2018, Vol. 39
2. 上海市环境科学学会, 上海 200003;
3. 中国环境科学研究院, 北京 100012;
4. 上海市检测中心, 上海 201203;
5. 上海市辐射环境监督站, 上海 200065
2. Shanghai Society of Environmental Sciences, Shanghai 200003, China;
3. Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China;
4. Shanghai Academy of Public Measurement, Shanghai 201203, China;
5. Shanghai Radio-Environment Supervision Agency, Shanghai 200065, China
PM2.5具有比表面积大、粒径小的特点, 易于富集重金属、有机毒物(二英、PAHs)、细菌、病毒等有毒有害物质, 并在呼吸道和肺泡中沉积[1].流行病学和毒理学研究证实, 人体长期暴露于PM2.5污染环境中会增加肺癌、呼吸道疾病以及动脉硬化等疾病的发病率[2, 3].短时间暴露于高浓度PM2.5环境, 会造成一些呼吸道疾病的加重, 如支气管炎和哮喘等, 同时也可能影响肺活量、心率变异等生理体征[4, 5].颗粒物污染, 尤其是PM2.5污染, 对老人、小孩或已经有呼吸系统和心血管疾病的易感人群影响较大[6], 高浓度PM2.5暴露对呼吸系统疾病有促进作用[7].近年来, 一些细菌、动物被作为研究模型参与到环境毒性研究中, 如发光细菌水质毒性检测[8]、小鼠颗粒物暴露研究[9].但是PM2.5的细菌毒性却鲜有研究, 健康危害作用机制尚未完全揭示[10].在不同气象、污染排放条件下, PM2.5吸附的毒物种类、浓度也会有明显区别, 这是难以有效开展组分浓度与毒性效应定量关系研究的重要原因. Aammi等[11]采用发光细菌Vibrio fischeri、SOS显色反应方法评估了伊斯坦布尔不同工业特征区域的大气颗粒物的急性毒性、基因毒性, 并发现毒性效应与季节、采样区位有显著的关联.
有研究表明, PM2.5暴露危害机制主要是由于炎症、氧化应激和基因毒性带来的不良影响[3], 其中基因毒性主要包括氧化性DNA损伤及基因的异常表达[12].一些以鼠类为模型进行颗粒物暴露健康效应研究的结果显示, 无论是间接暴露[9](气管灌注)还是直接呼吸暴露[13], 动物肺组织及脏器均产生不同程度的损害. Gunnison等[14]将小鼠暴露于浓缩后的城市大气PM2.5, 结果显示Limd1基因表达下调1.5倍, Rex3基因的表达在心脏组织中升高1.8倍. Leikauf等[15]将小鼠暴露于NiSO4颗粒物环境中, 发现肺损伤、基因变化随暴露时间的增加而增强.
本研究用微生物和哺乳动物作为实验受体, 选取不同浓度梯度的PM2.5颗粒物样品, 对PM2.5发光细菌急性毒性和遗传毒性进行评价; 通过非创伤气管灌注小鼠来模拟呼吸暴露, 采用肺组织病理分析、转录组测序手段, 开展PM2.5暴露危害效果及机制的研究. PM2.5采样点位于浦东新区中心城区, 周边主要为居民区和商业区, 是典型的城区或居民区监测采样点.采样位置距地面约20 m, 站点区域空气质量受污染源排放影响较小.采样仪器为武汉天虹TH-20A型和MetOne SASS采样器.
1 细菌毒性研究选取不同浓度梯度的PM2.5颗粒物样品开展发光细菌急性毒性和遗传毒性评价, 实验在上海市检测中心生物与安全检测实验室进行.采样仪器为武汉天虹TH-20A型四通道采样器, 采样膜为Teflon滤膜.将采样膜剪碎, 置于15 mL灭菌超纯水中, 在80 Hz的频率下超声15 min, 重复上述过程1次.在第3次超声时, 加入20 mL超纯水, 80 Hz超声20 min, 最终得到各个浓度的50 mL样品母液, 用于发光细菌急性毒性和遗传毒性测试, PM2.5悬浮液样品信息见表 1.
