2018, Vol. 39
2. 长江师范学院武陵山绿色发展协同创新中心, 重庆 408100;
3. 重庆市农业科学院, 重庆 401329;
4. 重庆师范大学生命科学学院, 重庆 401331;
5. 西南大学资源环境学院, 重庆 400715
, ZHANG Hui3 , MA Lian-jie3 , LIAO Dun-xiu3
, YANG Xing-yong4 , WANG Long-chang5 , WANG Ding-yong5
2. Collaborative Innovation Center for Green Development in Wuling Mountain Areas, Yangtze Normal University, Chongqing 408100, China;
3. Chongqing Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 401329, China;
4. School of Life Science, Chongqing Normal University, Chongqing 401331, China;
5. College of Resources and Environment, Southwest University, Chongqing 400715, China
土壤微生物在生态系统中扮演重要的角色, 许多重要的生态学过程都受其影响, 这些过程包括土壤的形成及结构、有机物质的分解与转换、养分的循环与利用、作物的生长与病害、土壤环境及温室气体的排放[1~3].此外, 土壤微生物物种多样性与土壤肥力和生产力密切相关[4].有关土壤微生物功能多样性的信息对于阐明微生物群落在不同环境中的作用至关重要[2, 4].
近年来, 随着国家户用沼气的普及和大型养殖企业沼气工程的建设, 应用沼液灌溉稻田替代部分化肥, 已经成为农村废弃物资源化的一条重要途径[5, 6].沼液是沼气发酵后的残留液体.其速效营养能力强, 养分利用率高, 能迅速被作物吸收利用[7, 8], 不但能提高作物的产量和品质, 而且具有防病抗逆作用, 是一种优质的有机液体肥料[9].利用沼液灌溉稻田能满足水稻生长对水分以及大量养分元素的需求, 也能够净化稻田水体环境, 实现沼液的后续无害化处理及资源化利用[10].
稻田土壤中微生物的代谢活动对于调节土壤营养物质的循环, 维持稻田土壤肥力, 促进水稻的养分吸收具有重要意义[11].冯伟等[12]发现沼液还田可以提高小麦根际土壤微生物数量和酶活性.郑学博等[13]通过沼液还田定位实验研究发现沼液还田显著影响旱地红壤微生物群落的代谢活性和多样性, 沼液与化肥配施能够增强微生物群落代谢活性, 提高土壤质量.钟珍梅等[14]研究了不同梯度沼液浇灌量对狼尾草地土壤微生物的影响, 发现沼液浇灌能显著提高土壤微生物生物量N和C, 且沼液浇灌量与微生物量N和C的增量显著相关.
沼液进入稻田后导致稻田水体有机质增加, 致使很多水体理化参数发生变化, 包括水中溶解氧下降、沉积物中有机质和硫酸盐、硫化氢的增加、pH值的下降、生物和微生物群落的破坏等[15].目前, 关于沼液灌溉对稻田土壤微生物群落多样性影响的研究却鲜见报道.
土壤微生物的研究很大程度上依赖于方法和技术的进步.高通量测序技术能够较为全面和准确地反映土壤微生物群落结构, 且能够在整体微生物群落水平分析物种遗传多样性, 在微生物群落多样性的表征方面优势明显[16].
因此, 本文采用高通量测序技术(Illumina)研究不同沼灌年限稻田耕层土壤(0~20 cm)微生物群落多样性变化, 探讨稻田耕层土壤微生物群落多样性对不同沼灌年限的响应, 以期为沼液的资源化利用及稻田污染物消纳的可持续性提供理论依据和科学指导.
1 材料与方法 1.1 采样点基本情况采样点位于重庆市长寿区某奶牛养殖场粪污处理沼气工程周边的稻田(N30.07°, E107.15°).该区域稻田属于冬水田.每年只种一季水稻, 冬季为稻田蓄水期.该区域属亚热带湿润季风气候, 四季分明, 冬暖春早, 初夏多雨, 盛夏炎热常伏旱, 秋多连绵阴雨, 无霜期长, 温差大, 多雾少日照.常年平均气温17.68℃, 常年降水量1 162.70 mm.
