2018, Vol. 39
近年来, 随着社会生产力的不断提高, 陆源入海排污口邻近海域的生态环境日益恶化[1].陆源入海排污口将污水处理厂处理后的尾水直接排入天然水体, 通过水体自净作用将其稀释.然而, 巨大的排放量远远超过天然水体的水环境容量, 从而加剧水环境的污染.因此, 陆源入海排污问题引起的了社会各界的广泛关注, 并针对其做了大量研究[2~4].
有研究发现入海的污染物很难得到较快的混合, 聚集在近海海域会对养殖、旅游、浴场及景观等海洋功能产生不良后果[5]; 也有研究针对排污口附近的总异养菌群、总大肠杆菌群、粪大肠杆菌群、肠球菌进行检测[6, 7], 发现了大肠杆菌在排污口附近的明显分布规律[8], 通过众多影响因素分析后建立了大肠杆菌的迁移模型, 以评价尾水排放对沿岸人群健康的影响[9], 所采用的微生物指标主要集中在微生物总量和几种指示病原菌; 更有研究针对人工湿地的直排海尾水[10]微生物群落结构进行探讨; 总之我国针对陆源入海排污口的研究主要局限于排海后对海水水质的影响、模拟和预测等方面的研究[11, 12], 尚没有对陆源排污口不同方式排海后的微生物群落结构扩散规律和致病菌的生物安全进行追踪的研究.
青岛位于山东半岛东南部沿海, 胶东半岛东部, 东、南濒临黄海, 隔海与朝鲜半岛相望, 拥有国际性海港和区域性枢纽空港.海域面积约1.22万km2, 其中领海基线以内海域面积8 405 km2; 海岸线(含所属海岛岸线)总长为816.98 km, 其中大陆岸线710.9 km, 大陆岸线占山东省岸线的1/4强, 拥有69个海岛和49个海湾.目前青岛的18家污水处理厂均采用直接排海或先排河再排海的方式对其尾水进行处理, 处理稍有不当, 就会对青岛周围的海洋环境产生巨大威胁.因此研究陆源入海排污口排海扩散后的微生物群落变化规律和生物安全对城市发展、海洋环境、人类健康都有着重要的意义.本研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术对不同排海方式的尾水细菌微生物群落结构进行分析, 探讨不同排海方式对微生物群落和功能微生物的影响, 以期为今后尾水排放的监测提供参考和依据.
1 材料与方法 1.1 水体样品采集于2016年春季对青岛市不同尾水排海方式两污水处理厂距排污口不同距离处, 采用(距海岸线20 m)GPS定位仪定位, 使用击开式采水器采集排海水海水表层(距水面0.5 m)水样, 采样点扇形布设取5处平行样并混合, 低温保存并在2 h内送至实验室进行抽滤, 抽滤后, 滤膜上的悬浮物用于基因组提取.其中, A污水处理厂采用Biostys生物滤池处理工艺, 一期工程于1999年底建成投产, 设计规模为10万m3·d-1, 工程占地1.71 hm2, 污水经预处理后通过DN1000、长1 030 m的管道深海排放.二期汇水区域东西长约20 km, 南北宽1~3 km, 总面积35 km2, 沿途污水通过多级泵站提升进入处理厂, 尾水在排海口直接排入海中, 出水达到一级B标准, 取得的4个样品分别距排污口0、50、500、1 000 m; B污水处理厂采用MSBR处理工艺, 建于1993年, 是青岛市五大排水系统中最大的一个, 汇水面积24 km2, 服务人口53万人, 污水量占全市的40%左右, 其中工业废水约占2/3, 加氯消毒后先排入海泊河后再进入胶州湾, 出水达到一级A标准, 取得的3个样品分别距排污口20、100、500 m; 青岛第二海水浴场位于汇泉湾东侧的太平湾内与八大关别墅区相邻的一处沙滩浴场, 取得的水样设为空白样品.
1.2 总DNA提取与分析采用“冻沸-溶菌酶-SDS”方法, 按照相应步骤对水体微生物的总DNA进行提取.随即用Wizard DNA Clean-Up Kit (Omega)试剂盒纯化样品DNA, -70℃冻存待用.
通过德国Implen公司微量核酸蛋白分析仪对分离纯化后的DNA浓度与纯度进行检测, 全部水样DNA波长260/280值均在1.7~1.9间.检测合格的基因组DNA样品交由派森诺公司对其进行Illumina MiSeq高通量测序.
