2018, Vol. 39
2. 中国地质科学院岩溶地质研究所, 国土资源部/广西岩溶动力学重点实验室, 桂林 541004;
3. 联合国教科文组织国际岩溶研究中心, 桂林 541004;
4. 桂林理工大学环境科学与工程学院, 桂林 541006
, LI Qiang2,3
, LIU Chang2,3 , JIN Zhen-jiang4 , LIANG Yue-ming2,3 , HUANG Bing-hui2,3,4 , LU Xiao-xuan1,2,3 , PENG Wen-jie2,3,4
2. Key Laboratory of Karst Dynamics, Ministry of Land and Resources & Guangxi, Institute of Karst Geology, Chinese Academy of Geological Sciences, Guilin 541004, China;
3. International Research Center on Karst under the Auspices of UNESCO, Guilin 541004, China;
4. College of Environmental Science and Engineering, Guilin University of Technology, Guilin 541006, China
土壤有机碳库是全球碳循环的重要组成部分, 其库容受气候、植被、土壤理化特性以及人类活动等诸多因素影响, 进而影响全球碳平衡[1].土壤微生物通过参与土壤中C、N、P、S等生物地球化学循环过程, 不但在维持土壤功能方面具有至关重要的作用, 而且还能敏感地反映土壤质量的变化[2].因此, 土壤微生物可以作为土壤碳循环的评价指标[3].
然而, 社会经济发展过程中产生的重金属污染造成土壤理化性质以及土壤微生物活性的改变[2].如李小林等[4]的结果发现铅锌矿区土壤微生物总数随土壤重金属污染程度而下降, 王秀丽等[5]发现浙江省富阳市环山乡铜锌冶炼厂附近的水稻田有效铜、锌、镉、铅与微生物生物量碳、微生物熵、微生物生物量显著负相关, 并且重金属污染还能降低微生物的数量, 李强等[6, 7]发现铅锌尾矿砂污染造成岩溶土壤微生物分泌的土壤酶活性降低.由于细菌、真菌和放线菌构成的土壤微生物对重金属敏感程度各不相同, 因此有研究指出：重金属污染能够明显降低细菌和放线菌的数量, 对真菌数量却没有影响[8], 并呈现出真菌/细菌数量比值上升的趋势[9], 这可能与真菌对重金属的耐受性超过了细菌和放线菌对重金属的耐受性有关.此外, 土壤真菌的碳利用效率高于细菌, 同化相同量的碳, 真菌对新生的稳定有机碳贡献高于细菌[10].因此, 研究重金属污染土壤微生物群落碳源代谢特征以及土壤真菌与土壤有机碳的交互关系对了解土壤有机碳的生物地球化学循环过程具有重要的意义.
此外, 以往关于重金属污染对土壤微生物多样性影响的研究, 多采用重金属添加模拟实验[11]或者重金属污染灌溉土壤[12]或者矿区或冶炼厂周围的土壤[5], 尽管可以反映重金属污染条件下土壤微生物多样性的变化, 但由于缺乏对不同耕作方式土壤微生物的系统了解而不清楚污染区土壤微生物群落发生变化的驱动机制[2].尾矿砂作为一种特殊的重金属污染形式, 尽管本研究团队对铅锌矿尾砂污染下的广西阳朔思的村土壤重金属与土壤理化性质、可培养微生物群落的关系进行了长期研究[6, 7, 13~15], 认识到土壤微生物群落的改变是影响土壤有机碳矿化过程的重要因素, 但由于以往的研究没有涉及到不可培养微生物, 而对微生物参与的土壤碳循环过程缺乏系统的了解.加之, 过去认为岩溶生态系统具有较高的土壤碳库主要由于钙离子与腐殖质中的胡敏酸结合/螯合成稳定且不易分解的腐殖质有关[16].为此, 本文选取岩溶区长期受铅锌尾矿砂污染的水稻田、柑橘园、玉米地以及对照(旱地)土壤, 利用碳素利用法(BIOLOG)及变性梯度凝胶电泳技术探讨重金属污染下不同耕作方式岩溶土壤微生物群落碳源代谢特征以及真菌与土壤有机碳的交互关系, 以期为揭示重金属污染下的岩溶土壤碳循环过程提供理论参考.