采样点栽种水稻品种为西农优1号, 该品种属籼型三系杂交水稻, 全生育期152.30 d, 每亩有效穗数17.60万, 株高112.40 cm, 穗长25.50 cm, 平均亩产527.34 kg.该区域水稻育苗期为3月中旬, 插秧时间为4月中上旬, 收获期在8月中旬.当地常规稻田施肥方式为氮肥(N)用量150 kg·hm-2; 磷肥(P2O5)60 kg·hm-2; 钾肥(K2O)约60 kg·hm-2.
沼液在稻田冬闲期一次性灌入, 每亩灌入量约为20 t.由于对沼液稻田消纳的推广是一个逐渐推进的过程, 因而在养殖场周边形成了不同沼灌年限的稻田.
1.2 土壤、沼液、水稻样品的采集与制备于2016年6月系统采集了不同沼灌年限的稻田土壤, 每个沼灌年限通过棋盘式布点法采集0~20 cm耕层土壤样品10个混匀, 一部分样品用于土壤基本理化性质分析, 一部分样品装入无菌自封保鲜袋低温保存后运到实验室处理, -80℃保存.将采集的不同沼灌年限的土壤样品分别命名为CS-1(1 a沼灌); CS-2(2 a沼灌); CS-3(3 a沼灌), 并采集周边未灌沼液稻田土壤(CS-0).
同时在沼液存储池取3个不同位置的采集沼液样品混合后, 带回实验室对沼液的成分进行分析. 8月水稻成熟后, 在不同沼灌年限的水稻田中随机采集10株水稻植株样品, 带回实验室分析.
1.3 样品分析方法 1.3.1 土壤及沼液基本理化性质的测定沼液中的化学需氧量(COD)采用COD分析仪(Maxi Direct Code 214010)测定, 5日生化需氧量(BOD5)采用BOD测试仪(ET99724A)测定, pH采用便携pH计(PHS-3C)直接测定.沼液中的悬浮物(SS)是沼液经过0.45 μm的滤膜, 截留在滤膜上物质于103~105℃烘干至恒重后, 称重所得.沼液中铵态氮(NH4+-N)、总磷(TP)、总氮(TN)采用紫外分光光度计(T6-新世纪)测定.
土壤pH值采用酸度计法(水/土=2.5/1)测定; 有机质采用重铬酸钾滴定法测定.土壤铵态氮、硝态氮和磷酸盐的含量采用AA3型连续流动分析仪(Continuous Flow Analytical System, CFA)测定.土壤溶解性有机碳(DOC)采用风干过2 mm筛的土样10 g, 按水土比2：1添加蒸馏水浸提、振荡、离心, 上清液过0.45 μm滤膜, 滤液采用高温外热重铬酸钾氧化-容量法测定.
1.3.2 水稻产量的确定带回实验室的水稻植株样品, 用水冲洗干净后, 将植株样品分为根、茎、叶、穗等部位, 70℃烘干, 烘干后的植株样品分别称重.
1.3.3 土壤微生物分析DNA提取与质量控制.采用Fast DNA SPIN Kit For Soil (MP Biomedicals, LLC)试剂盒提取土壤微生物总DNA. 1%的琼脂糖电泳检测DNA样品是否有降解以及杂质; NanoPhotometer分光光度计检测样品纯度; Qubit2.0 Flurometer检测DNA样品浓度.
16S rDNA文库制备.取用10ng的DNA模板, 对目的区域进行扩增(V3+V4区引物为314F-805R).使用TaKaRa的EX Taq酶, 确保扩增效率和准确性.继而对扩增出的目的片段进行富集, 同时加入特异index序列.