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表 1 PM2.5悬浮液样品信息 Table 1 PM2.5 suspended sample information |
1.1 发光细菌急性毒性
发光细菌遇到有毒物质后发生敏感反应而抑制自身发光, 抑制程度与所受污染物浓度及其毒性大小相关[16].用费氏弧菌进行环境生物毒性预警和急性毒性测试是目前比较成熟的方法[17].采用毒性分析仪(SDI, Microtox Model 500型分析仪, MicrotoxOmni software v1.2)测试表 1中PM2.5悬浮液样品对发光细菌发光量的抑制作用, 结果用EC50表示(发光量减少50%时PM2.5悬浮液的体积分数, 单位为%).
1.1.1 实验材料实验细菌为发光细菌Vibrio fischeri (NRRL B-11177)冻干粉, 含有106个细菌, 采购于格维恩科技有限公司, 于-18℃~-20℃下保存.主要材料有超纯水(发光细菌冻干粉的活化溶液)、2% NaCl(稀释水, 同时用作空白对照组)、毒性分析仪配套的测试管(用于样品、参比样品、空白对照的检测).
1.1.2 实验过程根据ISO 11348-3-2007(水质-水样对弧菌类光发射抑制影响的测定)中规定的方法进行实验操作和急性毒性判定[18].将制备的PM2.5悬浮液稀释成不同浓度梯度的待测样品, 用稀释水平D(D=待测样品总体积/悬浮液体积)表示, 本实验样品的稀释水平D分别为1、2、3、4、6、8、12、16, 并设立空白对照组.空白对照组和各浓度组均设两个平行样.
启动Microtox Omni软件v1.2.检测和记录未接触样品、参比样品前的所有测试管内的光密度值(I0), 数据直接输入软件, 然后立刻加入样品(稀释样品溶液、参比样品溶液或NaCl溶液), 涡旋混匀, 放在控温槽内, 保持15℃±1℃, 培养30 min后再测光密度值I30.
1.1.3 测试结果用七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O, 1934 mg·L-1)作为毒性参照物, 与复苏后的发光细菌接触30 min后, 发光抑制率为53%;本实验中毒性参照组、空白对照组30 min的发光抑制率与平均值的偏差均在3%内、校正因子数值均在0.6~1.8之间.通过上述测试表明, 本研究的发光抑制测试结果稳定、可靠.发光细菌急性毒性检测结果如表 2, 根据毒性分级标准判断, 样品5、6的发光细菌急性毒性为低毒, 其余样品为无毒.
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表 2 发光细菌急性毒性检测结果 Table 2 Acute toxicity test results of luminescent bacteria |
1.2 细菌遗传毒性
指示菌暴露于基因毒性物质中会诱发SOS反应.通过SOS反应揭示、判断DNA是否受损伤及受损伤的程度, 从而判断待测物是否具有三致毒性效应(致畸、致癌、致突变).样品的基因毒性大小用SOS诱导因子(SOSIF)来表征, 反映受试物诱导SOS显色反应的能力, 即遗传毒性的大小.
1.2.1 实验材料A瓶：SOS-CHOROMOTESTTM实验菌株的生长液(5个); B瓶：SOS-CHOROMOTESTTM实验冻干菌株(1个, EBPI公司大肠杆菌E.coli PQ37); C瓶：SOS-CHOROMOTESTTM实验的稀释液(1个), 10%二甲亚砜(DMSO, 溶于生理盐水); D瓶：标准遗传毒性溶液(阳性参照物, 1个), 包含10 μg·mL-1的4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQO)的溶液; E瓶：蓝色显色剂(2个); F瓶：碱性磷酸酶的稀释液(1个); G瓶：碱性磷酸酶(1个); H瓶：终止液(1个); I瓶：二甲基亚砜(DMSO, 1个), 用于溶解不溶于水的样品; J：2块96孔板和生物危害品袋(用于废弃物); 恒温培养箱(Torrey, IN20);微量离心机; 酶标仪. PM2.5待测样品信息见表 1.