1 材料与方法 1.1 研究区概况与样品采集思的村坐落在广西阳朔县东北一狭长的峰林平原上(图 1), 周围地貌类型复杂, 平均海拔150 m, 年平均温度28.5℃, 年均降雨量1 000~2 000 mm.大约在20世纪70年代, 一次强降雨将思的村东北部15 km以外的一铅锌尾矿砂坝冲垮, 山洪裹挟着尾矿砂在河流转弯处将其倾泻到约0.5 km2的农田上[14, 15].由于该区地处岩溶区, 耕地资源紧缺, 人地关系紧张, 当地农民及时清理了淤积的河道, 并陆续将污染的农田平整, 种植水稻、玉米、柑桔等[14, 15].此外, 通过长期调查发现, 毗邻农田的河水铜含量为0.27~0.45 μg·L-1、铅含量为1.59~2.87 μg·L-1、锌含量为202~403 μg·L-1以及镉含量为3.02~6.42 μg·L-1, 符合生活饮用水卫生标准[17].为此, 在目前土地利用格局的基础上, 本研究团队于2016年7月采集了水稻田、柑橘园、玉米地等0~15 cm层的土壤, 其中水稻田样品10个、柑橘园样品12个、玉米地样品10个.由于该区土地资源有限, 为减少岩溶土壤空间异质性的影响, 实验还选择3个毗邻研究区并且没有受到铅锌尾矿砂直接污染的旱地作为对照.采集的土壤样品带回实验室后, 按照研究团队以往的方法对土壤样品处理、保存以供后续分析[14, 15].
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CK代表对照; Y代表玉米地; G代表柑橘园; S代表水稻田 图 1 思的村样品采集位置示意 Fig. 1 Map of the sampling sites in Sidi Village |
风干的土壤样品, 其土壤重金属全量采用硝酸-氢氟酸-盐酸微波消解-火焰原子吸收光谱法测定[18]; 土壤重金属有效态采用二乙烯三胺五乙酸(diethylene triamine pentacetate acid, DTPA)浸提-火焰原子吸收光谱法测定[19].
新鲜的土壤样品, 其土壤总有机碳含量(soil organic carbon, SOC)采用TOC仪测定法[20]; 土壤微生物生物量碳(microbial biomass carbon, MBC)采用氯仿熏蒸法测定[20].土壤微生物生物量碳计算公式为：
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式中, BC为微生物生物量碳质量分数, EC为薰蒸土样有机碳量与未薰蒸土样有机碳量之差, k(EC)为转换系数, 取值0.45.
1.2.2 碳素利用法BIOLOG-ECO技术是通过测定微生物对96孔中31种碳源底物(单糖/糖苷/聚和糖类7种, 氨基酸类6类, 脂类4类, 醇类3种, 胺类3种, 酸类8种)的分解情况来评估土壤微生物生理代谢特征.本研究取5.0 g新鲜土样, 置于95 mL 0.9% NaCl无菌溶液培养瓶中, 180 r·min-1振荡30 min.随后, 在超净工作台上用0.9% NaCl无菌溶液通过10倍稀释法将土壤悬浊液稀释至浓度为10-3, 并用8通道加样器将土壤悬浊液接种到BIOLOG-ECO板(Biolog Inc., 美国)孔上, 每孔添加150 μL.然后将BIOLOG-ECO板置于25℃下连续培养240 h.培养期间, 每隔12 h用BIOLOG Microstation光密度读数仪(Biolog Inc., 美国)在590 nm和750 nm处对BIOLOG-ECO板扫描计数[13].
基于以上计数结果, 可以获取土壤微生物群落整体代谢活性和功能多样性指数.
(1) 土壤微生物群落整体代谢活性用平均颜色变化率(average well color development, AWCD)表示, 并用来判断土壤微生物群落利用单一碳源能力. AWCD计算公式如下.
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式中, Ci为BIOLOG-ECO板各反应孔在590 nm和750 nm处所测光密度差值; R为BIOLOG-ECO板3个对照孔在750 nm和590 nm处所测光密度差值的平均值.通常Ci-R≥0, 如果Ci-R＜0, 按0计算.
(2) 土壤微生物群落功能多样性指数用群落丰富度指数(S)、Shannon多样性指数(H′)、Simpson优势度指数(D)、Shannon优势度指数(E)和McIntosh指数(U)[13]表示.计算公式如下.
