2018, Vol. 39
近年来, 随着我国农业的发展, 氮肥产量和使用量居全球首位, 氮肥的流失, 导致水体富营养化[1, 2].河岸带是介于陆地生态系统和水生生态系统之间的区域, 有着干湿交替的变化, 随着河水的涨落造成厌氧和好氧的变化, 同时伴随着铁的氧化还原变化, 在生物地球化学循环中扮演重要的角色[3, 4].由于河岸带特殊的环境, 不同的物种的生长以及环境过程的多样性包括植物吸收、微生物作用、土壤淋溶等, 能够对氮素的去除产生影响, 之前有研究已经报道了河岸带能够去除大约67.5%进入水体的氮素[5].因此, 重点关注河岸带对氮素的去除及脱氮机制, 具有重要意义.
氮素的去除主要是植物吸收、微生物作用、沉积在土壤及水体底泥3条途径.其中, 微生物作用能将氮素转化为N2或N2O, 在氮的生物地球化学循环具有重要作用.目前, 有关微生物作用的脱氮反应主要是反硝化(Denitrification)和厌氧氨氧化(ANAMMOX)过程, 这两个过程能够将氮素转化为氮气释放到空气中, 是近几十年研究较多的脱氮反应[6~8].除上述两种过程以外, 近年来又发现了一种新的微生物脱氮过程——三价铁还原耦合氨氧化(称为铁氨氧化)[9~11]. Cheng等[8]研究表明在长江流域湿地中铁氨氧化对氮素的去除大约占到整个无机氮输入的3.1%~4.9%.铁氨氧化是以三价铁作为电子受体将氨氮氧化为氮气(N2)、亚硝酸盐(NO2-)或硝酸盐(NO3-)的过程, 如反应式(1)~(3). N2的产生直接来自铁氨氧化, 或铁氨氧化和厌氧氨氧化共同作用, 或铁氨氧化和反硝化共同作用, 这些过程都是30N2产生的潜在路径(表 1), 并且30N2的产生速率作为潜在的铁氨氧化速率[9~11]. 2012年, Yang等[11]报道了在热带森林土壤中, 利用同位素示踪技术测得铁氨氧化速率为0.32 mg·(kg·d)-1. 2014年, Ding等[9]测得水稻田中铁氨氧化速率为0.17~0.59 mg·(kg·d)-1, 并结合乙炔抑制法计算了铁氨氧化脱氮的贡献率. 2015年, Cheng等[8]利用同位素示踪技术和定量聚合酶链反应(Q-PCR)技术的结合, 证明了滩涂湿地中铁氨氧化的存在, 同时表明了铁还原菌在铁氨氧化过程的重要性以及铁还原菌丰度的改变能够影响三价铁还原速率和铁氨氧化速率. Zhou等[12]报道了铁还原菌在铁氨氧化中扮演着重要角色, 并影响铁氨氧化脱氮的过程. Shu等[13]已经表明氮素和铁还原菌在污水处理厂的共生方式.因此, 对铁还原菌的研究有助于探究铁氨氧化脱氮过程.目前, 铁还原菌已经在水稻田、湿地、湖泊沉积物、砷污染土壤等许多自然环境中被研究[9, 10, 14, 15].然而, 到目前为止有关铁氨氧化在河岸带的研究以及铁氨氧化与微生物群落结构的关系, 鲜见报道.
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表 1 在厌氧条件下通过标记15NH4+可能的铁氨氧化过程[9~11] Table 1 Possible Feammox process from 15NH4+ under anaerobic conditions |
因此, 本研究针对河岸带干湿交替等特点, 选取无锡亲水河河岸带作为研究地点.研究了河岸带表层的铁氨氧化脱氮过程, 探讨了微生物群落结构对铁氨氧化过程的影响, 分析了河岸带铁氨氧化脱氮的机制, 对河岸带脱氮具有理论及实际意义.