1.2.2 实验过程简介在实验前一天, 打开A瓶和B瓶.迅速从A瓶中转移10~12 mL的生长液到含有冻干菌粉的B瓶内, 充分混匀30 s.同时, 打开第二瓶A瓶, 从已含有菌株和10~12 mL的生长液的B瓶中, 转移100 μL到新的A瓶中, 混匀.在37℃下过夜培养8~12 h.第二天菌液的光密度D值(600 nm±20 nm)应在0.15~0.20的范围内.在实验当天, 观察生长菌液是否有一定的浑浊, 只有在浑浊存在的情况下, 实验才得以进行.用D值来判断是否有浑浊, 如D值过高, 应稀释菌液使D值在0.05和0.06之间.
将表 1中各个样品母液分别在一块96孔板(6行×16列)上进行稀释, 稀释因子为2, 每个样品设有14个稀释测试浓度.用D瓶4-NQO溶液作为阳性对照组(离心管内), 用10%DMSO(C瓶)稀释得到6个2倍的稀释浓度.用10%DMSO作阴性对照组.
将样品分散入微孔板开始SOS显色反应实验, 分别在(600±20)nm和(420±20)nm下读取吸光值, 进行SOSIF值计算.本实验中的SOSIF值由EBPI-SOS-CHROMOTESTTM试剂盒配套的Excel表计算得到.
1.2.3 遗传毒性结果诱导系数SOSIF＜1.5时, 表明受试物遗传毒性呈阴性, 诱导系数SOSIF在1.5~2.0之间, 受试物有可能有遗传毒性, 诱导系数SOSIF＞2.0时, 受试物遗传毒性呈阳性.由于实验数据较多, 选取表 1中第6号样品进行SOS反应测试数据展示, 具体内容见表 3.
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表 3 6号样品SOS反应结果 Table 3 SOS reaction results of sample No. 6 |
测试数据表明, 6个PM2.5样品的所有浓度梯度的SOSIF范围在0.89~1.24之间(表 4), 符合SOSIF＜1.5的毒性判断条件, 表明受试物遗传毒性呈阴性.此外, 从单个样品角度看, 不同实验浓度梯度的SOSIF值与均值偏差较小, 不存在异常波动值, 线性关系不明显, 进一步说明“阴性”结果较为稳定.用SPSS软件拟合PM2.5样品浓度-SOSIF关系, 尽管线性关系不明显, 但是有助于人们直观了解遗传毒性的结果表达, 6个PM2.5样品遗传毒性结果见表 4.
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表 4 遗传毒性测试数据 Table 4 Test data for genetic toxicity |
2 材料与方法 2.1 样品采集及处理
采样仪器为MetOne SASS, 滤膜为Teflon膜.小鼠的呼吸量[19]取34mL·min-1, 将空气质量标准(GB 3095-2012)日均值一级标准(35 μg·m-3)、二级标准(70 μg·m-3)分别作为小鼠的呼吸暴露浓度, 则小鼠一天PM2.5呼吸暴露量分别为1.7 μg(34 mL·min-1×60 min×24 h×35 μg·m-3=1.7 μg)和3.5 μg.采用气管灌注方法模拟小鼠呼吸暴露, 设置日灌注量分别为1.7、3.5、7.0 μg的3个浓度梯度实验组, 对应PM2.5日均暴露浓度分别为35、70和140 μg·m-3, 同时设置不含PM2.5的生理盐水对照组.
PM2.5滤膜剪碎后, 超声振荡处理15 min(重复3次)后冷冻保存; 根据每个样品膜上PM2.5质量, 加入一定量的灭菌后的生理盐水, 配制成17、35、70 μg·mL-1的颗粒物悬浮液液, 冷冻保存.每次实验使用1张PM2.5滤膜进行悬浮液配置, 实验当天配置使用.气管灌注量为每天100 μL, 分3次灌注, 灌注间隔时间为8 h; 实验隔天进行, 共进行7 d、21次灌注实验.