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式中, Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R), S代表BIOLOG-ECO平板上微孔碳源代谢的数目(若AWCD＞0.2, 代表该孔碳源被完全利用)[20].
1.2.3 土壤微生物DNA提取按照MOBIO土壤强力DNA提取试剂盒(Powersoil DNA isolation kit, 美国)说明要求提取土壤微生物总DNA, 土壤微生物总DNA浓度和纯度用微量紫外分光光度计(Quawell5000, 美国)测定.
1.2.4 18S rRNA PCR-DGGE实验在参考本研究团队以往实验方法的基础上[21, 22], 18S rRNA PCR-DGGE实验的正向引物设计为：Fungi-GC(5′-CCG CCG CGC GGC GGG CGG GGC GGG GGC ACG GGG ATT CCC CGT TAC CCG TTG-3′), 反向引物为：NSI(5′-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′).实验采用25 μL扩体系, 即DNA模板(5 ng·μL-1)1 μL; TaqPCR Master Mix(生工生物工程(上海)股份有限公司) 12.5 μL, 去离子无菌水9.5 μL, 10 μmol·μL-1的正向引物和反向引物各1 μL; 扩增程序为：95℃预变性15 min, 95℃变性1 min, 56℃退火1 min, 72℃延伸1 min, 共35个循环, 然后在68℃完全延伸10 min. PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测, 检测条带清晰无拖尾表示扩增结果良好, 将PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳分析. 18S rRNA PCR扩增产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶, 变性剂浓度自下至上为15%~35%, 在60℃、100 V恒定电压下电泳9 h.电泳结束后用银染液染色.将染色后的凝胶用BIO-RAD公司Imange lab分析软件对条带进行分析.将DGGE图谱上不同土地利用类型间具有差异(不同迁移率的DGGE条带)的条带切胶回收, 用Fungi(5′-ATT CCC CGT TAC CCG TTG-3′)和NSI引物对按照上述方法进行PCR扩增, 扩增后的PCR产物与pEASY®-T3 Cloning Vector (北京全式金生物技术有限公司)连接, 并转化到大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α感受态细胞中, 筛选阳性克隆子送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定.测定的序列在NCBI数据库中进行比对.
1.3 数据处理用Microsoft Excel 2010对土壤微生物群落水平生理轮廓的测定结果进行作图分析; 用SPSS 19.0统计软件对所测定的数据进行单因素方差分析.
为消除指标之间的量纲影响, 以解决数据指标之间的可比性, 对35个土壤样品的重金属全量和有效态进行归一化处理.具体方法是：将单个样本的平行样品进行归一化, 计算公式为[23]：
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然后取每个样本平行样间的算数平均值, 即得到每个样本的归一化值.
为了解研究区土壤遭受的重金属污染风险状况, 本文采用地累积综合指数法(geo-accumulation index)评价.地积累指数由德国海德堡大学Muller于1969年提出, 后被广泛应用于现代沉积物、土壤、灰尘中重金属污染评价[24].计算公式为：
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式中, Igeo表示地积累指数, Cn为研究区重金属n在样品中的实测含量, Bn为重金属n的背景值; K为考虑到背景值波动而设定的常数, 一般取值1.5.根据Igeo数值的大小, 可以将土壤重金属污染程度分为7个等级(表 1).
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表 1 地积累指数与污染程度评价 Table 1 Geo-accumulation index and contamination grade assessment |
2 结果与分析 2.1 土壤重金属特征
通过表 2可以看出思的村不同类型样地Pb、Zn和Cu的全量及有效态呈现出水稻田＞玉米＞柑橘园＞对照的变化规律, 并且水稻田与对照组差异显著(P＜0.05).尽管柑橘园Cd全量最高, 但其有效态仍呈现出水稻田＞玉米＞柑橘园＞对照的变化规律.这是由于当地农民在平整污染土地时存在一定的空间异质性造成土壤铅锌尾矿砂分布不均[14].此外, 植物对土壤重金属的吸收富集能力取决于土壤重金属的有效态质量分数, 而不是总量[25, 26].为此, 对研究区Pb、Zn、Cu和Cd全量及有效态进行归一化处理后, 可以发现研究区重金属含量的总体变化趋势为：水稻田＞玉米地＞柑橘园＞对照(图 2).鉴于水稻田土壤存在湿干交替过程, 氧化还原电位会随之变化, 进而影响重金属的形态和生物有效性[25, 26], 造成水稻田重金属总体含量最高, 该研究结果与胡清菁等[15]的研究一致.
