2018, Vol. 39
2. 中国科学院生态环境研究中心土壤环境研究室, 北京 100085
2. Department of Soil Environmental Science, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
德国科学家De Bary最早于1866年提出内生菌(endophyte)一词[1].内生菌不是生物分类学单位, 而是一个生态学概念.植物内生菌(endophyticbacteria)是指一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的微生物, 学术上对内生菌公认的概念是从经过表面消毒的植物组织器官或植物体内分离提取出来的对植物本身不表现或暂时不表现外在病症的细菌或真菌[1].植物内生菌的多样性和分布与土壤类型、组织类型、宿主基因型密切相关[2].大量报道表明, 许多作物中普遍存在内生菌, 在农作物和经济作物中发现的内生菌有54个属, 超过129种, 其中水稻内生菌有33属64种[1, 3].植物内生菌可以调节、促进宿主植物生长发育[4, 5], 减轻污染物对植物的毒性, 调节宿主植物对矿物质的吸收, 增强对重金属的耐性, 从而提高宿主植物对恶劣生长环境的适应性[6, 7]. Li等[8]的研究发现接种了内生真菌EF08-01的水稻不仅增强了对铅的耐性, 而且显著增加了根伸长和干物重; Idris等[9]的研究发现, 从镍超富集植物——遏蓝菜中分离的内生菌株与根际菌株相比, 其对镍的耐性更强.
水稻是人类的主要粮食作物之一, 东亚和东南亚以及大部分发展中国家都以稻米为主食, 中国也是水稻的主要生产和消费国之一.由于淹水的生长条件, 导致水稻比其他粮食作物更容易吸收富集重金属, 如砷, 镉等[10].砷在地壳中的含量占第20位, 是一种广泛分布的化学元素, 被世界卫生组织(WHO)和美国环保局(EPA)定级为一种“已知人类致癌物质”, 人体长期的暴露砷会导致皮肤癌和肝、肾等内脏器官的癌变[11].当前, 东南亚地区许多水稻生产区的土壤和灌溉水砷污染严重, 导致砷在水稻籽粒中积累, 并通过食物链的传递, 严重威胁人体健康.所以, 稻米砷污染问题已成为东南亚地区比较突出且急需解决的环境问题之一, 而解决这一问题的关键途径就是减少水稻对砷的吸收和控制水稻体内砷向籽粒的转移.
许多研究已经证明土壤微生物对土壤中砷的迁移转化有重要作用, 例如, Lomax等[12]报道水稻、番茄和红三叶草等植物都不具备砷甲基化的能力, 植物体内大量积累的甲基砷源于土壤微生物主导的无机砷甲基化过程; Huang等[13]从湖南石门的砷污染水稻土中筛选得到1株高效砷甲基化和砷挥发的细菌SM-1, 在10 μmol·L-1 As(Ⅲ)的培养基中生长12 h, 能将培养基中的无机砷全部转化为有机砷; 另外, Chen等[14]发现土壤中铁还原菌的丰度能显著影响土壤矿物质对砷的吸附解吸, 进而影响土壤中砷的生物有效性.由此可见, 土壤微生物对砷在土壤-植物系统中迁移转化的影响至关重要, 鉴于此, 土壤或水体砷污染的微生物修复技术得到了研究者的广泛关注.植物内生菌是一种极其丰富的新微生物资源, 但至今尚未有研究报道植物内生菌对砷污染的响应, 及其对砷迁移转化的影响.而水稻作为湿生禾本科作物, 是植物与内生菌相互作用的理想模式植物, 因此研究二者之间的作用关系、模式、机制, 对土壤砷污染的生物修复带来了活力与希望[15].
本研究通过分离、鉴定水稻幼苗期、分蘖期、开花期和成熟期不同组织的内生菌, 分析水稻内生菌群落结构的多样性, 揭示内生菌群落结构与水稻组织、生长时期的关系, 并通过评价这些菌株对砷的耐性, 发掘植物抗砷内生菌, 了解其对水稻体内砷形态转化及对水稻的危害, 以期为降低水稻籽粒砷污染风险提供实践指导.