1 材料与方法 1.1 研究区域概况及土壤样品的采集亲水河位于无锡新区, 是进入太湖贡湖湾的河流, 由于河水常年波动, 造成河岸带厌氧和好氧环境的变化, 因此本研究选取亲水河河岸带作为研究区域(31°28′01 N, 120°19′27 E).在研究区域内采用柱状采泥器采集河岸带表层20 cm的土壤进行分析, 共3个采样点, 每个采样点分为4层(0~5、5~10、10~15、15~20 cm分别命名为A、B、C、D), 采集完后尽快运回实验室.在厌氧手套箱中, 将每个样品分为3个子样品.第一个子样品保存于4℃用于分析土壤的物理化学特征, 包括pH、TOC、NOx-N、NH4+-N、Fe(Ⅲ)和Fe(Ⅱ), 第二个子样品用于同位素分析, 第三个子样品冰冻于-80℃用于分子微生物分析.
1.2 同位素示踪培养土壤样品在充入高纯氦气(纯度为99.99%)的厌氧手套箱中培养.铁氨氧化速率通过同位素示踪技术和膜接口质谱仪(MIMS, Bay Instruments, Easton, MD, USA)来测量[10, 16].土壤样品和厌氧去离子水以1:3的比例混合, 混合的泥浆预先在黑暗厌氧环境处理两天用于去除本底的亚硝酸盐、硝酸盐和氧气.整个实验过程是在充入氦气的厌氧手套箱中进行.在培养之前, 准备厌氧去离子水[取去离子水倒入血清瓶中, 然后通入高纯氦气(纯度为99.99%)30 min去除去离子水中溶解氧]. 12 g的均质泥浆被转移到100 mL的血清瓶中, 然后分为两种处理组：①控制组用厌氧去离子水替代15NH4Cl; ②处理组加入15NH4Cl(15N at.%=99.11, 15NH4+), 使得血清瓶中15NH4Cl-N的浓度为100 μmol·L-1, 然后用橡胶塞密封并盖上铝帽.整个培养实验在室温(25℃±1℃)下进行, 24 h后, 加入100 μL 7 mol·L-1 ZnCl2终止微生物活动. 15 mL的水样被收集并且通过MIMS分析29N2和30N2的产生速率.在加入15NH4的处理组, 30N2产生速率被作为潜在的铁氨氧化速率.在气样被收集后, 通过测定培养期间Fe(Ⅱ)的浓度变化, 培养的泥浆立刻用于测量Fe(Ⅲ)的还原速率.
1.3 土壤特征用去离子水和土壤以2.5:1混合, 采用pH计测定土壤的pH; 称取100 g新鲜的土壤样品, 在60℃下加热到恒重测定土壤含水率; 将土壤样品冷冻风干过100目筛后, 用1 mol·L-1 HCl进行预处理去除土壤中的碳酸盐, 采用元素分析仪(Elementar Vario MICRO, Germany)进行分析, 测定土壤的TOC[17]; 在样品中加入2 mol·L-1 KCl提取液, 采用连续流分析仪(San++System, Skalar Analytic, Breda, The Netherlands)进行分析, 测定土壤的NH4+、NO2-和NO3-的含量[18].称取1.0 g土壤样品, 加入5 mL 0.5 mol·L-1 HCl进行提取, 测定Fe(Ⅱ)含量, 加入5 mL 0.5 mol·L-1 HCl和0.25 mol·L-1盐酸羟胺, 测定总提取Fe, 采用紫外分光光度计在562 nm波长处测定[19, 20].
1.4 DNA提取及高通量测序每个土壤层样品称取0.5 g, 通过FastDNA Spin Kit(MP Biomedicals, CA, USA)提取各个样品的DNA, 用Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer(Thermo Scientific, USA)对提取的DNA进行的纯度和浓度的检测. MiSeq高通量测序分析细菌16S rRNA基因, 扩增引物采用V4/V5高变区通用引物515F(5′-GTG CCA GCM GCC GCG G-3′)/907R(5′-CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT-3′), 对各样品进行PCR扩增[21, 22].纯化的PCR样品进行Illumina MiSeq上机测序.
数据分析：通过Sickle软件(https://github.com/najoshi/sickle)去除低质量的序列; 用Mothur软件(http://www.mothur.org/wiki/Main_Page)对测序数据按照样品筛分, 然后按照Mothur软件提供的标准流程进行降噪处理, 对降噪数据进行比对分析, 最终获得底泥样品中微生物群落结构信息.