库检：文库构建完成后, 先使用Qubit2.0进行初步定量, 稀释文库至1 ng·μL-1, 随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测, insert size符合预期后, 使用Bio-RAD CFX 96荧光定量PCR仪, Bio-RAD KIT iQ SYBR GRN进行QPCR, 对文库的有效浓度进行准确定量, 以保证文库质量.
测序：检测合格的文库, 采用Hiseq进行测序, 测序策略为PE250.
1.3.4 数据分析与计算方法对于测序所得到的序列, 通过去除低质量碱基、Ns、接头污染序列等过程完成数据过滤, 得到可信的目标序列, 用于后续分析.过滤后的序列, 称为Clean Reads.首先, 将双端测序的相应的Read1与Read2(Read1与Read2是指分别从5′和3′端两个方向测序所得到的序列片段)利用序列拼接方法PEAR[17]进行拼接; 然后, 对拼接后的序列利用软件QIIME 1.8.0版本进行分析[18~20]包括OTUs的提取、OTUs分析、进化树分析、α多样性分析[21].
Shannon指数是根据样品中的物种种类以及每个物种的比例来计算的多样性指标, 计算公式如下：
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式中, H′表示Shannon Index值, R表示样品中物种的种类数, Pi第i个物种所占百分比.
α多样性指数中Chao1是一个可以不基于进化树来进行评价物种丰度的一个指数, 计算公式如下：
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式中, Sobs是观察到的物种数, n1是观察到的Singletons的种类数, n2是观察到的Doubletons的种类数.
Simpson指数：是一种基于分布格局的多样性的测度方法, 是测量一个种群的集中程度或优势程度的.根据物种在样品中的比例来计算, 公式如下:
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式中, Pi表示物种i在样品中的比例.
典范对应分析(canonical correspondence analysis, CCA)用来揭示微生物分类群与土壤性质的关系.鉴于稻田土壤养分和理化性质可能对微生物群落分布产生影响, 将稻田土壤微生物在属水平上的分布与相应土壤环境因子(土壤pH、铵态氮含量、有机质、硝态氮含量、磷酸盐含量、可溶性有机碳)进行了CCA分析. CCA分析通过Canoco for windows 4.5进行.同时, 利用软件中的forward选项寻找影响最为显著的环境变量.
2 结果与分析 2.1 不同沼灌年限稻田土壤物理化学性质的差异沼液是农作物秸秆、畜禽粪便和生活污水等经过微生物厌氧发酵产生沼气能源后残留的液体.沼液中含有氮、磷等植物生长必需的营养元素, 是植物生长的优质营养源, 但直接排放则容易导致水体富营养化. 表 1列出了采样点稻田浇灌用沼液的基本理化性质, 从表中可以看出, 该养殖场沼气工程所产生的沼液整体呈中性偏碱, 铵态氮含量较高, 占总氮含量的68.18%.化学需氧量(COD)和5日生化需氧量(BOD5)都较高, 说明沼液中含有大量的有机物.沼液总磷的含量为(116.15±56.35)mg·L-1, 总氮含量为(0.66±0.29) mg·L-1, 均处于较高的水平.一般将总氮浓度达到0.5 mg·L-1, 总磷浓度达到0.05 mg·L-1作为水体达到富营养化的标准.高浓度的氮磷进入稻田这种相对封闭静止的水体, 必然导致稻田中溶解氧含量的急速下降, 引发严重的富营养化, 从而对稻田的微生物生境产生巨大影响, 进而影响稻田微生物的生长繁殖, 引起稻田中微生物菌落结构和生物多样性的变化.
