2018, Vol. 39
2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
自1928年被发现以来, 抗生素使用量逐年增加, 现已被认为是一种新兴有机污染物并引起广泛关注[1~3].氧四环素(oxytetracycline, OTC)作为一种重要的广谱性抗生素, 被广泛应用于畜牧养殖业, 但由于其过度使用, 加之约30%~90%的抗生素活性成分难以被机体代谢, 因此每年通过尿液等排放到环境中的OTC及其活性成分极其巨大[4], 已广泛进入地表水、地下水、饮用水和底泥沉积物等环境媒介[5, 6].但是, 传统废水处理方法难以有效去除残留于环境中的OTC[7]. OTC不仅会长期存在于环境中对生态系统产生直接的破坏, 也会加速微生物产生抗药性和抗性基因等污染问题[8].因此, OTC等抗生素污染的有效处理已成为当今环境研究领域的一个热点.
生物电化学系统(bioelectrochemical systems, BESs), 包括微生物燃料电池(microbial fuel cells, MFCs)和微生物电解池(microbial electrolysis cells, MECs), 是一种耦合微生物和电化学氧化还原的环境友好的污染物高效处理技术, 在处理染料、重金属、高氯酸盐等众多难处理污染物方面均取得显著效果[9~11].近年来, 该技术被应用于抗生素污染物去除研究, 且抗生素去除效率和速率均显著高于仅使用微生物的反应器, 揭示了BESs作为一种更高效、可行的抗生素处理新方法的潜力[12~17]. Wen等[18, 19]利用单室空气阴极分别处理含头孢曲松钠和盘尼西林废水发现, 单室空气阴极在24 h对50 mg·L-1头孢曲松钠和50 mg·L-1盘尼西林的去除率达到91%和98%, 并且反应器产电能力相比于仅添加葡萄糖作为底物有较大幅度提高; Guo等[20]的研究发现, 双室MFC在96 h对10 mg·L-1磺胺去除率达到90%, 但MFC的产电能力随着抗生素浓度的增大而减小.目前的研究更多关注抗生素对BESs性能的影响, 较少关注在长期运行过程微生物群落的变化, 并且目前没有文献报道MFC对OTC这一重要抗生素污染物的去除及其关键功能菌群演替变化的研究, 而深入了解功能菌群对处理含抗生素废水工艺的快速启动具有重要意义.
因此, 本研究利用MFC处理OTC, 研究OTC在不同运行时期的去除率变化及电压输出变化, 并利用扫描电镜观察阳极生物膜的构建, 通过高通量测序技术分析并比较原始接种猪粪与运行150 d后阳极生物膜微生物群落的组成, 探究在长期处理OTC中发挥作用的关键功能菌群, 以期为利用BESs处理含OTC废水提供理论基础.
1 材料与方法 1.1 试剂与药品氧四环素(纯度＞95%)购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司, 盐酸土霉素标准品购买于德国Dr. Ehrenstorfer公司, 戊二醛购买于Sigma-Aldrich公司, 色谱级乙腈和甲醇购买于德国默克公司, 其它试剂为分析纯, 购买于国药集团化学试剂有限公司.
1.2 溶液配制OTC母液(1.0 g·L-1)：精确称取1.0 g OTC药品, 利用甲醇溶液溶解并定容于1 000 mL容量瓶, 而后分装于棕色储样瓶, 置于-20℃冰箱避光保存, OTC母液每月更换.
人工废水：50mmol·L-1磷酸钠缓冲溶液(pH=7.0), 1.0 g·L-1乙酸钠, 微量金属元素溶液和维生素溶液, 磷酸钠缓冲溶液、金属元素溶液和维生素溶液的具体配方参考文献[21, 22].
含OTC(10 mg·L-1)人工废水：50mmol·L-1磷酸钠缓冲溶液(pH=7.0), 加入10 mL OTC母液并定容至1 000 mL容量瓶使OTC终浓度为10 mg·L-1, 微量金属元素溶液和维生素溶液, 具体配方同上.