1 材料与方法 1.1 水稻的培养实验所用水稻品种为甬优-538, 该品种为籼粳杂交稻(偏粳), 生育期约为150 d.选择均匀饱满的种子约100粒, 用30% H2O2溶液浸泡消毒15 min, 然后用自来水清洗干净, 再逐步用去离子水和超纯水各漂洗5次.消毒后的种子于28℃, 黑暗条件下催芽2 d, 精选露白种子于珍珠岩中培养7 d.然后挑选生长一致的幼苗移栽至PVC盆钵(5 L)中, 每盆装5 kg采于湖南祁阳的砷污染土(pH：6.41, 钾：15.59 mg·kg-1, 总磷：799.8 mg·kg-1, 总砷：108.86 mg·kg-1), 每盆种植4株幼苗, 设置4个重复.为保证植物的正常生长, 施肥包括：尿素(含N 46.6%)6.48 g、氯化钾(含K2O 62.9%)0.72g和过磷酸钙(含P2O5 14.0%)1.20 g, 磷钾肥作基肥一次性施用, 氮肥按:基肥:苗肥:分蘖肥:穗肥为30%:25%:20%:25%的比例施用.盆栽水稻于人工气候箱培养(光照度4000 lx, 光照时长12 h·d-1, 温度28℃/20℃, RH 80%), 水稻生长期的水分按常规进行管理.于2016年5~8月分别采集水稻幼苗期、分蘖期、开花期和成熟期的植株样品.
1.2 水稻内生菌的分离采用组织分离和涂布平板法提取内生菌：将水稻连根带土挖出, 先用自来水冲洗植株, 再用无菌水冲洗干净, 然后将水稻植株分为根、茎、叶和穗(仅成熟期)四部分, 并将样品切成小段, 用无菌滤纸吸干水分.称取水稻组织5 g于50 mL离心管中, 用20 mL 5% NaClO浸泡5 min, 用无菌水冲洗干净, 再用20mL 75%酒精浸泡5 min, 然后用无菌超纯水漂洗5次, 最后一次漂洗水涂布于LB(Luria-Bertani)培养基进行细菌培养, 若无细菌生长则证明水稻组织表面已完全消毒.将漂洗好的植物组织用无菌滤纸吸干水分, 移入无菌研钵, 并用无菌剪刀将组织剪碎, 加入10 mL无菌超纯水, 充分研磨10 min, 吸取100 μL研磨液直接涂布于LB培养基, 28℃培养48 h.待平板上长出菌落后, 挑取特征菌落进行分区划线纯培养, 重复3次.再从划线培养的平板上挑取单菌落接种于液体LB培养基, 振荡摇床的培养温度为28℃, 转速为150 r·min-1, 培养24 h.吸取0.5 mL菌液及等体积50%的灭菌甘油于冻存管中, 于-80℃保存.
1.3 抗砷的内生菌筛选首先将分离所得水稻内生菌种分别划线接种于含有1 mmol·L-1 As(Ⅲ)(NaAsO2)和10 mmol·L-1 As(Ⅴ)(Na3AsO4)的M9培养基, 30℃培养24 h, 观察平板上菌落的生长情况.以野生型大肠杆菌W3110作为对照.
将初筛中同时抗两种形态砷的菌株接种于LB培养基进行活化培养, 然后将菌液按10倍的浓度梯度稀释成10-1、10-2、10-3、10-4和10-5菌液, 吸取5 μL稀释菌液, 按菌液浓度从低到高的顺序分别滴涂于含有2 mmol·L-1 As(Ⅲ)和20 mmol·L-1 As(Ⅴ)的M9固体培养基, 28℃培养48 h, 同样以大肠杆菌W3110作为对照.同时将初筛所得菌株接种于含有2 mmol·L-1As(Ⅲ)和20 mmol·L-1 As(Ⅴ)的M9液体培养基, 30℃培养48 h, 然后测定菌液在波长为600 nm的吸光度(D600).
1.4 水稻内生菌的菌种鉴定将供试菌株活化后接种到LB液体培养基中, 于30℃振荡培养48 h, 待菌体生长至对数中后期, 离心收集菌体于2 mL离心管中.采用Bacterial DNA Kit(MP Biomedicals, 美国)试剂盒提取细菌DNA.具体提取步骤参考试剂盒说明书, DNA的浓度和质量(OD260/OD280)用NanoDrop (ND-1000, 美国)检测.以提取的内生菌DNA稀释5倍为模板扩增细菌16S rDNA, 正向引物为27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′), 反向引物为1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′). 50 μL的PCR反应体系包括：DNA模板(10 ng·μL-1)1 μL, 引物(10 pmol·μL-1)各1 μL, 2×Go TaqGreenMasterMix(Promega)25 μL, ddH2O 22 μL. PCR扩增程序为：95℃预变性3 min, 95℃变性30 s, 57℃复性30 s, 72℃延伸1.4 min, 共35个循环; 72℃延伸10 min.将PCR产物进行序列分析, 将测序得到的结果进行拼接.登录NCBI-BLAST进行序列比对, 确定其与已知序列的同源关系, 序列相似性达到98%以上的归为同一个种.
