环境科学  2018, Vol. 39 Issue (5): 2412-2419   PDF    
引用本文
阎海涛, 殷全玉, 丁松爽, 任天宝, 许家来, 宗浩, 高强, 刘国顺. 生物炭对褐土理化特性及真菌群落结构的影响[J]. 环境科学, 2018, 39(5): 2412-2419.
YAN Hai-tao, YIN Quan-yu, DING Song-shuang, REN Tian-bao, XU Jia-lai, ZONG Hao, GAO Qiang, LIU Guo-shun. Effect of Biochar Amendment on Physicochemical Properties and Fungal Community Structures of Cinnamon Soil[J]. Environmental Science, 2018, 39(5): 2412-2419.
生物炭对褐土理化特性及真菌群落结构的影响
阎海涛1, 殷全玉1, 丁松爽1, 任天宝1, 许家来2, 宗浩3, 高强3, 刘国顺1     
1. 河南农业大学烟草学院, 河南省生物炭工程技术研究中心, 郑州 450002;
2. 山东省烟草研究院, 济南 250098;
3. 临沂市烟草公司, 临沂 276001
收稿日期: 2017-11-13; 修订日期: 2017-12-21
基金项目: 中国烟叶公司技改项目（3401302）；中国烟草总公司山东省公司重点项目（鲁烟科[2013]11号）；河南中烟工业有限责任公司项目（ZW2014005）
作者简介: 阎海涛(1984~), 男, 博士, 主要研究方向为烟草栽培生理生化与土壤微生态, E-mail:yht5657@163.com
通信作者: 刘国顺, E-mail:liugsh1851@163.com
摘要: 为了探讨生物炭施用对土壤理化及生物学特性的影响，在田间条件下研究了不同用量（0、10、20、40 t·hm-2）生物炭施用3a后植烟褐土真菌的群落结构特征，并分析了其与土壤环境因子的关系.结果表明，土壤添加生物炭3 a后显著提高了土壤pH、含水率、总有机碳（TOC）和总氮（TN）含量，而降低了土壤容重和溶解性有机碳（DOC）含量.Illumina MiSeq测序结果表明，生物炭的添加对土壤真菌α多样性影响不大，但能显著改变真菌群落结构.物种注释结果表明，所有样本中真菌优势菌群均为子囊菌门（Ascomycota）、接合菌门（Zygomycota）和担子菌门（Basidiomycota），其相对丰度之和占所有可注释真菌丰度的90%以上.生物炭提高了子囊菌门和担子菌门的相对丰度，降低了接合菌门的相对丰度.在属水平上，生物炭增加了链格孢属（Alternaria）、锥盖伞属（Conocybe）和曲霉属（Aspergillus）真菌的相对丰度，降低了放射毛霉（Actinomucor）和赤霉菌（Gibberella）的相对丰度.冗余分析（RDA）及Mantel检验结果说明，土壤DOC、pH和含水率是影响褐土真菌群落结构的主要环境因子.综上，生物炭施用3 a后对土壤理化特性有显著的影响，这些环境因子的改变驱动了土壤真菌群落的生态演替.
关键词: 生物炭      褐土      理化特性      真菌群落结构      Illumina MiSeq测序技术     
Effect of Biochar Amendment on Physicochemical Properties and Fungal Community Structures of Cinnamon Soil
YAN Hai-tao1 , YIN Quan-yu1 , DING Song-shuang1 , REN Tian-bao1 , XU Jia-lai2 , ZONG Hao3 , GAO Qiang3 , LIU Guo-shun1     
1. Biochar Engineering Technology Research Center of Henan Province, College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;
2. Tobacco Research Institute of Shandong, Ji'nan 250098, China;
3. Linyi Tobacco Monopoly Administration, Linyi 276001, China
Abstract: To identify the effect of biochar addition on soil abiotic and biotic properties and provide evidence for the soil improvement with biochar input, the soil physiochemical properties and fungal community were investigated in a cinnamon soil after 3-year biochar additions of 10, 20, and 40 t·hm-2. The relationship between the fungal community and edaphic physicochemical characteristics was also analyzed. The results showed that soil pH, moisture, total nitrogen (TN), and total organic carbon (TOC) significantly increased but dissolved organic carbon (DOC) content and soil bulk density decreased with biochar addition. High-throughput sequencing results indicated that biochar amendment had little influence on fungal α diversity but significantly changed the fungal community structure. The taxonomic classification showed that the dominant fungal phyla were Ascomycota, Zygomycota, and Basidiomycota, and these phyla accounted for more than 90% of the total sequences. The relative abundance of Ascomycota and Basidiomycota increased, while the abundance of Zygomycota decreased with biochar addition. At the genus level, biochar addition increased the relative abundances of Alternaria, Conocybe, and Aspergillus but decreased the relative abundances of Actinomucor and Gibberella. Redundancy analysis (RDA) showed that soil DOC, pH, and moisture were key environmental factors leading to the shift in the soil fungal community composition. In summary, the application of biochar changed the soil physicochemical properties, which drove the ecological succession of soil fungal communities.
Key words: biochar      cinnamon soil      physicochemical properties      fungal community structure      Illumina MiSeq sequencing technology     