2.2 气管灌注本实验所用动物为从中国医学科学院购买7周大C57雄鼠, 体重为20~25 g, 共40只, 将其随机分为4组, 每个浓度梯度各10只.分笼饲养, 12 h/12 h昼夜交替, 温度22℃±1℃, 相对湿度40%~60%.在中科院心理所动物实验中心SPF级动物房适应性饲养, 自由进食、饮水等, 至8周大时, 开始气管灌注实验.每次灌注时, 对小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(10 mg·L-1)进行麻醉, 5 min后生效.使用10 μL移液器, 每次吸取少量液体, 将其伸入小鼠鼻腔, 由其自行吸入进气道.而后将小鼠直立, 垂直旋转小鼠, 以使灌注物在小鼠肺脏中均匀分布, 从而建立颗粒物损伤小鼠肺脏模型.
2.3 肺脏处理实验动物被麻醉处死后, 迅速取出肺组织, 将左肺放入福尔马林溶液中固定, 用于肺组织病理分析; 右肺迅速放入液氮冷冻, 用于肺RNA提取.
2.3.1 取肺开胸腔, 小心取下肺组织, 放于DEPC-H2O中清洗.左肺放于甲醛溶液中固定; 取右肺上两叶, 用DEPC-H2O清洗, 去除血液, 并保证不被DNA污染, 之后迅速放于冻存管内, 放入液氮冻存.
2.3.2 肺组织病理分析将对照组(灌注液不含PM2.5, 仅为生理盐水)和暴露组(灌注液PM2.5浓度分别为17、35、70 μg·mL-1)肺置于福尔马林溶液中浸泡、固定, 24 h后采用石蜡包埋、切片后用苏木素伊红染色(HE染色).用100~400倍自动光学显微镜(Nikon90i全自动科研级显微镜)观察组织形态, 并拍照保存.
2.3.3 转录组测序转录组研究是基因功能及结构研究的基础, 通过新一代高通量测序, 能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息.选取对照组(生理盐水灌注)和中度浓度暴露组小鼠(日灌注量为3.5 μg), 提取肺组织, 进行全基因组的表达谱测序分析.
3 结果与讨论 3.1 肺脏病理切片分析各实验组代表性肺脏切片见图 1, 可以看出, PM2.5暴露后, 大部分毛细血管及小静脉扩张充血, 肺泡腔充满淡红色, 比较匀质的水肿液, 肺泡腔扩张, 存在炎性渗出物, 且肺组织有实化现象, 此现象随PM2.5浓度增大而加重.
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图 1 各实验组代表性肺脏切片图(HE×200) Fig. 1 Lung histology (HE stain×200) of representative experimental group |
结果表明, PM2.5暴露对肺组织会造成不同程度的损伤, 浓度越高, 损伤现象越明显, 主要表现为肺部炎症和纤维化.需要强调的是, 上述间接暴露实验结果与本课题组另一项直接暴露实验结论相吻合[20].在直接暴露实验中, 孕鼠及其8周龄大仔鼠被分别放置于暴露箱(呼吸环境空气)和对照箱(呼吸经HEPA膜过滤后的环境空气)中进行暴露实验.实验结果显示, 相比对照组, 暴露组动物肺部均出现炎症反应, 且气管上皮杯状细胞出现明显增生, 各实验组代表性肺病理切片见图 2.
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(a)暴露组孕鼠肺泡; (b)对照组孕鼠肺泡; (c)暴露组孕鼠支气管; (d)对照组孕鼠支气管; (e)暴露组8周龄仔鼠肺泡; (f)对照组8周龄仔鼠肺泡; (g)暴露组8周龄仔鼠仔鼠支气管; (h)对照组8周龄仔鼠支气管 图 2 孕鼠和8周龄仔鼠肺脏切片 Fig. 2 Lung histology (HE stain×100) of pregnant rats and 8-week-old rat offspring |
本次测序中, 从“每个碱基序列质量中位数、每条序列的质量均值分布、碱基位置分布、每条序列平均GC含量分布、每条序列中N含量”5项指标对测序质量进行评估, 均呈现较好的评估结果, 说明测序质量可靠, 符合研究要求, 可进行后续分析.
