我国是全球抗生素药物生产和使用大国^[1].据统计^[2], 我国2013年抗生素使用量高达16.2万t.由于抗生素的大规模使用甚至滥用, 造成大量残留物及其代谢产物进入生态环境^[3~6].越来越多的研究报道^[7~9], 抗生素是造成细菌抗药性迅速演变和散播的主要原因, 而抗生素抗性基因(ARGs)作为一种新型污染物^{[10, 11]}, 已在不同环境介质中被频繁检出^{[1, 12~16]}.污水处理剩余污泥是ARGs的一个重要储存库^[17], 近年来发现在污泥资源化土地利用过程中会造成ARGs的广泛散播^[18].因此, 如何有效地削减污泥中ARGs存在水平, 是控制其在污泥土地利用过程中散播的关键问题.

厌氧消化是目前国内外污泥安全处置的主流工艺^[19], 已有研究报道针对其过程参数对ARGs的去除变化影响进行了相关探讨^[20~22].前期研究结果表明^[23], 在剩余污泥和餐厨废物组成的联合厌氧消化反应体系中, 零价铁(Fe⁰)的加入不仅可以加快反应进程, 且能够促进四环素抗性基因(TC-ARGs)和第一类整合子intI1基因的削减.尽管如此, 研究同时发现^[24], 核糖体保护基因tetM、tetO和tetW丰度在厌氧消化过程中出现反弹现象, 推测可能是由于基因水平转移过程的发生所造成的, 但具体原因还有待进一步研究.

目前, 质粒DNA接合作用、胞外DNA转换作用和噬菌体DNA转导作用是ARGs在细菌微生物之间水平转移的主要机制, 其中质粒DNA接合作用被认为对ARGs的散播起着最为关键的作用^[25].因此, 本研究考察了不同Fe⁰投加量对污泥厌氧消化过程中TC-ARGs和intI1基因丰度的消长影响, 分析了质粒DNA接合作用对TC-ARGs水平转移过程的作用影响, 并探讨了intI1基因与TC-ARGs之间的相关关系, 通过掌握TC-ARGs在污泥厌氧消化过程中的内在演变过程, 以期为其强化削减提供理论基础和技术支撑.

本研究所使用的实验药品均为分析纯, 除厌氧指示剂购自美国Sigma-Aldrich公司外, 其余购自国药集团化学试剂有限公司.

厌氧培养液组成如下(g·L^-1)：KCl 1.3, KH₂PO₄ 0.2, CaCl₂·2H₂O 0.1, MgCl₂·6H₂O 0.18, NaCl 1.17, NH₄Cl 0.5, NaHCO₃ 2.5, 以及1 mL质量浓度为1 g·L^-1的厌氧指示剂溶液和1 mL微量盐溶液.

厌氧指示剂溶液的配置：称取1 g厌氧指示剂溶于1 L超纯水.

微量盐溶液组成如下(g·L^-1)：MnCl₂·4H₂O 0.5, CoCl₂·6H₂O 0.03, NiCl₂·6H₂O 0.01, ZnCl₂ 0.05, H₃BO₃ 0.05, CuCl₂ 0.5, NaMoO₄·2H₂O 0.05.

接种污泥取自上海松江污水处理厂二沉池剩余污泥, VSS质量浓度约为8.00 g·L^-1±0.26 g·L^-1.污泥厌氧消化反应器采用容积为250 mL血清瓶, 接种污泥加入量为100 mL, 同时加入100 mL厌氧培养液, 然后使用高纯氮气吹脱5 min.厌氧反应器共设两批平行装置, 每批共有5组, 分别标记为AD-0、AD-1、AD-2、AD-3和AD-4, 每组设置6个血清瓶, 其中AD-0为对照组, 其余4组投加Fe⁰(10~40 μm), 加入量(以Fe⁰/VSS计, 下同)分别为0.15 g·g^-1(AD-1)、0.25 g·g^-1(AD-2)、1.00 g·g^-1(AD-3)和3.75 g·g^-1(AD-4).将所有厌氧反应器置于恒温摇床内(SPH-1102C, 上海世平实验设备有限公司), 避光, 控制摇速为120 r·min^-1, 反应温度为55℃±1℃, pH为7.2~7.8(S220, Mettler Toledo).污泥厌氧消化反应周期为35 d, 每隔7 d进行采样检测分析.

