性[29].
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表 3 不同堆肥处理的微生物群落多样性 Table 3 Diversity (Shannon and Simpson) and sequencing depth (coverage) indexes for the bacterial community in each sample |
2.4.2 微生物群落演替
通过比较高通量测序获得的细菌16S rRNA基因的组成和结构, 分析了堆肥过程中细菌群落的组成变化.不同堆肥处理的细菌群落所占丰度在门水平上均发生了显著变化, 如图 4所示.众所周知, 堆肥过程会影响细菌种群及数量[30], 但暴露于高浓度的TC环境会导致堆肥微生物群落组成发生重大变化.
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横轴中的1,2,3 分别代表堆肥的温度上升、温度下降和腐熟阶段，下同 图 4 不同堆肥处理中细菌在门水平上的相对丰度 Fig. 4 Bacterial community evolution during the aerobic composting of human feces at the phylum level |
Mothur分类结果显示各处理样品中的主要菌群为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria), 有研究报道这4种主要的菌群是粪便堆肥中的优势门类[31, 32].在人粪便和锯末的堆肥原料中, 厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)所占丰度分别为87.3%、7.3%、1.9%和0.6%.随着堆肥的进行, 在堆肥升温阶段, 变形菌门(Proteobacteria)的数量显著增加, 厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)成为优势菌种, 占所有细菌16S rRNA基因序列总数的88.0%~94.4%.与CK处理相比, 添加TC的堆肥处理中, 变形菌门(Proteobacteria)的丰度随TC浓度的升高而减小, 这可能是因为变形菌门(Proteobacteria)的耐热性低于厚壁菌门(Firmicutes)[33].在堆肥的温度下降和腐熟阶段, 拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰度明显增大, 并和变形菌门(Proteobacteria)共同成为优势菌种. Takaku等[30]的研究中也报道了拟杆菌门(Bacteroidetes)微生物大量存在于堆肥的中后期.在堆肥中, 放线菌门(Actinobacteria)数量的变化可以评价堆肥的腐熟度[32].在CK处理中, 放线菌门(Actinobacteria)的丰度从0.3%(升温阶段)显著增加到5.9%(降温阶段).然而在添加TC的堆肥处理中, 放线菌门(Actinobacteria)的丰度明显低于CK处理.因此, 堆肥中的TC影响了细菌群落的丰度, 这些发现与文献[34]的研究结果相似.
图 5是在微生物的种水平下的物种丰度热图, 用物种丰度矩阵绘制.其中每一列代表一个样本, 行代表菌群, 颜色块代表相对物种丰度值, 颜色越红表示相对丰度越高, 颜色越蓝反之.分析结果显示堆肥的升温、降温和腐熟阶段的各处理聚为一类, 堆肥降温和腐熟阶段的微生物群落物种组成及其相对丰度更相似, 与堆肥升温阶段的相似性较低.典型的粪便病原体大肠杆菌/志贺氏菌(Escherichia/Shigella)是CK处理堆肥初期的主要菌种, 占细菌总数的47.15%.在TC处理中, 大肠杆菌/志贺氏菌(Escherichia/Shigella)的丰度随TC浓度的增加而显著减少, 而芽孢杆菌(Bacillus)的丰度增加, 成为了升温阶段的主要属.芽孢杆菌(Bacillus)是一种在粪便堆肥中属于厚壁菌门(Firmicutes)的常见属[30], 存在于堆肥的不同阶段, 具有纤维素分解能力[35], 并可产生蛋白酶、几丁质酶和多种纤维素酶[36], 在TC500处理的升温阶段占总数的46.41%.在堆肥温度下降阶段的优势物种主要为鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、Moheibacter、香味菌属(Myroides)和嗜油极小单胞菌(Pusillimonas).鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)属于鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales), 在不同堆肥处理的中后期均是优势属, 尤其是在CK处理中. Moheibacter和香味菌属(Myroides)都属于黄杆菌目(Flavobacteriales), 在TC100和TC500处理的温度下降阶段是优势菌属.有研究报道拟杆菌门(Bacteriodetes)能有效降解堆肥中的大分子有机物[34], 属于拟杆菌门(Bacteriodetes)的Flavobacterium属可降解碳氢化合物[37], 因此拟杆菌门(Bacteriodetes)的细菌对于堆肥有机物的去除具有重要作用.嗜油极小单胞菌(Pusillimonas)属于产酸菌科(Alcaligenaceae), 能利用堆肥中的有机酸并产生碱[38], 它可能有助于提高堆肥中的pH和维持碱性环境.在堆肥处理的腐熟阶段, 嗜温微生物大量繁殖, 优势菌属种类增加, 表明了物种多样性的扩增[33].在堆肥腐熟阶段, TC处理中细菌群落结构和优势菌属的相似性低于CK处理.