1.5 数据分析方法采用SPSS 17.0数据处理和分析; 使用单向或双向方差分析(ANOVA)来区别不同处理组样品之间的差异性; 运用皮尔逊相关分析(Pearson correlation)进一步评价数据变化的相关性; 采用Origin 9.0进行图形绘制.不同处理组之间的显著性差异水平设置为P < 0.05.
2 结果与讨论 2.1 铁氨氧化的产生本实验结果表明, 在15NH4+处理组中29N2和30N2均检出, 而在控制组中29N2和30N2均未检出(图 1).由表 1可知, 30N2的产生只可能通过铁氨氧化, 或者铁氨氧化和厌氧氨氧化共同作用, 或者铁氨氧化和反硝化共同作用, 这3个过程[9~11].在这些过程中均有铁氨氧化参与, 这说明了30N2的产生证明了铁氨氧化在河岸带的存在.
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柱状的不同的小写字母表示在不同的土壤层之间统计上有显著性差异(P < 0.05), 使用双向分差分析; 误差线表示标准误差(n=3);控制组均未检测出30N2和29N2 图 1 15NH4+处理组的30N2与29N2的产生速率 Fig. 1 Mean 30N2 and 29N2 production rates in the 15NH4+ treatments |
本研究中, 30N2的产生速率作为潜在的铁氨氧化速率.在4个不同土壤层中, 加入15NH4+的处理组均检出30N2的产生, 而在控制组中均未检出30N2的产生.与之前在热带森林土壤[大约0.32 mg·(kg·d)-1]、水稻土[0.17~0.59 mg·(kg·d)-1]以及滩涂湿地[0.24~0.36 mg·(kg·d)-1]的研究结果相比较, 本研究河岸带的铁氨氧化速率(30N2-N)在0.25~0.29 mg·(kg·d)-1之间[9~11].本研究结果表明, 30N2的产生速率在4个土壤层中有显著的差异, 这可能与三价铁含量有关以及这也可能与有机物含量有关, 并且在B土壤层[(0.29±0.02)mg·(kg·d)-1]比在其它土壤层都高[(0.25±0.02)~(0.28±0.01) mg·(kg·d)-1, P < 0.05].同样地, 29N2产生速率与30N2产生速率表现出相似的结果, B土壤层比其它3个土壤层都高(P < 0.05)[图 1(b)].在本研究中, 29N2的产生速率比30N2的产生速率高, 表明14N-NOx-和14N-NH4Cl更容易反应[9].
本研究的4个土壤层的物理化学特征见表 2.在4个土壤层中, B土壤层的三价铁含量最高, 并且铁氨氧化速率与三价铁含量有显著的相关性(r=0.862, P < 0.05).这说明丰富的铁有利于铁氨氧化的产生, 这可能是丰富的三价铁有利于铁还原菌的生长以及三价铁在铁氨氧化过程中能够作为电子受体[10, 23].同时, 有研究表明有机物腐殖质能够充当电子穿梭体促进铁氨氧化的产生[12].在本研究中, TOC含量与铁氨氧化有显著地相关性(r=0.637, P < 0.05), 这也可能进一步说明了B土壤层铁氨氧化速率最高.
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表 2 河岸带土壤的物理化学特征1) Table 2 Physicochemical characteristics of the riparian zone soil layers |
2.2 三价铁还原与氮气产生的相关性
实验结果表明, 与对照组相比, 15NH4+处理组的三价铁还原速率显著增加(图 2, P < 0.05).说明部分三价铁被还原为二价铁, 并且加入的15NH4+能够促进三价铁的还原[9, 10].在15NH4+处理组中, 三价铁还原速率在(0.223±0.005)~(0.255±0.012) g·(kg·d)-1之间, 其中B土壤层的三价铁还原速率显著地高于其它土壤层(P < 0.05).此外, 三价铁的还原与铁氨氧化密切相关.因为三价铁在铁氨氧化过程中作为电子受体, 并且三价铁的利用有利于铁还原菌的生长[10].王伟民等[24]通过对水稻土中铁还原菌的分离纯化的研究表明铁还原菌的生长与三价铁还原具有耦合关系.