1.3 样品高通量测序及数据分析 1.3.1 PCR扩增PCR的扩增区域为16S rRNA的V3~V4区, 16S rRNA扩增引物采用通用引物(338F/806R).引物名称和引物序列分别为：338F(ACTCCTACG GGAGGCAGCA)和806R(GGACTACHVGGGTWTC TAAT). PCR反应体系(25 μL)为：5×reaction buffer 5 μL, 5×GC buffer 5 μL, dNTP(2.5 mmol·L-1)2 μL, Forwardprimer(10 μmol·L-1)1 μL, Reverseprimer(10 μmol·L-1)1 μL, DNA Template 2 μL, ddH2O 8.75 μL, Q5 DNA Polymerase 0.25 μL. PCR反应条件为：98℃预变性2 min; 98℃变性15 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 25~27个循环; 最后72℃延伸5 min.用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物, 经Tris-HCl洗脱后, 用2%琼脂糖凝胶电泳检测.
根据PCR扩增图谱, 扩增后的条带比较清晰明显且条带位置一致, 背景干净, DNA浓度达到了扩增要求, 可直接用于后续分析.委托上海派森诺生物科技有限公司进行Illumina Miseq高通量测序.
1.3.2 测序数据优化处理保证分析结果的准确性, 运用Qiime(version 1.9.0, http://qiime.org/)进行数列过滤, 数据过滤标准为：去除5′端引物错配碱基数＞1的序列; 去除含有N(模糊碱基)的序列; 去除含有连续相同碱基数＞8的序列; 去除长度≤150 bp的序列; 去除嵌合体序列.运用Mothur软件(version1.31.2, http://www.mothur.org/)中Uchime的方法去除嵌合体序列, 得到最终用于后续分析的优质序列.
1.3.3 OTU聚类分析在Qiime中调用Uclust的方法对优质序列按序列相似度97%进行聚类, 选取每个类中最长的序列为代表序列.在Qiime中调用Blast的方法对序列数据库进行比对, 获得每个OTU代表序列的分类学信息.注释数据库为：Greengene(Release 13.8, http://greengenes.secondgenome.com).之后对OTU进行精简处理, 去掉丰度值小于总的序列条数的0.001%的OUT, 得到后续分析使用精简后的OTU列表.
1.3.4 多样性及群落结构分析根据OTU列表中的各样品物种丰度情况, 应用软件Mothur中的summary. single命令, 计算样品覆盖率(coverage percentage), 种群丰富度指数Chaol和ACE, 以及群落多样性指数Shannon和Simpson.组内3个平行样数据批量导入Qiime软件, 对OTU表进行组间差异性分析, 主要进行稀释曲线分析、多样性指数分析、门纲种属分类分析和致病分析.
2 结果与分析 2.1 物种丰度 2.1.1 OTU稀释性曲线稀释曲线可以用来比较不同样本中的物种多样性情况, 也可以用来说明进行测序的样本的数据量和可行性.如图 1, 横坐标代表随机抽取的序列数量; 纵坐标代表OTU数量.当曲线趋向平坦时, 说明测序趋于饱和, 增加数据量对于获得新的OTU作用不大; 反之则表明测序不饱和, 增加数据量可以获得更多的OTU.由图 1可知, 随着测序深度的增加8个样品的稀释曲线趋于平缓, 表明此时样品的测序数据量较为合理.
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A.Biostys生物滤池, B.MSBR工艺, 下同 图 1 样品稀释曲线 Fig. 1 Dilution curve of samples |
Shannon-Wiener曲线是利用Shannon指数来进行绘制的, 反映样品中微生物多样性的指数, 利用各样品的测序量在不同测序深度时的微生物多样性指数构建曲线, 以此反映各样本在不同测序数量时的微生物多样性.当曲线趋向平坦时, 说明测序数据量足够大, 可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息.由图 2可知, 随着测序深度的增加8个样品的Shannon指数曲线数值升高直至平滑, 表明此时的测序深度足以覆盖样品中的大部分微生物即能基本反映尾水的微生物群落组成.
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图 2 样品香农指数曲线 Fig. 2 Shannon-Wiener curves of samples |
α多样性是指一个特定区域或生态系统内的多样性, 多样性指数是反映丰富度和均匀度的综合指标.样品的丰富度指数Chao、均匀度指数ACE和多样性指数Simpson/Shannon如表 1所示.