生物炭是由生物质在缺氧或无氧条件下高温裂解产生的固态物质[1].由于生物炭富含芳香态碳, 抗生物降解能力强, 在土壤中能存在几百至上千年[2], 因此, 将生物质转变为生物炭已成为促进全球碳固定和减缓温室气体排放的重要策略[3].此外, 研究发现土壤中添加生物质炭可以改善土壤质量, 如降低土壤容重增加通气性, 提高酸化土壤pH, 增加土壤有机碳、水分和养分含量, 增加土壤阳离子交换量和团聚体数量, 吸附土壤污染物等[4~7].

土壤微生物在土壤养分循环、有机碳的矿化-固定过程中起着关键作用[8].生物炭由于其特殊的理化特性在调控土壤微生物群落结构和多样性方面发挥着重要作用[9, 10]. Yao等[11]的研究发现黑土添加生物炭后, 显著增加了久浩酵母菌属(Guehomyces)的相对丰度, 降低了镰刀菌属(Fusarium)真菌的相对丰度. Zheng等[12]的研究发现生物炭显著提高了水稻土中接合菌门(Zygomycota)和被孢霉属(Mortierella)真菌的相对丰度, 降低了青霉菌属(Penicillium)和Cyphellophora真菌的相对丰度.此外, 生物炭可以影响菌根真菌在作物根系的定殖, Matsubara等[13]发现土壤添加椰壳炭提高了芦笋根部菌根菌的丰度.

有研究表明, 生物炭的活性炭组分可在施用初期降解, 为微生物提供碳源进而促进微生物的生长[14, 15], Kuzyakov等的研究发现[16], 生物炭施用20个月后, 土壤微生物中来源于生物炭的碳降低了42.31%.随着时间的推移, 生物炭会在生物和非生物作用下逐渐老化, 其理化特性会有所不同, 其与土壤颗粒的长期作用会建立新的土壤-生物炭体系[17, 18].然而, 目前关于生物炭长期施用后对土壤微生物的影响尚不明确.

褐土是我国华北平原最重要的农业栽培土壤之一, 但由于多分布于丘陵山地, 土壤侵蚀现象严重, 有机质含量偏低, 保肥保水性能较差[19], 加上近年来掠夺式种植方式造成土壤结构变差, 生物学活性降低[20], 褐土土质改良十分必要.生物炭已被广泛应用于各种类型土壤的改良修复中[21~23], 然而针对生物炭对褐土理化及生物学特性影响的研究鲜见报道.本研究以山东沂水县典型植烟褐土为研究对象, 测定了田间条件下, 生物炭施用3 a后对褐土土壤理化特性及真菌群落结构的影响, 并分析了土壤理化特性的改变与土壤真菌群落演替的关系, 以期为生物炭在改良褐土生物学特性方面提供理论依据.