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柱状上不同的小写字母表示同一处理在不同的土壤层之间统计上有显著性差异(P < 0.05), 使用双向分差分析; 误差线表示标准误差(n=3) 图 2 通过同位素示踪培养的三价铁还原速率 Fig. 2 Fe(Ⅲ) reduction rates measured through isotope tracer incubations |
此外, 三价铁还原速率与30N2的产生速率有显著的正相关(r=0.864, P < 0.001), 这进一步表明铁氨氧化的发生在河岸带区域(图 3).在4个土壤层中三价铁的还原并不是全部来自于铁氨氧化, 根据铁氨氧化速率按照理论比例计算, 大约1.18%~1.30%三价铁还原与铁氨氧化相关, 其余的三价铁还原可能涉及有机物和其它还原物质的氧化[12, 25].
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图 3 在15NH4+处理组中三价铁还原速率与30N2和29N2的相关性 Fig. 3 Pearson's correlation between the iron reduction rates and the 30N2 and 29N2 production rates in the 15NH4+ treatment |
Peng等[26]的研究结果表明, 铁还原菌存在的门级别有变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、螺旋体门(Spirochaetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、放线菌门(Actinobacteria)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)和蓝细菌门(Cyanobacteria).在本研究的4个土壤层中, 铁还原菌存在的门级别有变形菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、放线菌门、硝化螺旋菌门和蓝细菌门(图 4).其中, 变形菌门(Proteobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)在4个土壤层中作为主要的铁还原菌存在的门.在A、B、C和D这4个土壤层中, 铁还原菌存在的门所占的比例分别为70.3%、75.5%、65.5%和62.3%.
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图 4 在4个不同土壤层的微生物群落门级别分类的相对丰度 Fig. 4 Relative abundances of the phyla identified in the four different soil layers |
Zhou等[12]在水稻土的研究结果表明, 主要的铁还原菌属是地杆菌属(Geobacter)、厌氧黏细菌(Anaeromyxobacter)、脱硫芽孢弯曲菌属(Desulfosporosinus)和土发菌属(Geothrix).在本研究中, 主要的铁还原菌属是地杆菌属和厌氧黏细菌(图 5).地杆菌属(Geobacter)的丰度从最低的C土壤层(3.17%)到最高的B土壤层(5.03%), 并且B土壤层显著比其它土壤层高(P < 0.05).厌氧黏细菌(Anaeromyxobacter)的丰度从最低的A土壤层到最高的B土壤层.与其它土壤层相比, 在B土壤层中铁还原菌(Anaeromyxobacter和Geobacter)的丰度增加了4%~4.3%.这可能是在B土壤层有丰富的三价铁, 进而有利于铁还原菌生长.有研究表明, 铁还原菌通过影响三价铁的还原在铁氨氧化过程中扮演重要角色[10]. Li等[10]报道了在滩涂湿地中30N2的产生速率与地杆菌属(Geobacter)的丰度显著相关.这可能解释了为什么较高的铁氨氧化速率或者铁还原速率伴随着较高丰度的铁还原菌.尽管铁氨氧化的功能菌目前还不能直接鉴别, 但是铁还原菌与铁氨氧化的关系可能证明铁还原菌在铁氨氧化发生的重要性.
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柱状上不同的小写字母表示在同一种属不同的土壤层之间统计上有显著性差异(P < 0.05) 图 5 4个不同处理组的主要的铁还原菌属的相对丰度 Fig. 5 Relative abundances of the main iron-reducing bacterial genera identified in the four different soil layers |
(1) 本研究通过同位素示踪技术和膜接口质谱仪(MIMS)测定了河岸带4个土壤层的N2产生速率, 均检测到30N2的产生, 证明了河岸带铁氨氧化的存在.
(2) 通过测定30N2的产生速率来测定潜在的铁氨氧化速率.本研究的铁氨氧化速率在0.25~0.29 mg·(kg·d)-1之间, 其中5~10 cm土壤层的铁氨氧化速率显著地高于其它层(P < 0.05).
(3) 本研究表明了铁氨氧化与三价铁还原有显著的正相关关系(r=0.864, P < 0.001), 同时表明丰富的三价铁有利于铁还原菌生长, 促进铁氨氧化的产生.
(4) 通过高通量16S rRNA基因扩增序列(Illumina MiSeq平台)测定了铁还原菌的多样性.结果表明铁还原菌通过影响三价铁还原在铁氨氧化过程中起着重要作用.同时, 在5~10 cm土壤层中铁还原菌(Anaeromyxobacter和Geobacter)的丰度最高.
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