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表 2 思的村不同样地土壤重金属含量1)/mg·kg-1 Table 2 Soil heavy metals in different land use types in Sidi Village/mg·kg-1 |
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图 2 思的村不同样地重金属全量与有效态归一化结果 Fig. 2 CNV of total and bioavailable heavy metals in different land use types in Sidi Village |
利用地累积指数法, 以桂林市土壤背景值作为参比值(Pb、Zn、Cu、Cd背景值分别为36.9、127、34.8和0.191 mg·kg-1)[27], 本文对研究区土壤Pb、Zn、Cu和Cd等四项重金属进行潜在危害的风险评价(表 3).以平均全量来评价重金属污染风险, 研究区土壤Cd的Igeo系数均高于5, 属于严重污染; 玉米地和水稻田土壤Pb的Igeo系数均高于4, 属于重度污染; 柑橘园土壤Pb造成的重金属污染风险属于偏重度; Zn造成的重金属污染风险除水稻田属于偏重度外, 玉米地和柑橘园均遭受中等程度的污染; Cu只给土壤带来轻度以下的污染风险.以有效态来评价重金属污染风险, 发现除对照外, Cd给研究区土壤带来重度及其以上的污染风险; Zn和Cu没有给土壤带来污染风险; 而Pb造成了偏重度及重度的污染风险.此外, 由于桂林岩溶区蔬菜地土壤Cd背景值(1.193 mg·kg-1)及Igeo系数(2.06)较高[28], 通过系统评价可以看出对照样地的重金属污染可能来自于铅锌尾矿砂粉尘, 并且Cd造成的土壤环境污染风险最高, 是污染土壤修复的主要控制目标, 该结果与胡清菁[15]等的研究一致.
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表 3 思的村不同样地土壤重金属地积累指数 Table 3 Geo-accumulation index of soil heavy metals in different land use types in Sidi Village |
2.2 土壤微生物生物量特征
土壤微生物生物量通常是指土壤生态系统中体积小于5×103 μm3细菌、真菌等活物质总量, 代表参与土壤养分和能量循环、有机质分解和积累的微生物数量, 是表征微生物在土壤肥力演化中的重要指标[29].土壤微生物熵(MBC/SOC, SMQ)是指土壤微生物生物量碳与土壤总有机碳的比值, 土壤微生物熵受重金属污染影响会出现明显变化, 在一定程度上能指示土壤微生物对有机碳分解的程度.本研究对不同样地MBC、SOC和SMQ进行分析(表 4), 发现与对照相比, 柑橘园和玉米地SOC略下降, 差异不显著, 水稻田SOC质量分数最高, 并与其他样地差异显著(P＜0.05); MBC和SMQ变化趋势总体表现为对照＞柑橘园＞玉米地＞水稻田, 并且对照与其他样地差异显著(P＜0.05).这与长期重金属胁迫改变了土壤微生物群落生理活动和代谢能力, 以致于微生物需要消耗更多能量维持自身正常生理代谢, 导致有机碳向微生物量碳转化效率降低有关[30].
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表 4 思的村不同样地土壤总有机碳和微生物生物量碳 Table 4 SOC and MBC in different land use types in Sidi Village |
2.3 土壤微生物群落碳源代谢特征 2.3.1 土壤微生物AWCD及群落功能多样性
AWCD能够反映微生物群落碳源利用能力随时间变化的趋势[31].通过图 3可以看出, 供试样品AWCD值均表现为随培养时间延长而升高的趋势, 36 h内各样品AWCD值无明显变化, 36 h后对照组与其他样地的AWCD值区分开, 60 h后水稻田与柑橘园、玉米地的AWCD值区分开, 96 h后柑橘园与玉米地的AWCD值区分开, 180 h之后AWCD值趋于稳定, 并且AWCD值总体表现为对照>柑橘园>玉米地>水稻田.由于培养180 h后, 微生物碳源利用速率基本稳定, 为此选180 h处的AWCD值计算微生物群落功能多样性指数(表 5), 结果显示：McIntosh丰富度指数为对照＞柑橘园＞玉米地＞水稻田, 对照与水稻田差异显著(P＜0.05); Shannon多样性指数和Simpson优势度指数表现为柑橘园＞玉米地＞对照＞水稻田, 水稻田与其他样地差异显著(P＜0.05), 而旱地之间没有显著差异(P＞0.05); Shannon均匀度指数表现为玉米地＞对照＞柑橘园＞水稻田, 并且没有显著差异(P＜0.05).从而说明重金属污染不但影响微生物碳源利用能力, 而且还影响土壤微生物群落功能多样性.