1.3 MFC反应器的构建与运行采用亚克力板构建双室MFC反应器, 其中阴、阳极室为立方体结构(7.0 cm×5.0 cm×4.0 cm), 阳极室和阴极室由质子交换膜(浙江千秋环保水处理公司, 中国)分隔, 阴阳极由三层碳毡(4.0 cm×4.0 cm×0.2 cm/每片, 甘肃郝氏炭纤维有限公司, 中国)组成, 三层碳毡间依靠钛丝(直径为1 mm, 上海贵钛金属材料有限公司, 中国)连接并固定, 阴阳两极负载外阻为500 Ω的电阻.利用Keithley2700(吉时利仪器公司, 美国)记录MFCs的电压输出变化情况.
阳极室的接种源为猪粪的上清液, 其中猪粪采集自中国厦门市翔安区乐山农场, 阴极液为50 mmol·L-1铁氰化钾溶液.本实验总计6个月, 分为两个阶段：①利用乙酸钠为底物建立MFCs生物膜阶段和②利用OTC作为唯一底物驯化MFCs生物膜阶段.在利用乙酸钠为底物建立MFCs生物膜的阶段①, 阳极液为含1 g·L-1乙酸钠人工废水, 当MFCs多次重新换液后电池电压迅速达到620 mV左右, 则表示MFCs阳极生物膜建立成功, 此时人工废水替换为以10 mg·L-1OTC作为唯一碳源的人工废水, 进入利用OTC作为唯一底物驯化MFCs生物膜阶段②.在阶段②, 每个运行周期定时采集MFC出水样品并将样品过0.22μm微孔滤头(天津市津腾实验设备有限公司).在运行150 d后, 每12 h采集MFC出水样品并将样品过0.22μm微孔滤头检测OTC浓度变化.无菌对照组是在每次实验前将碳毡放置高温灭菌锅灭菌后进行实验. MFC与无菌对照组均设置3个生物学平行.所有的反应器均放置在生化培养箱(LRH-500 F型, 上海齐欣科学仪器有限公司, 中国)闭光运行, 运行温度控制在35℃±2℃.
1.4 高效液相色谱测定OTC方法利用高效液相色谱仪(L-2000, 日立公司, 日本)测定OTC浓度变化, 色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse plus C18(4.8×250 mm, 5 mm), 柱温为30℃, 流速为1 mL·min-1, 检测波长为278 nm.流动相：A相为0.014 mol·L-1乙二酸溶液, B相为乙腈溶液, C相为甲醇溶液.等度洗脱程序如下：0~8 min, 流动相A、B和C的比例分别为72%、18%和10%.流动相在使用前均过0.44 μm混合纤维素酯膜(上海半岛实业有限公司净化器材厂)并利用超声脱气30 min.
1.5 微观形貌观察的样品制备将接种猪粪和阳极生物膜分别放在含2.5%戊二醛的0.1 mol·L-1磷酸钠缓冲液中, 置于4℃冰箱过夜固定后再二次固定30 min; 将固定好的样品利用不同梯度乙醇溶液逐步脱水：30%30%50%70%90%95%100%100%, 每次脱水10 min; 将脱水好的样品临界干燥4~6 h后喷金, 最后利用场发射扫描电子显微镜(S4800, 日立公司, 日本)观察并采集照片.
1.6 DNA提取与高通量测序分析本实验收集原始接种猪粪和以OTC为唯一底物运行150 d后的3个MFC阳极生物膜样品, 分别记为PRM、MFC1、MFC2和MFC3.对样品冷冻干燥后, 依据生产商使用说明, 利用FastDNA® SPIN Kit for Soil(MP生物医疗公司, 美国)试剂盒进行总DNA提取.
PCR反应仪器为美国ABI GeneAmp® 9700型, 采用的引物为338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG和806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT.具体的反应体系与PCR仪参数详见文献[17].最后, 将所获得的PCR产物送至上海美吉医药公司Illumina MiSeq平台进行测序分析.对测序所得序列提取非重复序列, 并去除没有重复的单序列, 按照97%相似性对非重复序列进行OTU聚类, 而后采用RDP classifier贝叶斯算法对所得到的OTU代表序列进行分类学分析, 并在门、属水平统计每个样品的群落组成.