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表 1 沼液的基本理化性质 Table 1 Basic physicochemical properties of biogas slurry |
不同沼灌年限土壤基本理化性质的变化见表 2, 从中可以看出, 随着沼灌年限的增加, 土壤的pH有降低的趋势, 常规稻田土壤偏碱性(8.07±0.05), 沼灌3 a后土壤pH趋于中性(7.54±0.02).沼灌3 a的稻田土壤磷酸盐、硝酸盐含量明显高于常规稻田及其他沼灌年限的稻田, 说明沼灌稻田土壤中存在磷酸盐、硝酸盐的累积.而沼灌3 a土壤铵态氮含量与常规稻田相比呈下降趋势, 可能是由于沼灌稻田土壤中微生物系统的消解作用或氨的挥发及硝化、反硝化作用.随着沼灌年限的增加, 土壤有机质也逐渐增加, 但各处理间差异不显著.随着沼灌年限的增加, 土壤中溶解性有机碳的含量也呈现出逐年增加的趋势.
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表 2 土壤样品的环境参数 Table 2 Environmental parameters of soil samples |
2.2 沼灌对水稻植株各部位生物量及水稻产量的影响
不同沼灌年限与水稻植株各部位生物量的关系见图 1, 水稻茎叶的生物量随沼灌年限的增加变化不明显, 但随着沼灌年限的增加, 水稻根的生物量出现了先增加后减小的趋势.沼灌2 a的处理, 其根、茎、叶各部位的生物量均高于其他处理.
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图 1 不同沼灌年限与水稻植株各部位生物量的关系 Fig. 1 Dry weight of plants in different areas with different times for biogas slurry irrigation |
不同沼灌年限的水稻产量与常规水稻产量不存在显著性差异.但从图 2中可以看出, 不同沼灌年限的水稻产量都小于常规施肥.不同年限的沼灌处理中, 沼灌2 a的处理其水稻产量仍表现为最高.
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图 2 不同沼灌年限稻田水稻产量的差异 Fig. 2 Rice grain yield with different times of biogas slurry irrigation |
从不同沼灌年限的稻田土壤样品中分别提取的成对序列个数分别为39674、39041、39467、38939, 能够成功拼接的有效序列分别为39662、39026、39439、38923, 成功拼接率分别达99.97%、99.96%、99.93%、99.95%.
2.3.2 OTUs分析Venn图是根据样品中的OTU交叠情况作出的. 图 3列出了OTUs组成的重叠情况, 数字表示所在区域的OTU数目.
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图 3 OTUs交叠Venn图 Fig. 3 OTUs overlapping Venn map |
从图 3中可以看出, CS-0样品中含有细菌种类2 482个, CS-1样品中2478个, CS-2样品中含有2 351个, CS-3样品中含有1 965个. CS-0和CS-1有相同种类1 527个, CS-0和CS-3有相同种类1277个, CS-0和CS-2有相同种类1 518个, CS-1和CS-3有相同种类1 085个, CS-1和CS-2有相同种类1 553个, CS-2和CS-3有相同种类1 218个.在相似度0.97基础上分类出3 977个OTU, 其中门水平3 976个, 纲水平3 924个, 目水平3 607个, 科水平2 460个, 属水平1 152个.
在了解每个OTUs对应的物种后, 由于存在同一个物种具有多个不同的OTUs的情况.把具有相同物种分类的OTUs合并到一起, 统计不同样品间的物种成分变化, 可以了解不同样品之间的菌群多样性.选取门、纲、目、科、属这5个水平上, 各个样品中平均含量前10的物种构成的物种分布柱状图.其余的物种归于others中.统计不同样品中的细菌分类, 根据百分比做上述的直方图.分布结果从门、纲、目、科、属不同分类水平进行统计.结果见图 4~8.