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图 5 不同堆肥处理中微生物物种丰度热图 Fig. 5 Heatmap of species relative abundance at the genus level in compost samples |
堆肥中微生物的优势种属的变化除了受TC浓度影响外, 堆肥过程中的堆体理化参数变化也会驱动堆体中微生物群落结构发生改变[28].冗余分析(RDA)是基于排序技术的线性分析方法, 不仅可以结合多个环境因子一起分析, 而且能够独立保持每一个环境因子对物种变化的贡献率[39].为了清晰地了解堆肥过程物化特性与微生物群落结构变化之间的关系, 进行RDA分析, 结果如图 6所示.研究结果显示细菌群落在堆肥温度上升阶段变化迅速, 但在堆肥后两个阶段变化较小.总体而言, 细菌群落结构在堆肥温度下降后趋于稳定, 这也证实了聚类分析的结果.堆肥过程中的堆肥温度、pH、WSC、NH4+-N、NO3--N、DHA和种子发芽率(GI)的变化总结于表 2中.在选择的7个参数中, 堆肥温度、NH4+-N和GI与第一轴正相关(P < 0.05), pH和DHA与第二轴正相关(P < 0.05).以上堆肥参数显著影响堆肥中细菌群落结构的变化, 其他研究也有过相似发现[32, 40].相比其他堆肥参数, NO3--N和WSC对堆肥中细菌群落组成的变化影响较小, 但并不意味着NO3--N和WSC对细菌群落组成的影响不重要.氮素和碳素都是细菌生长的基本营养元素[3], 其中WSC积极参与碳循环, 是细菌生长和活动的直接前体, 直接驱动其分解过程.
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图 6 堆肥中细菌群落与物化参数关系的冗余分析 Fig. 6 Redundancy analysis of the relationships between bacterial community (OTU abundance at 3% cutoff level) and the physiochemical attributes of composting samples |
(1) 本文以TC为例, 调查抗生素残留对人粪便好氧堆肥的影响, 得到TC对人粪便堆肥理化性质的影响与其浓度有关.堆肥中TC浓度的增加显著抑制了堆料中温度的升高, 增加了WSC的残留, 减少了GI.四环素浓度越高(500 mg·kg-1)越会对堆肥过程产生显著抑制作用.
(2) 不同浓度TC对堆肥中脱氢酶活性的影响表现出差异, 通过脱氢酶活性变化趋势分析, 低浓度(100 mg·kg-1)的TC可促进脱氢酶活性, 而TC浓度的升高抑制了堆料中脱氢酶的活性, 导致了生物活性的改变或降低.
(3) 堆肥温度、pH、WSC、GI和DHA等指标都可以用来表征堆肥的腐熟度.研究结果表明堆肥中TC浓度高达500 mg·kg-1时, TC阻碍了好氧堆肥过程并影响堆肥产物的腐熟.
(4) 堆肥中TC浓度的增加显著改变了微生物群落演替, 限制了某些微生物属的生长, 从而影响了微生物的多样性和丰度.高浓度TC对微生物群落结构的干扰和对生物活性的抑制导致了堆肥腐熟的延迟.
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