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表 1 尾水排海过程中细菌高通量测序α多样性指数 Table 1 The α diversity index of high-throughput sequencing in treated waste water discharges |
Chao和ACE是生态学中估计物种总数的常用指数, Chao/ACE值越大群落丰富度越高, A、B污水处理厂均在距排污口500 m处群落丰富度最高, 除A污水处理厂出水口外, 其余取样点群落丰富度均高于空白海水样品; A污水处理厂群落丰富度随距排污口距离增加而增大, 但在距排污口1 000 m处大幅度减小; B污水处理厂群落丰富度随着距排污口距离增加而增大. Simpson/Shannon值用来估算样品中微生物多样性, Simpson指数值越大, 群落多样性越低, Shannon指数值越大, 群落多样性越高, A、B污水处理厂Simpson指数均在0.93~0.97之间; 除A污水处理厂出水和距排污口50 m处样品外, 其余样品群落多样性均高于空白样品; 500 m处样品群落多样性最高; A污水处理厂群落多样性随距排污口距离的增加而增大, 但在距排污口1 000 m处大幅度减小; B污水处理厂群落多样性并未表现出明显的变化规律, 但2个污水处理厂群落多样性均出现先增大后减小的趋势.
2.3 样品群落结构门水平分析对春季3个研究区域样品的微生物群落结构进行门水平的分类统计, 如图 3.两个污水处理厂尾水扩散过程及空白样品共检测出25个菌门, 其中A污水处理厂检测到25个菌门, B污水处理厂检测到21个菌门, 空白海水样品检测到20个菌门, 样品细菌群落结构在门分类水平上具有较高的多样性, 主要包括变形菌门(Proteobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、梭杆菌门(Fusobacteria)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)等.变形菌门(Proteobacteria)相对丰度分别为88.01%、94.70%、83.70%、88.31%、62.76%、93.73%、93.54%、66.11%, 均在60%以上, 表现出绝对优势.拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)在两个污水处理厂中也均表现出优势.厚壁菌门(Firmicutes)所占比例在两个污水处理厂均随着扩散距离的增大而减少; A污水处理厂, 纤维杆菌门(Fibrobacteres)所占比例随距离增大而降低; B污水处理厂, 变形菌门(Proteobacteria)所占比例随距离增大而降低, 而拟杆菌门(Bacteroidetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、螺旋体门(Spirochaetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)所占比例均随距离增大而升高; 其他菌门在A、B两污水处理厂中均未表现出明显的规律性变化.
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图 3 样品微生物群落结构门水平相对丰度分布 Fig. 3 Relative abundance of microbial community structure by phyla |
对春季3个研究区域样品的微生物群落结构进行纲水平的分类统计, 如图 4.两个污水处理厂尾水扩散过程及空白样品共检测出62个菌纲, 其中A污水处理厂检测到41个菌纲, B污水处理厂检测到58个菌纲, 空白海水样品检测到41个菌纲. A污水处理厂检测到的Synergistia和Leptospirales在空白样品中并未发现; B污水处理厂检测到的Aquificales、Brocadiae、Chloracidobacteria等21个菌纲在空白样品中并未发现. α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria在两水厂中表现出绝对优势.不同菌纲在A、B两污水处理厂的扩散规律表现出明显差异, Clostridia、Bacteroidia、Acidimicrobiia等7个菌纲出现明显的扩散现象, 随着扩散距离的增大而减少; Einococci、Gemmatimonadetes、Nitrospira等14个菌纲则随着扩散距离的增大而增大; 其他菌纲在A、B两污水处理水厂中均未表现出明显的规律性变化.经过扩散稀释后, A污水处理厂有15个菌纲相对丰度高于空白样品, B污水处理厂则仍有41个菌纲相对丰度高于空白样品.
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图 4 样品微生物群落结构纲水平相对丰度分布 Fig. 4 Relative abundance of microbial community structure by classes |
本文针对相对丰度大于1%的优势菌种进行分析, 如图 5.两个污水处理厂尾水扩散过程及空白样品共检测出优势菌种53种, 其中A污水处理厂检测出28种, B污水处理厂检测出32种, 空白样品检测出7种, 相较于直接排海, 先排河后排海方式的微生物群落丰富度更高. Planktomarina temperata在空白样品中相对丰度达到14.31%, 表现出绝对优势; A污水处理厂, Listonella anguillarum、Octadecabacter antarcticus分别在距排污口50 m和1 000 m处表现出相对优势, 相对丰度分别为18.51%和20.99%; B污水处理厂, Pseudoalteromonas haloplanktis在距排污口20 m、100 m处表现出相对优势, 相对丰度分别为22.25%和15.04%;除了这4种菌外, 其余菌种相对丰度均小于15%. A污水处理厂有11种菌随扩散规律的增大而降低, 5种菌随扩散规律的增大而升高; B污水处理厂有8种菌随扩散规律的增大而降低, 12种菌随扩散规律的增大而升高; 其他菌种并未随扩散距离表现出明显的规律性变化.经过扩散稀释后, A污水处理厂有7种菌相对丰度仍高于空白样品, B污水处理厂则仍有13种.