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图 4 不同沼灌年限稻田土壤中细菌在门水平上的物种成分变化 Fig. 4 Results of species annotation to OTU from different biogas irrigation times at a phylum level |
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图 5 不同沼灌年限稻田土壤中细菌在纲水平上的物种成分变化 Fig. 5 Results of species annotation to OTU from different biogas irrigation time at a class level |
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图 6 不同沼灌年限稻田土壤中细菌在目水平上的物种成分变化 Fig. 6 Results of species annotation to OTU from different biogas irrigation time at an order level |
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图 7 不同沼灌年限稻田土壤中细菌在科水平上的物种成分变化 Fig. 7 Results of species annotation to OTU from different biogas irrigation time at a family level |
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图 8 不同沼灌年限稻田土壤中细菌在属水平上的物种成分变化 Fig. 8 Results of species annotation to OTU from different biogas irrigation time at a family level |
从图 4中可以看出, 在门水平上, 不同沼灌年限的土壤以变形菌门(Proteobacteria)为主, 随着沼液的施入变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和蓝细菌门(Cyanobacteria)所占的比例呈现先减少后增大的趋势, 而酸杆菌门(Acidobacteria)、硬壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)则恰好相反, 表现为先增大后减小.且随着沼灌年限的增加, 芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)所占的比例逐渐减小.
纲水平上(如图 5), 随着沼灌年限的增加, β-变形菌纲(β-Proteobacteria)和拟杆菌纲(Bacteroidia)所占的比例逐渐增加, α-变形菌纲(α-Proteobacteria)所占的比例逐渐减少, 但δ-变形菌纲(δ-Proteobacteria)所占的比例变化不明显.
目水平上(如图 6), 随着沼灌年限的增加, 拟杆菌目(Bacteroidales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)所占的比例逐渐增大, 根瘤菌目(Rhizobiales)、Solibacterales纲某目所占的比例则是先增大后减小.
从科水平看(图 7和表 3), 未沼灌的稻田土壤以脱硫弧菌科(Thermodesul fovibrionaceae, 3.50%)、土杆菌科(Geobacteraceae, 2.80%)、华杆菌科(Sinobacteraceae, 2.60%)为主, 沼灌1年的土壤以Koribacteraceae科(5.50%)、拟杆菌科(Bacteroidaceae, 3.70%)、梭菌科(Clostridiaceae, 3.70%)为主, 沼灌2年的土壤以拟杆菌科(Bacteroidaceae, 5.40%)、脱硫弧菌科(Thermodesul fovibrionaceae, 4.10%)和Ellin515科(3.60%)为主.沼灌3年的土壤以拟杆菌科(Bacteroidaceae, 7.70%)、红环菌科(Rhodocyclaceae, 6.50%)、嗜氢菌科(Hydrogenophilaceae, 5.40%)为主.
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表 3 不同沼灌年限稻田土壤中细菌群落在科水平上所占的比例/% Table 3 Proportion of bacteria at different biogas irrigation time at a genus level/% |
在属的水平上(图 8和表 4), 未沼灌的稻田土壤以红螺菌科某属(3.40%)、GOUTA19 (3.20%)、土杆菌属(Geobacter, 2.70%)为主, 沼灌1 a的土壤以Koribacteraceae科某属(4.10%)、拟杆菌属(Bacteroides, 3.70%)、红螺菌科某属(2.50%)为主, 沼灌2 a的土壤以拟杆菌属(Bacteroides, 5.40%)、GOUTA19 (3.80%)、Ellin515科某属(3.60%)为主.沼灌3 a的土壤拟杆菌属(Bacteroides, 7.70%)、硫杆菌属(Thiobacillus, 5.40%)、华杆菌科某属(5.00%)为主.随着沼灌年限的增加, 稻田土壤中的拟杆菌属(Bacteroides)比例逐渐增加, 硫杆菌属(Thiobacillus)也有增加的趋势, 但红螺菌科某属的比例逐渐减少.从表 4中还可以看出, 随着沼灌年限的增加, 其他菌种所占的比例表现为先增加后减小.
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表 4 不同沼灌年限稻田土壤中细菌群落在属水平上所占的比例/% Table 4 Proportion of bacteria at different biogas irrigation time at a genus level/% |
2.3.3 进化树分析
根据已知的参考数据库中的亲缘关系, 利用PyNAST序列比对算法[22]对得到的OTUs构建进化树, 利用Graphlan[23]软件得到0如下进化树图形：不同颜色分别代表在整棵树里面比较重要的一些子树, 包含序列越多圆圈越大.