1 材料与方法 1.1 试验材料

本试验于2013~2015年在山东省临沂市沂水县烟草试验站(E118°63′, N35°86′)进行.试验地海拔191 m, 年平均气温14.1℃, 降雨量为749 mm.土壤类型为褐土, 基础理化特性为：有机质13.47 g·kg-1, 碱解氮57.82 mg·kg-1, 速效磷23.59 mg·kg-1, 速效钾160.36 mg·kg-1, pH 6.95.生物炭为小麦秸秆在400~500℃条件下低氧、连续炭化30 min制得, 其基本理化性质为：比表面积16.71 m2·g-1, 容重0.21 g·cm-3, pH 9.15, 全碳524.10 g·kg-1、全氮2.30 g·kg-1.烤烟品种为NC102.

1.2 试验设计

试验采用随机区组设计, 共设4个处理：施用化肥(CK); 化肥+10 t·hm-2生物炭(B10);化肥+20 t·hm-2生物炭(B20);化肥+40 t·hm-2生物炭(B40).每个试验小区化肥氮素用量82.50 kg·hm-2, 氮、磷、钾施用比例为1：1.02：2.77.生物炭于2013年4月1日一次性撒施入土壤中, 并与20 cm耕作层土壤搅拌均匀, 化肥于每年烤烟移栽前一周条施, 试验持续3年.每个处理3次重复, 小区面积50.00 m2, 试验地四周设保护行.烤烟于每年5月1日移栽.

1.3 土样采集及理化特性测定

于2015年烤烟旺长期, 在每个试验小区采用5点取样法[24]采集土壤样品.新鲜土样过2 mm筛除去作物残体和石块后分为三部分, 一部分带回室内直接测定土壤含水率; 一部分装入无菌离心管后迅速放入液氮中, 用于土壤总DNA的提取和后续的生物信息学分析; 另一部分在室内自然风干后, 用于土壤其它理化特性指标的测定.

土壤酸碱度、容重、含水率和速效养分参照常规方法进行测定[25], 土壤总有机碳采用TOC分析仪(Vario TOC, Elementar, 德国)测定; 总氮采用CNS元素分析仪(Vario MAX CN, Elementar, 德国)测定; 溶解性有机碳采用K2SO4提取法测定[26].

1.4 土壤真菌群落结构的测定 1.4.1 土壤总DNA提取及PCR扩增

利用E.Z.N.A. Soil DNA Kit(OMEGA)试剂盒提取土壤样品的基因组DNA(Promega, Madison, WI, USA), 用Qubit 2.0 DNA试剂盒检验提取的DNA的完整性与浓度, 检测合格后, 采用ITS3和ITS4引物对真菌总DNA的ITS2区进行扩增[27].

1.4.2 建库测序及序列处理

PCR扩增产物纯化后, 根据DNA浓度, 将所有样品按照1：1的比例进行混合, 利用生工生物工程(上海)股份有限公司Illumina(MiSeq PE300)测序平台, 构建小片段文库进行Paired-end测序, 并对原始下机序列进行质控.将质控后的序列按照相似度97%的阈值, 采用USEARCH (version 7.1)软件将所有序列进行操作单元(OTU)的划分与聚类, 在每组OTU中选择丰度最高的序列作为该OTU的代表序列.所有代表序列采用RDP Classifier分别从门和属水平上进行物种注释(分类阈值＞0.8)[28].

1.5 数据处理及分析

采用Mothur软件分别计算样本Shannon指数、Chao1指数及测序覆盖度[29].土壤样本理化指标, 真菌群落α多样性及不同分类水平上物种相对丰度的差异采用SPSS软件Duncan's多度检测进行单因素方差分析(P＜0.05).采用SPSS软件分析环境因子与菌群相对丰度的Pearson相关系数.样本间群落组成差异采用非度量多维尺度排序分析(NMDS).环境因子对样本间细菌群落结构差异的影响采用冗余排序分析(RDA). NMDS和RDA的可视化采用R软件(version 3.3.1)的“vegan”包绘图.