2 结果与分析 2.1 水稻各组织可培养内生菌的分离鉴定通过组织分离和涂布平板法, 从4个生长时期共16株水稻的不同组织中分离到126株内生菌.扩增这126个菌株的16S rDNA基因片段(1320~1445 bp), 并进行同源性比对分析, 结果表明, 126个菌株可归为13个属(图 1), 即：不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、气单胞菌属(Aeromonas sp.)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、微杆菌属(Microbacterium sp.)、假单胞菌属(Psoudomonas sp.)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus sp.)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、无色杆菌属(Achromobacter sp.).在得到的126个菌株中, 主要优势菌群为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、假单胞菌属(Psoudomonas sp.)和芽孢杆菌属(Bacillus sp.), 相对丰度分别为19.84%、15.87%和15.08%.
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图 1 水稻不同生长时期不同组织内生菌组成 Fig. 1 Community of endophytic bacteria in different rice tissues during four growing stages |
幼苗期水稻共分离出37个菌株, 归为8个属, 不动杆菌属(Acinetobacter sp.)和芽孢杆菌属(Bacillus sp.)同为主要优势菌, 相对丰度均为21.62%;分蘖期水稻共分离出25个菌株, 归为5个属, 假单胞菌属(Psoudomonas sp.)为主要优势菌, 相对丰度为36%;开花期水稻共分离出24个菌株, 归为8个属, 气单胞菌属(Aeromonas sp.)为主要优势菌, 相对丰度为20.83%;成熟期水稻共分离出30个菌株, 归为8个属, 不动杆菌属(Acinetobacter sp.)为主要优势菌, 相对丰度为35%.可见, 水稻在不同生长时期的内生菌群落结构显著不同, 其中苗期的内生菌多样性最高.
在水稻的4个生长时期中, 均发现赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus sp.).除分蘖期, 其他3个时期均含有特异性水稻内生细菌, 乳杆菌属(Lactobacillus sp.)仅分离于幼苗期水稻; 类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)仅分离于开花期水稻; 柠檬酸杆菌属(Citrobacter sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、无色杆菌属(Achromobacter sp.)仅分离于成熟期水稻.
2.2 水稻内生菌对砷的抗性结果将分离所得菌种分别接种于含有1 mmol·L-1As(Ⅲ)和10 mmol·L-1 As(Ⅴ)的M9培养基, 进行抗砷初步筛选.将初筛所得20个抗砷菌株AL6~DT6(A:幼苗期, B：分蘖期, C：开花期, D：成熟期; L：叶, S：茎, R：根, T：穗; 例如, AL即幼苗期在叶片分离到内生菌)在LB液体培养基中活化, 然后将菌液按10倍梯度依次稀释(10-1~10-5), 用2 mmol·L-1 As(Ⅲ)和20 mmol·L-1 As(Ⅴ)进行复筛, 通过观察菌斑的生长情况来进一步判断菌株对砷的耐性.
如图 2(a)~2(d)所示, 在2 mmol·L-1 As(Ⅲ)处理中, 对照E.coli随着菌液浓度降低, 菌落逐渐变薄, 菌落生长情况逐渐减弱, 当菌液稀释1万倍时, 无正常生长菌落.而其余20个菌株的1万倍稀释菌液的菌落均可以生长, 说明这些菌对As(Ⅲ)的抗性强于E. coli, 而在菌液稀释10万倍时, CR8、CS8、DR2和DL9不能形成菌落, 其余16株菌均能形成菌落, 说明其对2 mmol·L-1的As(Ⅲ)耐性较好.值得注意的是CS1菌的10万倍稀释菌液与原菌液的菌落生长情况无明显差异, 说明该菌株对As(Ⅲ)的耐性很好.
如图 2(e)~2(h)所示, 在20 mmol·L-1的As(Ⅴ)处理中, 对照组E. coli在稀释1000倍情况下, 尚可形成肉眼可见的圆形菌落, 但是菌落很薄, 颜色很浅; 继续稀释则无正常生长的菌斑.通过对比, 可以明显发现, BR8、BR9、CR1、CR2、CL2、CR8和CS8对As(Ⅴ)的耐性较弱, 弱于E. coli, 其中CR1的抗性最弱, 其余14株菌对As(Ⅴ)的耐性强于E. coli, 其中对As(Ⅲ)的耐性最好的CS1菌对As(Ⅴ)的耐性也最强.