从OUT系统发育树的结果可以看出(如图 9), 从门水平的角度, 变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度较高, 从纲水平的角度, γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、β-变形菌纲(β-Proteobacteria)、α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、δ-变形菌纲(δ-Proteobacteria)、拟杆菌纲(Bacteroidia)相对丰度较高.从目水平角度, 拟杆菌目(Bacteroidales)、硝化螺旋菌目(Nitrospirales)的相对丰度较高.
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图 9 物种进化树 Fig. 9 Phylogenetic relationship of OTUs |
α多样性展示的是样品内的菌群的多样性情况, 包括菌种的类别丰富度以及菌种数目的均匀度. α多样性越高即细菌种类越丰富, 细菌数目越均匀则表示此群落愈加稳定.根据5种不同的计算指标在不同的取样深度下求得了α多样性指标值, 见图 10.
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图 10 α多样性指数的变化 Fig. 10 Change in α diversity indices |
Chao1指数表征物种的丰富度, 其值越高表明细菌群落的物种丰富度越高.Simpson指数和Shannon指数表征细菌群落的多样性程度[24].由图 10可知, 随着沼灌年限的增加, Chao1指数逐渐减小, 也即细菌群落的物种丰富度逐渐降低. Simpson指数和Shannon指数也呈现逐渐减小的趋势, 即随着沼灌年限的增加, 细菌群落的多样性逐渐降低.
2.3.5 沼灌稻田环境因子与微生物群落的相关性分析利用CANOCO软件, 在属水平上将不同沼灌年限土壤中比例大于0.1%的菌属(共计129个菌属, 标记为g1~g129)与土壤的pH值、磷酸盐含量、硝态氮、铵态氮、有机质、溶解性有机碳(DOC)等6个环境因子进行Forward分析和典型对应分析(CCA), 见图 11.同时, 采用999次的蒙特卡罗排列检验对诸环境因子进行显著性检验.
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图 11 不同沼灌年限土壤环境因子与属水平上微生物占比的CCA分析 Fig. 11 Results from canonical correspondence analysis (CCA) to explore the relationship between microbial populations and selected environment factors in the soil |
结果表明, 在磷酸盐、硝态氮、铵态氮、pH、有机质、溶解性有机碳(DOC)等几个土壤环境因子中, 溶性有机碳对沼灌稻田土壤微生物群落结构的影响最大, 结合CANOCO forward分析, 可知影响顺序为：溶解性有机碳(F=2.67, P=0.09)＞铵态氮(F=2.17, P=0.13)＞pH(F=0.70, P=0.63)＞有机质(F=0.52, P=0.93)＞磷酸盐(F=0.46, P=0.92)＞硝态氮(F=0.39, P=0.93).
3 讨论施用沼液能够有效调节土壤pH值, 增加氮、磷及有机质等土壤表层养分的含量[25, 26].本文中, 随着沼灌年限的增加, 稻田土壤的pH值有下降的趋势, 这主要是由于沼液本身具有良好的缓冲性, 呈弱碱性; 同时, 沼液中含有大量有机质, 施用后可增加土壤孔隙度; 好氧和兼性微生物降解有机质, 产生大量腐殖质, 可降低土壤酸碱度[27].沼液pH值下降还能在一定程度上影响铵态氮浓度, 导致其浓度降低, 从而降低稻田氨挥发速率和氨挥发量.沼灌3 a的稻田土壤硝态氮和磷酸盐出现了累积, 超过了水稻生长季对氮磷的吸收量, 进而造成了稻田水体的严重富营养化.随着沼灌年限的增加, 土壤有机质也逐渐增加, 但各处理间差异不显著.表明通过沼液进入土壤中的有机质基本被土壤中的微生物所消解了.