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图 3 思的村不同样地平均颜色变化率 Fig. 3 Change in AWCD in different land use types in Sidi Village |
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表 5 思的村不同样地土壤微生物群落功能多样性指数 Table 5 Functional diversity of soil microbial community in different land use types in Sidi Village |
2.3.2 土壤微生物碳源底物利用速率
碳源是微生物的主要能源物质, 研究结果表明：研究区土壤微生物对酯类的利用效率最高, 糖类利用效率最低(图 4).微生物对糖类的利用效率总体表现为：柑橘园＞玉米地＞水稻田＞对照; 其他5类糖原的利用效率表现对照＞柑橘园＞玉米地＞水稻田(图 4).相关分析结果进一步显示(表 6)：对照土壤微生物糖类利用效率与全量Cd显著负相关(P＜0.05), 酸类利用效率与全量Zn显著负相关、与DTPA-Cu显著正相关(P＜0.05);柑橘园土壤微生物糖类利用效率与全量Cd显著正相关(P＜0.05);水稻田土壤微生物糖类利用效率与全量Zn、DTPA-Zn以及DTPA-Cd显著负相关(P＜0.05), 氨基酸类、胺类利用效率与全量Pb和Cu显著负相关(P＜0.05).从而说明, 土地利用类型不同, 重金属对土壤微生物碳源利用能力的影响不同.但总体结果表明, Cd是影响土壤微生物糖源利用效率的主要风险物, 并且糖源利用速率直接影响土壤有机碳质量分数.
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图 4 思的村不同样地土壤微生物对六类碳源的利用速率 Fig. 4 Utilization efficiency of six kinds of carbon sources by the microbial community in different land use types in Sidi Village |
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表 6 思的村不同样地重金属与六类碳源底物利用效率相关分析1) Table 6 Correlative analysis of heavy metal pollution and utilization efficiency of six kinds of carbon sources in different land use types in Sidi Village |
2.4 基于PCR-DGGE技术解析参与土壤碳循环的真菌
DGGE依据双链DNA片段熔解行为的不同, 可以分离为相同长度但碱基对序列不同的DNA标记片段.对图 5不同样地特异条带切胶后进行克隆转化测序, 并在NCBI中进行Blast比对, 得到与其相似度较高的序列, 共对比到23个有用序列(表 7), 克隆序列与已知序列相似度在93%~100%.在门水平上, 测试样品中共检出子囊菌门7个, 占总比例的31%;未培养真菌6个, 占总比例26%;真核生物6个, 占总比例26%;结合菌门2个, 占总比例8.7%;担子菌门2个, 占总比例8.7%.本研究表明子囊菌门是铅锌尾矿砂污染土壤的主要真菌群落, 并与杨金水等[32]利用高通量测序技术获取的铅锌矿区土壤真菌群落组成结果相一致.
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按照从左往右的泳道、自上而下的箭头依次标注为：1-1、2-1、2-2、2-3、2-4、3-1、3-2、3-3、3-4、5-1、5-2、5-3、6-1、7-1、7-2、7-3、8-1、8-2、10-2、12-1、13-1、14-1和14-3 图 5 18S rDNA基因的DGGE图谱 Fig. 5 DGGE profile of 18SrDNA fragments |
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表 7 DNA测序结果对照 Table 7 DNA sequencing results |
此外, 对照土壤中的3-4与Pycnoporus sp. ZW02.30同源性较高(99%), 属担子菌门多孔菌目白腐真菌.已有研究表明, 白腐真菌能够通过分泌多种降解酶参与木质素、纤维素和半纤维素的降解, 并对重金属有一定的吸附能力[33].玉米地和柑橘园土壤中检出的5-3和8-2与Fusarium solani和Fusarium oxysporum同源性较高(99%和100%), 属于子囊菌门镰刀属, 是一类土壤内生存的非致病性菌, 并能参与纤维素分解[34].柑橘园土壤中检出的7-2与Penicillium decumbens的同源性达100%, 是青霉属真菌中降解纤维素的重要菌种之一, 能够促进多种含钾矿物风化和钾溶出[35].而水稻田主要存在着未培养真菌.