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(a)~(d)：M9+2 mmol·L-1 As(Ⅲ)培养基; (e)~(h)：M9+20 mmol·L-1 As(Ⅴ)培养基 图 2 水稻内生菌对砷的抗性 Fig. 2 Arsenic resistance of endophytic bacteria from rice |
将初步筛选所得的20株抗生内生菌分别接种于2 mmol·L-1As(Ⅲ)和20 mmol·L-1As(Ⅴ)的M9液体培养基, 28℃, 150 r·min-1振荡培养48 h后测定菌液在波长为600 nm的吸光度.结果如图 3(a)所示, 在As(Ⅲ)处理条件下, 对照组E. coli的D600值约为1, CR8、CS8、DR2和DL9株菌与对照十分接近, 差异不显著; CS1、DL6、DR11株菌的D600值在1.5~2之间, 明显大于对照, 差异极显著(P < 0.01);其余13株菌的D600值在1.2~1.5之间, 差异显著(P < 0.05).在As(Ⅴ)处理条件下[图 3(b)], 对照组E. coli的D600值约为0.8, 其中BR8、BR9、CR1、CR2、CL2、CR8和CS8这7株菌的D600值均接近甚至小于对照, 而CS1、DR2和DR3的D600值明显大于对照, 差异极显著, 其余10株菌的生长在1~1.5之间, 差异显著.
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*表示菌液生长与对照存在差异显著(P < 0.05); **表示与对照存在差异极显著(P < 0.01) 图 3 抗砷内生菌对2 mmol·L-1 As(Ⅲ)或20 mmol·L-1 As(Ⅴ)的抗性 Fig. 3 Resistance of endophytic bacteria to 2 mmol·L-1 As(Ⅲ) or 20 mmol·L-1 As(Ⅴ) |
菌液稀释涂布结果与菌液的生长情况吻合, 综合分析可知：CS1与对照相比, 差异极显著(P < 0.01), 对2 mmol·L-1 As(Ⅲ)的抗性最强; DL6和DR11对2 mmol·L-1As(Ⅲ)的抗性较好; CS8、CR8、DR8、DL9和DS11对2 mmol·L-1 As(Ⅲ)的抗性与E. coli相当. CS1、DR2和DR3对20 mmol·L-1 As(Ⅴ)的抗性较好; BR8、BR9、CR1、CR2、CL2和CR8对20 mmol·L-1As(Ⅴ)较敏感.其中, CS1对2 mmol·L-1 As(Ⅲ)和20 mmol·L-1 As(Ⅴ)均有很好的抗性, 而CR8对20mmol·L-1As(Ⅴ)较敏感.
如表 1所示, 初筛所得的20株抗砷菌中, 共有7株为革兰氏阳性菌, 13株为革兰氏阴性菌.其中3株分离于幼苗期水稻, 2株分离于分蘖期水稻, 8株分离于开花期水稻, 7株分离于成熟期水稻. 20株菌中有4株分离于叶部组织, 5株分离于茎部组织, 10株分离于根部组织, 还有1株分离于稻穗组织.从数量上来看, 根部组织所分离的抗砷菌株最多; 开花期和成熟期的抗砷菌株明显大于幼苗期和分蘖期.菌株CS1对两种形态砷的抗性最强, 其分离于开花期的水稻茎部组织, 归属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.), 为革兰氏阴性菌.
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表 1 20株抗砷菌的抗砷特性及菌种鉴定1) Table 1 Arsenic resistance and identification of 20 rice endophytes |
3 讨论
在植物微生态环境中, 不同微生物之间及植物与微生物之间能协同作用, 形成微妙复杂的生态平衡[16].据李龚程等[1]报道水稻内生菌种类有33属64种, 这些内生菌最常见的菌属主要有肠杆菌属(Enterobacter sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)等.本研究采用传统的分离培养方法对生长于砷污染土壤中的水稻在4个不同生长期的不同组织内生细菌进行分离、纯化和16S rDNA鉴定, 并用不同浓度的As(Ⅲ)和As(Ⅴ)进行抗性分析.实验分离出126株水稻内生菌, 分归为13个属.其中, 水稻幼苗期、分蘖期、开花期和结实期的主要优势菌为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Psoudomonas sp.)和不动杆菌属(Acinetobacter sp.), 这与刘云霞等[17]、胡桂萍等[18]和王雪君等[19]报道的从水稻中分离到的内生细菌优势菌为芽孢杆菌属和假单胞菌属的结果基本一致.