从不同沼灌年限水稻植株各部位的生物量及产量来看, 沼灌初期, 随着沼液中速效养分的输入, 使水稻能够大量吸收这些速效养分, 保证水稻生长季的正常营养需求.但随着沼灌年限的增加, 稻田系统养分逐渐累积, 但水稻植株对养分的需求有限, 使得氮磷等养分在稻田中大量累积, 进而使稻田上覆水体的富营养化程度加剧, 导致水稻根系严重缺氧, 影响了水稻根系的生长及通过根系的营养运输过程.张进等[28]的研究也发现沼液完全代替化学肥料施用对水稻生长及其产量形成不利.王子臣等[29]的田间定位实验也发现, 沼灌稻田的水稻产量较常规施肥处理均减产.因而出现了沼灌稻田水稻产量低于常规化肥处理稻田水稻产量的情况.
传统微生物培养方法, 由于培养基难以实现土壤微生物真正的生存环境, 只能反映极少部分土壤微生物信息[30].其他方法如Biolog系统法、生物标记、PLFA(磷酸脂肪酸)、RFLP(限制性片段长度多态性分析)、FISH(荧光原位杂交技术)等只能在门或纲水平上分析土壤微生物的群落结构, 不能更精确地对土壤微生物进行分析研究[31].如沼灌引起的微生物群落变化方面的研究仍以传统方法为主, 如黄亚丽在研究中发现, 随沼液施用量增加, 土壤细菌数量增加、真菌数量减少, 史一鸣等[6]采用PLFA分子生物学方法对沼液施用土壤中微生物群落结构多样性进行探讨, 发现沼液施用使土壤微生物群落数量有所增加.郑学博等[13]运用Biolog-ECO技术分析0~20cm花生收获期土壤微生物群落代谢功能多样性.本文运用高通量测序技术较全面和准确地反映了不同沼灌年限稻田土壤微生物群落结构在门、纲、目、科、属这5个水平上的分布, 并从整体微生物群落水平上分析了沼灌稻田微生物物种的遗传多样性, 这在微生物群落多样性的表征方面具有明显的优势.
微生物群落结构及其组成与所处的环境密切相关, 环境因素的改变, 会引起微生物群落结构及其组成的变化[32].沼液施入稻田后, 稻田土壤的理化性状、水气热条件等都发生了改变, 进而对土壤中的微生物群落组成产生了影响.
随着沼灌年限的增加, 纲水平的β-变形菌纲(β-Proteobacteria)、拟杆菌纲(Bacteroidia), 目水平的拟杆菌目(Bacteroidales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)所占比例逐渐增加, 属水平的拟杆菌属(Bacteroides)和硫杆菌属(Thiobacillus)所占的比例也有增加的趋势, 这主要是因为沼液施用引入的大量有机物质为细菌生长补充丰富的碳源和氮源, 激发了细菌的生长繁育.但也有一些微生物的占比随着沼液施用年限的增加而减小, 如芽单胞菌门(Gemmatimonadetes), α-变形菌纲(α-Proteobacteria)及其纲下红螺菌科某属.这可能是由于沼灌加剧了稻田水体的富营养化, 田面水及土壤含氧量降低, 使部分严格好氧或兼性厌氧的微生物(如芽单胞菌、红螺菌等)活性降低.也有一些微生物占比随着沼灌年限的增加, 呈现先增大后减小的趋势, 如门水平的酸杆菌门(Acidobacteria)、硬壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria), α-变形菌纲根瘤菌目(Rhizobiales).这主要是由沼灌引发的营养与环境变化两个方面的因素所致.