基因组DNA提取：按照预设采样时间, 采集一定量的泥水混合物在4℃和6 000 r·min^-1下离心10 min, 倒去上清液, 收集沉淀物.采用TIANamp Soil DNA Kit(TIANGEN)对基因组DNA进行提取, 提取步骤参照试剂盒操作说明书, 所提取的DNA使用1%琼脂糖凝胶电泳和Qubit 2.0核酸蛋白测定仪(Invitrogen)检测其纯度和浓度.

质粒组DNA提取：采用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)从基因组DNA中提取质粒组DNA, 并使用Plasmid-Safe^TM ATP-Dependent DNase(Epicentre)对其进行纯化, 以确保其纯度.

采用qPCR(LightCycler^® 96, Roche)对目标基因进行定量检测分析, 各目标基因所用扩增引物序列、扩增子大小、退火温度、反应体系及反应程序详见文献[23, 24].利用熔解曲线(65~95℃, 每0.5℃读数)分析扩增产物的特异性, 从而优化qPCR反应条件和引物浓度, 消除引物二聚体和非特异性扩增的干扰影响.每组样品设3个平行样, 并使用无菌水作为阴性对照.

采用Origin 8.5软件进行数据处理, 并利用SPSS 22.0软件进行统计学分析, 设定统计检验显著性水平P=0.05, 若P < 0.05认为具有显著相关性, 反之则认为相关性不显著.

图 1为目标TC-ARGs和intI1基因丰度在污泥厌氧消化过程中的变化情况.从中可以看出, 在整个反应周期35 d内, AD-0反应器中所有TC-ARGs丰度均得到一定程度的削减, 其中tetX基因降幅最大, 达2.4个数量级, 而tetM基因降幅最小, 基本无去除效果.此外, 不同抗性机制的TC-ARGs在污泥厌氧消化过程中的变化特征各有差异, 其中外排泵基因(tetA、tetC和tetG)和酶修饰基因(tetX)降幅较大, 达1.0~2.4个数量级; 相比之下, 核糖体保护基因(tetM、tetO和tetW)削减效果较差, 最大降幅约为0.8个数量级(tetW), 这与前期研究结果相似^[23], 且tetM和tetO基因丰度在整个反应周期内呈现出先降低后升高的变化趋势, 表明污泥厌氧反应时间的延长不利于其有效削减. Ma等^[26]的研究同样发现, tetC、tetG和tetX基因丰度随着污泥停留时间的延长而显著降低, 而tetW基因丰度相比初始时更高.与此同时, 除tetO和tetX基因外, 其余TC-ARGs丰度在厌氧消化反应初期(7 d)先升高(图 1), 而后呈现逐渐降低的趋势, 这可能是由于TC-ARGs发生水平转移, 或携带有TC-ARGs的细菌微生物在消化反应初期处于增长期所造成的^[27], 这在后续章节将进一步探讨.随着厌氧反应过程的继续进行, TC-ARGs(除tetC和tetG外)到第21 d时已基本降至最低并维持稳定.前期研究结果显示^[23], TC-ARGs在污泥厌氧消化周期8 d内呈现逐渐降低的趋势, 这与本研究结果有所不同, 分析原因推测可能是因为厌氧反应底物的不同所导致的, 前期研究中采用的反应底物为餐厨垃圾和剩余污泥的混合体系, 餐厨垃圾一定程度上可以稀释剩余污泥中的有毒成分, 均衡厌氧微生物对营养物质的需求, 提高消化效率, 促进消化反应快速达到稳定^{[28, 29]}.

图 1

Fig. 1

图 1 污泥厌氧消化过程中TC-ARGs和intI1基因丰度变化特征 Fig. 1 Quantities of TC-ARGs and intI1 genes during anaerobic sludge digestion process

此外, 由于整合子基因能够捕获外源性基因, 通过转座子或接合性质粒进行ARGs的水平转移传播^[30], 因此本研究同样检测了intI1基因在污泥厌氧消化过程中的变化行为.由图 1可知, intI1基因在接种污泥中的丰度高于TC-ARGs, 达7.43×10⁸ copies·g^-1, 与大部分TC-ARGs变化特征类似, intI1基因丰度在反应初期先升高, 而后逐渐降低, 尽管在整个反应周期内降幅达1.8个数量级, 但其削减过程并不显著(P=0.15), 表明intI1基因在污泥厌氧消化过程中相对稳定, 对ARGs水平转移的发生可能具有潜在的促进作用.