2 结果与分析 2.1 生物炭对土壤理化特性的影响

由表 1可知, 与对照相比, 生物炭的施用显著提高了土壤pH, 土壤TOC和TN含量随着生物炭添加量的增加而提高.土壤DOC含量随生物炭的添加而显著降低.此外, 添加生物炭处理的土壤含水率显著高于对照, 而土壤容重则显著低于对照.与对照相比, 生物炭的施用显著提高了土壤速效钾(AK)含量, 但对土壤速效磷(AP)影响不大.

表 1 生物炭对土壤理化特性的影响 Table 1 Effects of biochar addition on soil physical and chemical properties

2.2 样本测序结果及真菌α多样性

所有样本共获得了395 929条有效序列, 单样本平均序列数为32 994条.依据97%序列相似性对所有序列进行聚类后, 样本平均OTU数为1 219, B10和B20处理OTU数显著高于对照. Shannon指数、ACE指数和Chao1指数用来评价真菌群落α多样性指数.除了B10处理Shannon指数和B20处理Chao1指数显著高于对照外, 各多样性指数在不同处理间差异不大.所有样品的测序覆盖度均达到98.30%以上, 说明测序达到了一定的深度, 能够满足后续分析(表 2).

表 2 基于ITS区的真菌群落测序数据和α多样性 Table 2 Sequencing data and α diversity of the fungal community based on ITS region

2.3 生物炭对土壤真菌群落结构的影响 2.3.1 生物炭对土壤真菌门水平上物种相对丰度的影响

物种注释结果表明, 所有样本中门水平上真菌菌群归为6个门类：子囊菌门(Ascomycota)、接合菌门(Zygomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)和微孢子门(Microsporidia).其中优势菌为子囊菌门、接合菌门和担子菌门真菌, 其相对丰度之和占所有可注释菌的90%以上(图 1).各菌群在所有可注释菌中平均占比分别为65.18%、18.07%、13.36%、2.83%、0.55%和0.003%.

图 1 所有样本中真菌门水平上的物种相对丰度 Fig. 1 Relative abundances of the fungal phylum of all soil samples

生物炭对土壤不同门真菌丰度的影响不同.与对照相比, 生物炭显著提高了土壤子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)真菌的相对丰度, B10处理子囊菌门相对丰度最大, 担子菌门则在B40处理相对丰度最大.生物炭显著降低了接合菌门(Zygomycota)的相对丰度.壶菌门(Chytridiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)和微孢子门(Microsporidia)真菌的相对丰度在不同处理中差异不大(图 2).

图 2 不同处理组门水平上优势真菌相对丰度 Fig. 2 Relative abundances of the dominant fungal phylum for all treatments

2.3.2 生物炭对土壤真菌属水平上物种相对丰度的影响

真菌属水平上物种注释结果显示, 链格孢属(Alternaria)真菌的相对丰度最高, 在不同处理中平均占比为27.20%~46.77% (表 3).在所有优势属(相对丰度大于1%)中, 生物炭的施用显著提高了链格孢属、锥盖伞属(Conocybe)和曲霉属(Aspergillus)的相对丰度, 降低了放射毛霉(Actinomucor)和赤霉属(Gibberella)的相对丰度.此外, 黑蛋巢菌属(Cyathus)的相对丰度在生物炭添加量为40 t·hm-2时显著增加.不同处理土壤中镰刀菌属(Fusarium)、短梗蠕孢属(Trichocladium)、毛壳属(Chaetomium)、Spizellomyces、斑褶菇属(Panaeolus)和Fusicolla相对丰度差异不大.