一般地, 沼液施用能够提高土壤酶活性, 增加土壤微生物数量及多样性指数[33~35], 但本文中, α多样性结果表明, 随着沼灌年限的增加, 稻田土壤的微生物物种丰度逐渐降低, 细菌群落多样性也有逐渐降低的趋势.这可能与土壤性质、沼液成分、施灌方式都有密切的关系.本文稻-闲模式下沼液的消纳明显有别于稻-油及旱作土壤, 而与湿地生态系统有很大的相似性.稻闲模式下, 稻田土壤淹水的时间明显延长, 沼灌又增加了上覆水体及土壤的营养盐含量, 进而加剧了稻田水体的富营养化, 使稻田水土环境中氧气的含量明显降低, 对于已经适应常规稻田好氧及兼性厌氧微生物生长的逆境期更长, 更加不利于这些微生物种群的生长繁衍.
土壤中溶解性有机碳是土壤微生物群落的能量和微生物细胞组成成分的主要来源, 还是土壤微生物新陈代谢的主要产物[36].本文的研究结果也表明, 沼灌稻田土壤中的溶解性有机碳是影响土壤中微生物群落组成的主要因素.陈安强等[37]研究也发现牛粪等有机物料的输入可显著提高稻田土壤中的可溶性有机碳的含量, 这与本文的研究结果相一致.随着沼灌年限的增加, 稻田土壤中的溶解性有机碳的含量逐渐增加, 为稻田土壤中微生物的生长提供了丰富的碳源, 但沼灌后期过量有机物的输入使稻田水土环境处于还原缺氧状况, 土壤中溶解性有机碳的含量也逐渐下降, 因而土壤中酸杆菌门(Acidobacteria)、硬壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)等所占的比例呈现出先增加后减小的趋势.这也进一步说明土壤中溶解性有机碳与沼灌稻田土壤中微生物群落组成及占比密切相关.
由于沼液中铵态氮的含量也较高, 施入稻田后, 田面水中铵态氮的含量明显提升[38], 且会持续较长时间, 稻田土壤中微生物的群落结构直接受到这一过程的影响.同时, 沼灌后期, 随着水体富营养程度的降低, 水体溶解氧增加, 反硝化作用受到抑制, 参与氨氧化细菌的活性和数量仍然占据多数.因此, 在沼灌条件下, 铵态氮是影响稻田土壤微生物群落组成的最重要因素.土壤pH值是影响土壤微生物多样性的重要因子[39].中性偏碱的环境更有利于微生物的生长, 本文中几种土壤的pH值均在微生物生长的适宜范围, 因此其对土壤微生物多样性的影响不及铵态氮明显.研究也表明, 土壤有机质与土壤微生物功能多样性之间存在明显正相关关系, 土壤有机质含量越高, 微生物多样性也越高[40].磷酸盐与稻田土壤中微生物Fe(Ⅲ)还原过程密切相关[41, 42], 磷素缺乏可能导致Fe(Ⅲ)还原过程难以发生, 在厌氧条件下, 这一过程会被加速, 但这类微生物的种类和数量远不及氨氧化微生物, 因此其对沼灌稻田微生物群落的影响也较为有限.
4 结论(1) 随着沼灌年限的增加, 土壤pH值逐渐下降, 土壤氮磷等营养物质逐渐累积, 土壤有机质及溶解性有机碳的含量也有增高的趋势.长期沼灌可能不利于水稻植株生物量及产量的形成.
(2) 总体上, 不同沼灌年限的土壤以变形菌门(Proteobacteria)为主, 随着沼灌年限的增加, β-变形菌纲(β-Proteobacteria)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、拟杆菌目(Bacteroidales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、拟杆菌属(Bacteroides)、硫杆菌属(Thiobacillus)所占比例逐渐增加.芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、α-变形菌纲(α-Proteobacteria)等所占比例逐渐减小.
(3) 随着沼灌年限的增加, 稻田土壤微生物群落的物种丰富度逐渐降低, 微生物群落的多样性也逐渐降低.
(4) 土壤溶解性有机碳和铵态氮的含量对沼灌稻田土壤微生物群落结构的影响最大, pH、有机质、磷酸盐等环境因子对沼灌稻田土壤微生物群落结构的影响有限.
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