3.2.1 差异基因结果分析以对照组基因表达量为基准, 计算暴露组相对于对照组基因的表达量, 从而筛选出差异表达基因.基因表达量计算使用RPKM法(Reads Per Kb per Million reads).使用ILLUMINA测序仪进行转录组测序分析, 按照P < 0.05才具有显著性差异的原则, 共得到差异基因381个.相比于对照组, 暴露组小鼠肺脏中246个基因表达上调, 135个基因表达下调.
为了进一步探索这些差异基因从哪些方面影响肺脏功能, 采用DAVID Bioinformatics Resources 6.8(https://david.ncifcrf.gov)进行了GO(Gene Ontology)功能分析和Pathway分析, 从中筛选具有差异的通路、功能聚类及造成影响的具体基因.
3.2.2 差异基因Pathway分析Pathway指代谢通路, 是转录组测序后基因表达结果分析的重要工具.差异基因Pathway分析在机制研究中显得尤为重要, 可以了解实验条件下显著改变的代谢通路, 寻找不同样品的差异基因可能与哪些细胞通路的改变相关[21].根据P < 0.05原则, Ribosome、PPAR signaling pathway两条通路具有统计学显著性, 见图 3.
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图 3 差异基因的Pathway分析 Fig. 3 Pathway analysis of differentially expressed genes |
最明显差异通路为与核糖体(Ribosome)相关的通路, 而核糖体的核心功能是参与DNA、细胞蛋白质合成[22], 转录组测序结果分析显示, 暴露组小鼠肺部很多核糖体表达上调, 如RP117(上调3.84倍), RPS27(上调2.7倍), RPS3(上调2.33倍), RPL37(上调1.91倍), RPL18(上调1.4倍), 说明PM2.5暴露影响了小鼠肺脏中核糖体相关功能, 提示人们肺部炎症反应源于基因损害, 其造成的损害后果可能是不可逆的, 这一结论也有助于揭示PM2.5作为致癌物的致癌机制.
另一条具较显著差异的信号通路为PPAR(peroxisome proliferator-activated receptors), PPAR是配体激活的转录因子, 广泛参与机体各种代谢及细胞分化过程, 并在炎症过程中发挥重要作用[23].引起本条通路的主要差异基因是Apoa1、Apoa2、Scd1.其中, 相比于对照组, 暴露组Apoa1(apolipoprotein A1)上调23倍, Apoa2(apolipoprotein A2)上调7倍, 二者均为载脂蛋白, 是血浆中高密度脂蛋白的主要成分, 它们的表达异常会导致胆固醇代谢异常, 也会影响机体正常的免疫反应; Scd1下调1.8倍, 此基因的主要功能是调控脂肪酸的合成.因此, 可以推断, 颗粒物暴露影响到小鼠肺部载脂蛋白合成及其代谢功能的正常发挥, 相关基因的过度表达可能是导致肺脏功能损伤的原因之一; 此外, 颗粒物暴露影响会直接或间接影响到脂肪酸的代谢功能, 从而导致肺脏病变.
3.2.3 差异基因GO功能分析GO分析可以找到富集差异基因的GO分类条目, 通过GO分析可以了解差异基因富集在哪些生物学功能[24].本研究中, 根据P < 0.05原则, 富集度最高的聚类集中于免疫功能, 也就是说PM2.5暴露影响到小鼠的免疫功能正常表达.机体免疫功能具有识别、杀灭、解毒、分解和清除体内异物的能力, 可以维持机体内环境的稳定性.已有研究证明颗粒物暴露会使得机体产生氧化应激和炎性反应两种生物应答, 并伴随基因组结构或功能的改变[25].由于氧化应激和炎性反应与机体免疫功能密不可分的生物学过程, 可以推断PM2.5暴露严重影响小鼠机体免疫功能, 导致肺脏功能损坏.结合聚类分析结果, 功能损坏路径主要体现在以下5个方面.
(1) CD8b1, 一种白细胞分化抗原, 参与T细胞介导的免疫反应, 在暴露组中表达下调2.74倍; 同时, Cd74上调1.47倍, 在调节免疫系统的抗原表达过程中发挥重要作用.