Fe⁰是一种性能优异的还原物质, 近年来已被尝试用于强化污泥厌氧消化进程^[31], 并已证实其能够促进有机物水解、原位产氢和产甲烷等有益效果^[32].有研究报道^[33], Fe⁰暴露能够导致小鼠肠道细菌微生物群落中tetM、tetO和tetQ基因丰度的变化.前期研究结果表明^[23], 一定投加量的Fe⁰能够增强TC-ARGs和intI1基因的削减效果.然而, 本研究结果发现, 随着Fe⁰投加量的增大, 尽管污泥厌氧消化过程产物VFAs产量相应升高(数据未列出), 但TC-ARGs和intI1基因丰度降幅却相应减小, 尤其当Fe⁰投加量为3.75 g·g^-1时, TC-ARGs中外排泵基因、核糖体保护基因和酶修饰基因丰度的降幅分别仅为0.09~0.31、0.08~0.45和0.77个数量级, intI1基因降幅也仅为0.60个数量级(图 1).此外, Fe⁰的加入除在厌氧消化反应初期(7 d)对TC-ARGs和intI1基因丰度具有小幅度削减效果外, 随着厌氧反应的持续进行, TC-ARGs和intI1基因丰度整体上呈现增长的趋势, 推测可能是因为Fe⁰在促进污泥厌氧反应进程的同时能够强化TC-ARGs的水平转移, 且总体上随着Fe⁰加入量的增大而呈现加强的趋势.与此同时, 厌氧消化接种底物类型和反应周期的差异同样会影响TC-ARGs丰度的变化行为, 这可能也是导致本研究与前期研究结果有所不同的重要因素.

根据2.2节结果分析推测, Fe⁰能够促进污泥厌氧反应过程中TC-ARGs的水平转移, 因此本研究检测了质粒组DNA中TC-ARGs和intI1基因丰度在污泥厌氧消化过程中的变化情况, 如图 2所示.

图 2

Fig. 2

图 2 污泥厌氧消化过程质粒组DNA中TC-ARGs和intI1基因丰度变化特征 Fig. 2 Quantities of TC-ARGs and intI1 genes carried by plasmid DNA during anaerobic sludge digestion process

从图 2中可以看出, 质粒组DNA中TC-ARGs和intI1基因丰度变化趋势与基因组DNA相类似.在整个反应周期35 d内, AD-0反应器中所有TC-ARGs和intI1基因丰度均得到不同程度削减, 其中外排泵基因、核糖体保护基因和酶修饰基因丰度降幅分别为1.3~2.9、0.7~1.2和2.6个数量级, 而intI1基因降幅约为1.9个数量级, 表明污泥厌氧消化过程能够有效地削减质粒组DNA中TC-ARGs和intI1基因丰度, 这可能与质粒组DNA本身质量浓度的显著削减有关(降幅达82.5%).此外, 不同Fe⁰投加量对质粒组DNA中TC-ARGs和intI1基因丰度的变化影响不尽相同.随着Fe⁰投加量的增大, TC-ARGs中外排泵基因和酶修饰基因, 以及intI1基因丰度削减幅度基本呈现出逐渐降低的趋势, 特别是在Fe⁰投加量为3.75 g·g^-1时, 其降幅分别约为0.02~0.6、0.8和0.8个数量级.相比之下, Fe⁰的加入对核糖体保护基因丰度的作用影响较小, 表明其在污泥厌氧消化过程中存在较为稳定.

由上述分析可知, Fe⁰对污泥厌氧消化过程质粒组DNA中TC-ARGs的散播和转移具有促进作用, 分析原因推测可能是因为Fe⁰在厌氧环境中会转化为Fe(OH)₂^[32], 其良好的絮凝性能可以促使污泥絮体结合更加紧密, 增强污泥微生物细胞之间的相互接触, 从而强化TC-ARGs的水平转移.此外, Fe⁰的加入能够显著提高VFAs的产生量^{[23, 31]}, 降低反应体系pH值, 同样可能会促进污泥厌氧反应过程中TC-ARGs的水平转移^[20].