水稻内生菌数量随着生长时期的变化规律是从幼苗期到分蘖期下降, 从开花期到成熟期上升.而王雪君等[19]发现从幼苗期到分蘖期上升, 开花期到结实期上升.黎起秦等[20]的研究发现, 广西水稻内生菌数量从苗期到分蘖期上升, 于孕穗期达到最高, 从灌浆期到乳熟期数量下降.前者与本研究的结果类似, 后者与本研究结果不完全一致, 这可能是由于水稻内生菌主要来源于土壤、空气、种子, 与水稻品种、栽培条件、生长气候等有着直接的关系.水稻内生细菌的数量随着组织部位的分布规律是根部最多, 茎部次之, 这与文献[17, 20]的研究结果类似.这可能是因为内生菌进入植物体内的途径和方式主要是从植物幼根和自然形成的伤口进入[21], 因此根部组织聚集的内生菌比其他器官组织多, 而茎是水稻中重量最大的组织器官, 因此在内生菌数量上也占一定优势.
本研究对分离所得的126株水稻内生菌进行抗砷筛选.环境中的砷有无机砷和有机砷两类, 砷的毒性与其存在形态密切相关, 且不同形态的砷毒性相差甚远.各类砷的毒性大小依次递减的顺序是:砷化氢、无机亚砷酸盐[As(Ⅲ)]、无机砷酸盐[As(Ⅴ)]、有机砷化合物、砷元素[11].本研究初筛实验中用1 mmol·L-1 As(Ⅲ)和10 mmol·L-1 As(Ⅴ)对126株水稻内生菌进行筛选, 并用野生型大肠杆菌W3110作为对照菌株.结果筛得20株抗砷菌; 复筛实验中用2 mmol·L-1 As(Ⅲ)和20 mmol·L-1 As(Ⅴ)对初筛所得抗砷菌株进行筛选, 进一步筛得对2mmol·L-1 As(Ⅲ)有较强抗性的16株菌, 对20mmol·L-1As(Ⅴ)有较强抗性的13株菌.其中, 从开花期水稻茎组织中分离所得的菌株CS1对两种形态砷的耐性明显强于其他菌株.通过16S rDNA鉴定为类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)(表 1).类芽孢杆菌属微生物在环境中广泛存在, Govarthanan等[22]从长柄菊的根部组织分离到的抗砷内生菌RM也属于类芽孢杆菌属, 对砷的最低抑制浓度(MIC)为400 mg·L-1, 经鉴定为类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.); 邓博環等[23]从河流沉积物中筛选得到芽孢杆菌属的1株细菌DX-04, 该菌株在培养96 h内可还原液相中39.6%的As(Ⅴ).本研究筛得的抗砷菌株CS1对As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的抗性都显著高于对照, 也高于其它菌株(图 1和图 2).因此, 在未来有必要深入研究菌株CS1的抗砷机制, 以及CS1对水稻体内砷迁移转化和水稻籽粒中砷积累的影响.
近年来, 内生菌在植物修复中的作用开始受到广泛关注.有研究表明, 侵染了某些种类内生细菌的植物抗胁迫环境和抗病原菌的能力明显强于未被侵染内生细菌的植物[24].随着生物技术和基因工程的发展, “内生菌-植物”关系已被广泛开发并应用于有机污染物和重金属污染土壤的微生物修复.例如, 使用自然或者工程内生菌对毒死蜱[25]、甲苯[26]、2, 4-二氯苯氧基乙酸[27]和一氯或二氯苯甲酸[28]污染土壤进行微生物修复.在重金属污染土壤的植物修复过程中, 内生菌通过独特的降解途径和新陈代谢将重金属固定于地下部, 减少了重金属向地上部的迁移转运[29]. Wang等[30]将锌富集植物东南景天中所提取的内生菌SaMR12和SaCS20接种到水稻上, 不仅提高了水稻的产量, 而且减少了水稻籽粒中锌的积累.水稻砷污染是我国南方当前的一个重要环境问题, 本研究筛选获得了抗砷的水稻内生菌, 未来需利用这些内生菌探索“内生菌-水稻”关系在解决稻米砷污染问题中的应用, 为稻米食品安全和砷污染土壤修复开辟新途径.
4 结论通过分离培养砷污染土壤栽培水稻根、茎、叶和穗在不同生长期的生细菌, 并利用16S rDNA系列对内生菌进行菌种鉴定, 结果表明分离得到的126株水稻内生菌归为13个属, 主要优势菌为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Psoudomonas sp.)和不动杆菌属(Acinetobacter sp.).对分离得到的内生菌进行不同浓度的As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的抗性分析, 发现16株菌对2 mmol·L-1 As(Ⅲ)有较强抗性, 13株菌对20 mmol·L-1 As(Ⅴ)有较强抗性.其中, 从开花期水稻茎组织中分离所得的菌株CS1对As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的抗性都显著强于其他菌株.
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