表 3 不同处理组属水平上优势真菌相对丰度/% Table 3 Relative abundances of the dominant fungal genus for all treatments/%

2.3.3 真菌群落相似性排序分析

基于OTU丰度的NMDS分析结果如图 3所示, 不同处理组的3个子样本点相对距离较近, 并与其它组相分离.同时, 施用生物炭的处理和不施用生物炭的处理样本点在NMDS1轴上有较明显的分离; 此外, B10、B20和B40处理各样本点在NMDS2轴上随着生物炭用量的增加依次排开.以上结果说明生物炭对褐土真菌群落结构有明显的影响.

图 3 土壤真菌群落结构非度量多维尺度分析(NMDS) Fig. 3 Non-metric multidimensional scaling (NMDS) plot of soil fungal communities for different treatments

2.3.4 真菌群落结构与土壤环境因子的相关性

采用RDA分析来评估土壤环境因子对真菌群落结构变化的影响.结果表明, RDA1轴和RDA2轴对真菌群落结构差异的解释度分别为51.95%和19.66%.与NMDS分析结果类似, 图中每个处理的样本点相对聚在一起, 与其它样本点有一定距离.施用生物炭的B10、B20和B40处理样本点与对照在RDA1轴方向上被明显地分离开(图 4).此外, 针对土壤真菌区系结构和土壤理化指标的Mantel检验结果表明, 土壤真菌群落结构与土壤环境因子密切相关, 其中土壤DOC(r=0.655 7, P=0.001)、pH(r=0.621 8, P=0.002)和土壤含水率(r=0.542 0, P=0.001)对真菌群落结构影响最大(表 4).

图 4 土壤真菌群落结构与环境因子的冗余分析(RDA) Fig. 4 Redundancy analysis (RDA) of fungal community changes with soil parameters (B)

表 4 真菌群落组成与土壤环境因子之间相关性的Mantel检验 Table 4 Mantel test results for the correlation between fungal community structures and soil parameters

相关分析结果表明, 链格孢属(Alternaria)与AP显著正相关.放射毛霉(Actinomucor)与pH、含水率及AK显著负相关, 与DOC显著正相关.镰刀菌属(Fusarium)与AP极显著负相关.黑蛋巢菌属(Cyathus)、曲霉属(Aspergillus)与除AP外的所有指标呈显著或极显著相关关系.白环蘑属(Leucoagaricus)与TOC和TN显著正相关.赤霉菌属(Gibberella)与pH、含水率、AP及AK呈显著负相关关系, 与DOC显著正相关(表 5).

表 5 真菌优势属相对丰度与土壤理化指标的相关性1) Table 5 Correlations between relative abundance of dominant genus and soil parameters

3 讨论 3.1 生物炭对土壤真菌多样性的影响

土壤微生物多样性变化是生物炭改良土壤研究中重要的关注点之一.本研究结果显示, 生物炭添加到土壤中3 a后对土壤真菌多样性影响不大, 这与Lucheta等[30]对亚马逊黑土(富含生物炭)的研究结果一致, Yao等[11]在中国东北黑土开展的3 a定位试验也发现生物炭对真菌多样性无显著影响. Hu等的研究发现[31], 在红壤土中添加生物炭后短期内降低了真菌多样性.然而, 目前生物炭对土壤真菌多样性影响的相关研究较少, 其施入土壤中不同时间对真菌影响的机制尚不明确, 还需要进行更多相关试验探讨生物炭对土壤真菌多样性影响的短期和长期效应.

此外, Liu等[32]调研了黑土土壤真菌结构特征并分析了其与土壤理化特性的关系, 结果发现, 土壤TC是影响真菌多样性的主要因子.本研究中, 与对照相比, 土壤TC含量随着生物炭的施用显著提高, 然而土壤真菌群落多样性没有显著变化.产生这种不一致结果的原因可能是TC可为微生物提供碳源, 然而生物炭中惰性碳占比较大[2], 并且随着生物炭施入土壤时间的延长, 可矿化碳逐步降解, 微生物难分解碳比例进一步提高[33], 土壤TC的提高很大程度来自惰性碳的贡献, 因此对微生物影响不大.