由于整合子基因能够促进外源性基因的获得和表达, 并通过可移动遗传因子、质粒和转座子等在细菌群落之间进行传播^[29].从表 1数据分析可知, 在AD-0反应器中, intI1基因与TC-ARGs之间均存在显著正相关性(P < 0.05), 表明污泥厌氧消化过程中intI1基因与TC-ARGs的变化行为密切相关.此外, intI1与tetG基因在所有反应器中均具有显著正相关性(P < 0.05), 表明intI1基因对tetG基因的演变特征具有重要影响, 这与前期研究结果是一致的^[24]. Zhang等^[22]的研究同样发现, 污泥与食品垃圾联合厌氧消化过程中intI1和tetG基因之间显著相关.相比之下, 在Fe⁰存在时, intI1与tetM基因之间相关性较差, 这可能是因为除质粒DNA转移作用外, 胞外DNA转换作用和噬菌体DNA转导作用对污泥消化过程中tetM基因的水平转移具有重要影响, 这有待后期进一步深入研究.

表 1 (Table 1)

表 1 污泥厌氧消化过程中TC-ARGs与intI1基因相关性分析1) Table 1 Correlation analysis between quantities of TC-ARGs and intI1 gene in anaerobic sludge digestion process 目标基因 基因组DNA 质粒组DNA Fe0投加量/g·g-1 0 0.15 0.25 1.00 3.75 0 0.15 0.25 1.00 3.75 tetA r 0.985 0.967 0.926 0.795 0.609 0.859 0.981 0.955 0.882 0.722 P 0.000 0.002 0.008 0.059 0.200 0.028 0.001 0.003 0.020 0.105 tetC r 0.995 0.960 0.909 0.863 0.768 0.983 0.967 0.980 0.995 0.959 P 0.000 0.002 0.012 0.027 0.074 0.000 0.002 0.001 0.000 0.002 tetG r 0.998 0.978 0.967 0.874 0.948 0.975 0.991 0.978 0.927 0.888 P 0.000 0.001 0.002 0.023 0.004 0.000 0.000 0.001 0.008 0.018 tetM r 0.814 0.095 0.474 0.610 0.239 0.909 0.802 0.672 0.979 0.454 P 0.049 0.858 0.342 0.199 0.648 0.012 0.055 0.144 0.001 0.366 tetO r 0.887 0.827 0.900 0.841 0.842 0.864 0.924 0.861 0.906 0.791 P 0.018 0.042 0.014 0.036 0.035 0.026 0.008 0.028 0.013 0.061 tetW r 0.959 0.929 0.982 0.811 0.721 0.850 0.985 0.725 0.942 0.521 P 0.003 0.007 0.000 0.050 0.106 0.032 0.000 0.103 0.005 0.289 tetX r 0.901 0.936 0.969 0.951 0.938 0.957 0.959 0.959 0.974 0.801 P 0.014 0.006 0.001 0.004 0.006 0.003 0.003 0.002 0.001 0.056 1)粗体字表示具有显著相关性(P < 0.05)

表 1 污泥厌氧消化过程中TC-ARGs与intI1基因相关性分析1) Table 1 Correlation analysis between quantities of TC-ARGs and intI1 gene in anaerobic sludge digestion process

(1) 目标TC-ARGs和intI1基因丰度在污泥厌氧消化过程中均呈现出不同程度的降低趋势, 但不同抗性机制的TC-ARGs变化特征有所差异, 其中核糖体保护基因tetM、tetO和tetW的存在相对稳定.

(2) Fe⁰的加入虽然能够强化污泥厌氧消化反应进程, 但对TC-ARGs和intI1基因丰度削减影响不显著, 且随着Fe⁰投加量的增加, 目标基因丰度反而出现升高的趋势.

(3) Fe⁰对污泥厌氧消化过程质粒组DNA中TC-ARGs和intI1基因丰度消长变化特征与基因组DNA相类似, 表明Fe⁰对质粒DNA接合转移TC-ARGs具有一定促进作用.

(4) 由相关性分析结果可知, 所有反应器中tetG和intI1基因之间均具有显著正相关关系, 表明intI1基因在污泥厌氧消化过程中对tetG基因的演变行为具有重要影响.