3 讨论土壤有机碳作为陆地碳库的重要组成部分, 通过土壤植物残体的补充以及土壤微生物的分解实现动态变化[3], 并与植被、土壤理化特性、人类活动等因素有关.然而, 在过去, 企业为降低生产成本, 修建了大量的简易铅锌尾矿砂坝用于储存矿渣.一旦铅锌尾矿砂溃坝, 不但造成土壤污染, 通过食物链危害人体健康, 而且还将引起土壤理化性质以及土壤微生物活性的改变.已有研究表明：铅、锌、铜、镉共生的矿尾砂是一个污染复合体[14], 能够长时间连续释放重金属污染物进而对土壤理化特性产生影响.本研究表明, 水稻田遭受的重金属生态污染风险最为严重, 其次为玉米地, 最后为柑橘园.尽管C4植物(玉米)对土壤重金属的吸收和积累能力低于C3植物(柑橘、水稻)[36], 然而由于该区水稻田和玉米地土壤重金属含量高于柑橘园土壤, 因此研究区土壤在经过改良后适合种植柑橘.此外, 对照组由于受铅锌尾矿砂粉尘的影响, 有效态Cd高于桂林岩溶区蔬菜地土壤Cd的背景值.受铅锌尾矿砂影响, 水稻田、玉米地和柑橘园表层土壤有机碳含量分别为18.91、11.71和11.72 g·kg-1, 低于方芳等[37]关于桂林毛村基地水稻田21.14 g·kg-1、玉米地17.23 g·kg-1以及柑橘园17.42 g·kg-1的含量, 并且对照组表层土壤有机碳13.58 g·kg-1的含量高于靳振江等[38]关于桂林会仙基地旱地12.78 g·kg-1的结果.受岩溶区地质背景的特殊性、地形地貌的复杂性和生境的高度异质性影响, 研究区表层土壤有机碳与其他样地具有一定的差异.但研究结果总体表现为水稻田表层土壤有机碳高于旱地, 这是因为厌氧环境抑制微生物矿化速率以及好氧环境有利于微生物矿化速率[39].然而, 本研究水稻田、玉米地、柑橘园和对照的SMQ分别为0.79%、1.32%、1.41%和2.36%, 与陈志杰等[40]关于水稻田SMQ高(SMQ为2.58%)旱地SMQ低(SMQ为1.47%)的结果截然相反.一般来说水稻田由于长期处于干湿交替的人为管理环境, 能促进微生物生长, 有最大的SMQ.本研究关于水稻田MBC和SMQ值较低, 说明铅锌尾矿砂污染是造成水稻田土壤矿化率降低以及土壤碳释放速率变慢的关键因素[41].此外, 上述结果均表明铅锌尾矿砂污染引起土壤微生物发生变化的同时还将造成土壤碳释放速率的改变.
土壤微生物指标能敏感地反映土壤质量的变化, 因此BIOLOG可简单、快速地进行土壤微生物群落功能多样性和碳源代谢特性评价.本文研究结果表明, 水稻田的AWCD变化速率、McIntosh丰富度指数、Shannon多样性指数、Simpson优势度指数和Shannon均匀度指数最低, 并与其具有最小的MBC结果相吻合.由于土壤类型、理化性质和植物种类等均能影响土壤微生物群落代谢多样性, 因此, 本研究通过对比分析发现水稻田土壤中的铅锌尾矿砂通过抑制微生物生长, 造成水稻田土壤微生物群落结构简单, 功能单一.这一结果与李忠佩等[42]关于水稻田土壤微生物功能群落多样性指数高于旱地的结果相反.微生物对土壤重金属长期适应后, 污染状态下土壤微生物群落多样性高于未污染区[43], 因此, 研究区玉米地和柑橘园的Shannon多样性指数和优势度指数均高于对照.尽管玉米地和柑橘园具有较高的Shannon多样性指数和优势度指数, 但是其AWCD变化速率却低于对照.从而说明土壤微生物的丰富度在调节土壤碳释放速率方面的作用更为重要.显然, 这一结果这将影响人们对于污染区土壤微生物群落发生变化驱动机制的全面认识[44].