3.2 生物炭对土壤真菌群落结构的影响

本研究中, NMDS排序分析图的轴1将添加生物炭的处理和未添加生物炭的处理明显地分隔为两部分, 说明生物炭对土壤真菌群落结构有明显的影响, 这与前人的研究结果一致[1, 34].分析土壤环境因子与真菌群落结构演替的关系有助于更全面地了解真菌群落更替的影响因素. Zheng等[12]以我国南方水稻土为研究对象, 分析了生物炭施用4a后土壤真菌群落变化, 结果发现, 土壤pH、TOC和C/N对土壤真菌群落变化的贡献最大. Yao等[11]的研究发现, 中国东北黑土中土壤AP、TC和AK与真菌群落结构密切相关. Dai等[35]通过mantel检验发现, 酸化土壤中TOC和交换态钾是土壤真菌群落结构的决定因子.本研究发现土壤DOC、pH和土壤含水率与真菌群落结构的改变影响最大.相似的是, 这些研究中土壤理化特性均与生物炭添加显著相关, 本研究中添加生物炭的处理在NMDS轴2方向上按生物炭用量顺次排开, 说明生物炭不同添加量对土壤真菌群落结构的影响效果不同.因此, 生物炭可能通过改变土壤理化特性从而驱动了真菌群落结构的生态演替.

此外, 真菌是惰性碳的主要分解者, 在高C/N有机物料降解中起重要作用[36].本研究发现, 真菌优势属黑蛋巢菌属(Cyathus)和曲霉属(Aspergillus)的相对丰度与土壤TOC和C/N均为极显著相关关系, 说明黑蛋巢菌属和曲霉属真菌可能在生物炭及土壤有机质的降解中发挥了一定作用.真菌生长繁殖速度较快, 其群落结构的改变可能会对土壤环境产生一系列的影响[37], 因此, 进一步研究生物炭施用条件下真菌群落演替的机制非常必要.

3.3 生物炭对部分土壤真菌相对丰度的影响

本研究中真菌优势菌群为子囊菌门(Ascomycota)、接合菌门(Zygomycota)和担子菌门(Basidiomycota), 这和以往关于农田土壤真菌群落的分析结果相似[38, 39].与对照相比, 生物炭的添加显著降低了土壤接合菌门和担子菌门的相对丰度, 提高了子囊菌门的相对丰度, 说明褐土中优势真菌对生物炭添加较为敏感.此外, 有研究表明氮肥施用可以提高土壤子囊菌门的相对丰度[40], 尽管本研究中施用生物炭的处理没有比对照多施用氮肥, 但子囊菌门真菌相对丰度显著提高, 可能是因为生物炭对肥料氮素的吸附间接增加了土壤氮素含量[41], 从而提高了土壤中子囊菌门的相对丰度.然而Yao等[11]分析了东北黑土添加生物炭对土壤真菌的影响发现, 生物炭对土壤门水平真菌相对丰度的影响较小, 这可能和土壤类型及生物炭原料特性等不同有关.本研究还发现土壤添加生物炭改变了部分优势属如链格孢属(Alternaria)、锥盖伞属(Conocybe)、放射毛霉(Actinomucor)的相对丰度, 这些属的真菌丰度的改变可能对土壤生态功能有一定的影响.此外, 本研究发现生物炭对部分土壤真菌相对丰度的影响并未随生物炭用量的增加而加强, 说明生物炭影响真菌群落的生态过程较为复杂, 还需更进一步研究.

4 结论

(1) 秸秆生物炭添加到褐土中3 a后对土壤真菌群落结构有明显的影响, 但对真菌α多样性影响不大.

(2) 生物炭显著改变了(提高或降低)褐土部分真菌相对丰度, 这种改变在真菌门和属分类水平上均有体现.

(3) 生物炭添加3 a后显著改变了褐土的pH、含水率、容重、TOC、TN、DOC等理化特性, 这些环境因子的变化进一步影响了土壤真菌群落结构, 其中土壤DOC、pH和含水率是主要影响因子.

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