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图 5 样品微生物群落结构种水平相对丰度大于1%分布 Fig. 5 Relative abundance of microbial community structure by genus for those at > 1% abundance |
本文采用Illumina MiSeq高通量测序技术对不同排海方式排污口废水的细菌扩散规律进行研究, 发现变形菌门(Proteobacteria)相对丰度在A、B两污水处理厂中均大于60%, 成为绝对优势菌门, 这与刘晓辉等在长江口及邻近海域表层海水发现的细菌群落结构相符[13], 但与另外两优势菌门拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)在海域表层海水中存在较少的现象有显著差异.对比同一污水处理厂不同扩散距离可以发现, 优势菌门所占比例随着扩散距离的增大整体呈下降趋势; 比较A、B两污水处理厂发现, B污水处理厂中存在少量古菌(Archaea)和热袍菌门(Thermotogae), 造成这些现象的主要原因可能是尾水中含有大量的污水处理相关菌, 如脱氮除磷类细菌.而变形菌门(Proteobacteria)细菌都为革兰氏阴性菌, 大量与氮循环相关的微生物都分布在变形菌门(Proteobacteria)[14]，其包括多种代谢种类, 大多数细菌营兼性或专性厌氧, 极少数好氧.本研究中A、B两污水处理厂特有的好-厌氧工艺流程为微生物的生长提供了多样性的兼性有氧环境, 适宜变形菌的生长[15].拟杆菌门(Bacteroidetes)作为另一优势菌群, 多数是化能有机营养细菌, 与污水的降解极为密切, 主要降解复杂的有机物, 如拟杆菌能将淀粉、纤维素等水解为单糖, 进一步降解为乳糖、乙酸、甲酸等[16].厚壁菌门(Firmicutes)中存在芽孢杆菌属(Bacillus spp.)等存在与污水处理有关的好氧反硝化菌, 且已有研究证实厚壁菌门(Firmicutes)广泛存在于粪便样品中[17], 与A、B两污水处理厂中生活污水来源密切相关.因此, 在排海过程中的扩散作用下其细菌浓度逐渐降低, 在每个样品中的占比随着扩散距离的增大整体呈下降趋势.蓝藻菌门(Cyanobacteria)等出现随扩散距离增大整体上升的趋势, 则是由于其在自然水体中浓度更高造成的. B污水处理厂中特有的古菌(Archaea)属于超嗜热微生物, 最适生长温度在80~110℃[18], 热袍菌门(Thermotogae)是一类嗜热微生物[19], 这类菌门的存在可能与该厂的沼气发电工艺有关.
A、B两污水处理厂中的优势菌纲均集中在变形菌门(Proteobacteria), 主要由α-变形菌纲(α-Proteobacteria)、β-变形菌纲(β-Proteobacteria)、γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)、ε-变形菌纲(ε-Proteobacteria)组成, 符合两种污水处理工艺中微生物群落结构的研究结果[20]; 但是, 除优势菌纲外的其他大部分菌纲丰度极低, 这与尾水排放口附近的微生物群落结构组成存在一定差异[21].优势菌纲中的β-变形菌纲、γ-变形菌纲、ε-变形菌纲随扩散距离的增大整体呈下降趋势, 而α-变形菌纲随扩散距离的增大整体呈上升趋势.造成这些变化的主要原因可能是γ-变形菌纲、β-变形菌纲多为兼具呼吸/发酵代谢方式的兼性异氧菌, 是污水处理系统中COD降解的主要参与者. ε-变形菌纲包括严格厌氧的一些种类, 同样具有降解COD的功能.这类病原菌均来自污水处理流程, 由尾水排海引入.因此, 越靠近排海口其丰度越高, 反之, 随着排海过程的扩散作用其细菌浓度逐渐降低, 使其在每个样品中的占比随扩散距离的增大整体呈下降趋势.而α-变形菌纲的细菌大多与动植物共生, 且广泛存在于海洋环境中.因此, 该纲类细菌受尾水中其他微生物影响越小, 其在样品中的丰度越会增大.除优势菌纲外的其他大部分菌纲数量从另一方面再次验证了尾水中的优势菌纲对受纳水体微生物多样性造成的影响.另外, 在A污水处理厂发现3种特定菌纲, B污水处理厂发现19种特定菌纲, 说明不同污水处理工艺导致出水微生物群落结构差异, 因此不同地区应根据处理水来源、受纳水体特点选择适合的污水处理工艺.空白水样存在的Nitriliruptoria在A、B污水处理厂中均未被发现, 之前在对南海深海沉积物的研究中Nitriliruptoria也曾被发现[22], 表明其是深海一种特定菌群, 生活污水中并不存在.