真菌作为土壤微生物的主要组成部分, 能够通过分泌多种酶降解土壤中的有机物.自然界中广泛存在的淀粉、纤维素、半纤维素、木质素等糖类必须通过微生物的分解才能参与土壤生物地球化学循环过程[44].已有研究表明：土壤中的真菌丰度与土壤木质纤维素降解酶显著相关[45].同时, 李强等[7]在该区调查时发现参与土壤有机碳循环的纤维素酶和蔗糖酶的活性指数在水稻田最低.本研究发现微生物对糖类的利用效率总体表现为：柑橘园>玉米地>水稻田>对照, 并与土壤重金属污染程度呈反比, 说明微生物通过影响土壤中淀粉、纤维素、半纤维素、木质素等糖类的代谢速率进而使不同样地的土壤有机碳具有差异性.由于Cd对白腐真菌具有较强的毒性, 因此对照组中检出的白腐真菌通过参与土壤木质素、纤维素和半纤维素的降解/分解过程[33], 进而使其表层土壤有机碳的含量与会仙基地旱地的结果基本一致.柑橘园和玉米地中镰刀菌属的Fusarium solani和Fusarium oxysporum以及青霉属的Penicillium decumbens是土壤中常见的纤维素分解菌[46], 因此纤维素在内切葡聚糖酶、外切纤维素酶和β-葡糖苷酶的协同作用下可转化成葡萄糖.尽管柑橘园和玉米地碳源代谢速率不一致, 但通过微生物之间的交互作用进而使其土壤表层有机碳含量分别为11.71 g·kg-1和11.72 g·kg-1, 进而说明岩溶生态系统土壤碳库的稳定性可能与钙离子-胡敏酸的结合/螯合作用无关[16].然而, 上述参与淀粉、纤维素、半纤维素、木质素等糖类降解过程的真菌没有在水稻田土壤检出.考虑到不同耕作方式对土壤微生物群落的影响也不相同, 但研究区水稻田较低的MBC和SMQ值加之没有检出的真菌说明土壤有机碳矿化过程与土壤微生物活性即微生物生物量无关, 而是与某些关键微生物的丰富度有关, 这一点通过研究区的McIntosh丰富度指数可以得到佐证.总而言之, 本研究表明Cd不但是研究区土壤的关键污染风险物, 而且还通过真菌群落的差异化表现影响土壤MBC、SMQ和碳源代谢速率, 改变土壤有机碳周转速率, 进而影响不同耕作方式的土壤有机碳碳库.然而真菌如何影响SMQ和土壤有机碳周转速率, 还需要利用稳定性同位素核酸探针技术(DNA-SIP)进一步验证.
4 结论(1) 受铅锌尾矿砂影响, 研究区不同类型样地的重金属复合污染程度及其遭受的生态风险表现为：水稻田>玉米地>柑橘园>对照, 同时研究区土壤的生态风险主要由Cd造成, 并成为土壤修复的主要控制目标.
(2) 研究区土壤微生物生物量碳、微生物熵和碳源代谢速率随着样地污染程度的加剧而降低, 而土壤有机碳质量分数除对照外, 表现出随样地污染程度的加剧而升高的趋势.水稻田土壤进而表现为土壤微生物生物量碳、微生物熵和碳源代谢速率较低的特征.
(3) 受土壤Cd影响, 土壤微生物糖源利用效率受到限制, 进而影响土壤有机碳矿化速率.
(4) 研究区对照组土壤存在担子菌门多孔菌目Pycnoporus sp. ZW02.30, 柑橘园和玉米地土壤存在镰刀菌属Fusarium solani和Fusarium oxysporum以及柑橘园土壤存在青霉属Penicillium decumbens.然而, 上述参与淀粉、纤维素、半纤维素、木质素等糖类降解过程的真菌没有在水稻田土壤检出.从而说明铅锌尾矿砂通过影响不同样地土壤微生物糖类代谢过程, 进而调节土壤碳在微生物作用下的矿化速率.
致谢: 感谢中国地质科学院岩溶地质研究所张强副研究员提供河水重金属测试结果.| [1] | Lal R. Restoring soil quality to mitigate soil degradation[J]. Sustainability, 2015, 7(5): 5875-5895. DOI:10.3390/su7055875 |
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