(2) Klrg1表达下调3.61倍, Klre1表达上调3.43倍. Klrg1和Klre1均为自然杀伤细胞表面受体, 能协调某些肿瘤细胞的溶菌作用, 以及导致一些被感染病毒的失活.
(3) C2, C3在补体系统激活中扮演着中心角色, 分别上调1.56倍、1.42倍; 同时, Cfp上调1.47倍, 它一种血浆糖蛋白, 能激活补体系统和免疫系统.
(4) Cxcl14是一种细胞因子, 主要参与免疫调节和一些炎症过程, 通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应, 调控免疫应答, 在暴露组中下调2.1倍.
(5) MMP9, 涉及正常生理过程中细胞外基质的分解, 如胚胎发育、繁殖和组织重构等过程, 下调1.7倍. Camp可以编码抗菌肽, 其上调5.43倍. Ccl5为趋化因子, 参与免疫调节和炎症过程, 下调2.1倍.
目前很多研究将PM2.5暴露危害原因与肺部新陈代谢功能紊乱相关联, 但具体机制尚不明确. Gu等[26]用气管灌注等方法开展了小鼠PM2.5暴露健康效应研究, 发现PM2.5暴露加重了慢性阻塞性肺病(COPD)小鼠的病情, 并通过影响Notch信号通路的方式干扰了小鼠免疫平衡及功能的正常发挥; Wang等[9]同样用PM2.5悬浮液气管灌注方法研究了成年公鼠的代谢应答, 发现小鼠肺部氧化应激指标显著增加, 参与脂质及核苷酸代谢的功能有异常; 张蕴晖等[27]在用PM2.5染毒心血管内皮细胞24 h后, 提取内皮细胞中的mRNA进行分析发现, PM2.5染毒浓度的增加, 趋化因子mRNA表达产物的相对含量显著增高; 这些研究结论在本文也得以补充证实.
4 结论(1) 尽管6个PM2.5样品浓度在43.4~135.4 μg·m-3之间, 均超过了环境空气质量标准(GB 3095-2012)年均值二级标准(35 μg·m-3), 但细菌急性毒性和遗传毒性结果分别为低毒和阴性; 由表 2可以看出, 6个样品中最低浓度实验组(编号1)和中浓度实验组(编号2)的急性毒性结果为低毒, 而高浓度组(编号5、6)急性毒性结果却为无毒; 说明PM2.5浓度高低与其细菌毒性无明显或确定的相关性.也就是说, PM2.5浓度高低并不是决定PM2.5毒性的关键因素, 其毒性大小还是由PM2.5吸附的毒性成分及含量决定的.
(2) 由于采样点位于典型居民区, 受工业污染影响较小, PM2.5毒性成分含量相对较低, 这可能是造成上述“低毒或无毒”的原因.但这一发现同时也提示, 在非重污染天气条件下, 从细菌毒性角度看, 日常PM2.5暴露对居民健康的影响可能是有限的.
(3) 肺脏病理切片分析结果显示, 不同浓度梯度的颗粒物暴露, 对小鼠肺组织会造成不同程度的损伤, 并呈现浓度越高、损伤程度越明显的现象, 病理特征表现为肺部炎症和纤维化, 这一研究结果与笔者之前一项PM2.5直接暴露研究结论相吻合.
(4) 本研究中, 最明显差异通路为与核糖体(Ribosome)相关的通路.颗粒物暴露影响到核糖体蛋白功能的正常表达, 提示人们肺部炎症反应源于基因损害, 其造成的损害后果可能是不可逆的.另一条较显著差异的信号通路为PPAR, 分析其通路上具体基因, 发现颗粒物暴露影响到脂肪酸和胆固醇代谢, 可能是导致肺脏病变的原因. GO聚类分析发现免疫功能发生聚类富集, 细胞表面抗原的破坏、补体系统分子、细胞因子、血浆蛋白、核糖体蛋白及趋化因子等异常表达可能是造成肺部炎症的具体路径.
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