A、B污水处理厂中检测到大部分细菌在空白样品中并不存在.其中仅在A污水处理厂检测到的Octadecabacter antarcticus随扩散距离的增大整体呈上升趋势, 出现这种反常现象的原因可能是因为该细菌主要附着并仅存在于海洋中的海藻植物表面, 而相较于B污水处理厂先排河后排海的污水排放方式, A污水处理厂的尾水是直接排海过程, 因此, 随着扩散距离海洋环境越来越近, 相对丰度便呈现上升的趋势; 而在空白样品中并未检测出该细菌, 可能是由于第二海水浴场属于旅游景点, 常年接待大量游客, 导致海藻植物的生存环境受到污染难以生存.相较于A污水处理厂尾水直接排海方式, B污水处理厂先排河后排海的尾水排放过程中微生物群落结构相对丰度更高, 由此可见, 尾水的直接排海使得微生物更易扩散.另外, 两污水处理厂检测到一些与污水处理相关细菌如：约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)具有较强的聚磷能力, 处理废水的除磷率可高达68.88%[23]; 其在出水口所有菌种中占比最高, 而在50 m处占比下降较明显, 500 m采样点基本不再出现.类似的还有氢噬胞菌属好氧兼性嗜氢自养菌(Hydrogenophaga caeni), 以氧为末端电子受体的氧化型的糖代谢, 具有厌氧硝酸盐呼吸、反硝化作用[24]; Simplicispira psychrophila能够以铵盐和谷氨酸盐作氮源, 有脱氮作用[25]; Arcobacter trophiarum具有还原硝酸盐, 参与反硝化, 可水解羟基吲哚乙酸的作用; Desulfomicrobium baculatum属硫酸盐还原菌, 可降解硫酸盐.这些细菌在出水口占比均大于扩散后的其他采样点, 既表明了污水处理工艺中污水处理相关菌的重要性, 同时也体现了海水的稀释净化作用.
尾水样品中存在一定量的致病菌和条件致病菌.如对鱼类存在致病性的Pseudoalteromonas haloplanktis海洋细菌[26]; 具有广泛的致病性的Listonella anguillarum、Shewanella aestuarii、Shewanella frigidimarina、Pseudomonas anguilliseptica等重要水产动物病原菌; 引起肺炎、脑膜炎、败血症等感染的Arcobacter ellisii[27]、引起持续性腹泻、恶心、呕吐的Arcobacter ebronensis[28]、引起呼吸道感染、败血症、重则死亡的Acinetobacter kyonggiensis[29]等人类致病菌, 大部分病原菌随着海水的稀释作用能控制在正常范围内, 并不会对人类健康产生影响.但值得指出的是, Pseudomonas anguilliseptica经过海水的稀释作用后相对丰度仍然很高, 该菌被称为病鳝假单胞菌, 于1972年由日本学者Wakabayashi分离得到, 容易引起鳗鲡红点病, 目前已经发展成为日本鳗鲡最具毁灭性的病害之一[30, 31], 入侵海洋后会对海洋生态造成影响, 也会对海水养殖造成损失.另外, A、B两污水处理厂样品中均检测到弓形杆菌属(Arcobacter spp.), 这与李江宇等[32]、田园等[33]发现的弓形杆菌属是海水浴场和城市污水生物絮凝池活性污泥中的优势菌群的结果相符.该菌属是一种人畜共患的食源性和水源性病原菌, 在自然界中广泛存在, 主要分离自猪肉、牛肉、禽肉等动物性食品和水体, 与人类和动物的腹泻、菌血症等疾病密切相关, 致病性与弯曲菌相当, 且比弯曲菌更易存活[34].因此, 相关部门应加强尾水排放中对这两种细菌的重点监测, 并完善宣传工作建立民众的食品安全意识.
4 结论(1) 直接排海尾水中细菌分布在25个门、41个纲, 相对丰度大于1%的有28种; 先排河后排海尾水中细菌分布在21个门、58个纲, 相对丰度大于1%的有32种, 变形菌门均占绝对优势, 直接排海方式中细菌的相对丰度低于先排河后排海方式, 优势菌门所占比例随扩散距离增大呈下降趋势.
(2) 两污水处理厂尾水中均检测到弓形杆菌属(Arcobacter spp.), 与人类和动物腹泻、菌血症等疾病相关; 直接排海尾水中特有的Acinetobacter kyonggiensis可引起人类呼吸道感染、败血症等疾病; 先排河后排海尾水中特有的Pseudomonas anguilliseptica可对海水养殖产生危害.
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