2 结果与讨论 2.1 MFC对OTC去除效果图 1(a)为不同运行时期, OTC在MFC中运行5 d内去除率的变化情况.从中看出, 在以OTC为唯一底物运行的前30 d, MFC对OTC的去除效果低于20%.比较阶段①与②发现, 在阶段①, 生物膜构建成功后, MFC的电压响应迅速且输出最大值为0.62 V[图 1(b)], 并且MFC的出水具有臭味且含有大量悬浮微生物.进入阶段②以后, MFC的输出电压急剧下降, 而阳极室出水变得无臭且清澈, 说明OTC作为一种广谱性抗生素, 对阳极室微生物活性具有很强的抑制作用, 且OTC难以被微生物作为底物直接利用.随着运行时间的延长, MFC对OTC的去除率逐步提高, 运行70 d后OTC去除率为39.59%, 在运行112 d后OTC去除率达到了95.0%以上, 同时MFC的电压输出也开始恢复, 最大值达到0.55V左右, 并且MFC的出水发臭且悬浮微生物开始逐渐增多, 碳毡电极表面出现大量气泡, 说明阳极室内的微生物逐渐适应了OTC的胁迫, 能够以OTC为唯一碳、氮源进行新陈代谢, 从而实现MFC对OTC的高效去除.
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图 1 不同运行时期, MFC对OTC去除率及电压输出变化 Fig. 1 Change in removal efficiency of OTC and voltage output in MFCs |
图 2为MFC运行150 d后, 在1个运行周期内MFC组和无菌对照组中OTC的浓度变化情况.在无菌对照组中, 10 mg·L-1 OTC的浓度在132 h并未出现较大变化, 说明OTC具有较稳定的化学结构, 在没有光照、微生物等作用下, 自身降解十分缓慢.但经过150 d序批式运行, MFC对10 mg·L-1 OTC在132 h去除率达到99.0%, 说明MFCs实现了对OTC的快速、有效去除.
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图 2 运行150 d后在1个运行周期内MFC对OTC的去除 Fig. 2 Change in concentration of OTC in MFCs after 150 d of operation |
在长期运行后, MFC对OTC的有效去除与阳极生物膜的作用密不可分, 因此利用扫描电镜观察并比较了接种猪粪及MFC阳极生物膜的形貌特征(图 3).如图 3(a)所示, 作为接种源的猪粪样品中以球状和杆状微生物居多, 但是微生物多被未消化的纤维素等物质包裹住.从图 3(b)看出, 大量的微生物生长于电极碳毡上面, 短杆菌占据较高比例, 微生物之间形成大量的丝状结构物质, 这些结构类似于文献报道的“纳米导线”结构, 与微生物间的电子传递有关.大量的微生物附着于碳毡, 在胞外聚合物包裹之下形成了紧密的生物膜结构, 这种结构有利于微生物间的物质、信息和能量的快速传递, 为快速处理OTC废水提供了有力的保障.
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(a)接种猪粪, (b)阳极生物膜 图 3 接种猪粪与阳极生物膜电镜照片 Fig. 3 SEM photos of raw pig mature and anodic biofilms |
利用高通量测序方法研究在接种猪粪与150 d运行后的MFCs阳极生物膜上微生物群落丰富度与多样性的变化.由表 1可知, 4个样品得到的有效序列在33 000~40 000条之间, 均大于20 000条序列, 有效OTU数目共计611条, 并且4个样品的覆盖率都超过0.999, 说明本次测序的深度基本覆盖了样本中的所有物种, 即该结果反映了样本物种的真实情况.
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表 1 不同样品的微生物群落丰富度与多样性统计 Table 1 Community richness and diversity indices for all samples |
由表 1对各样本的α多样性统计可知, 对于指示样本物种丰富度的Chao1和ACE指数, MFC1、MFC2和MFC3样本均低于RPM样本, 说明接种猪粪中的物种丰富度最高, 这可能与底物种类有关, 猪进食的物质碳源复杂丰富, 故菌群中含有多种不同功能的微生物, 而当底物转换为以OTC为唯一碳源, 特定功能菌群发生变化导致丰富度下降.对于Shannon和Simpson指数而言, 二者变化规律相同, 其中接种猪粪的Shannon和Simpson指数分别为3.215 996和0.099 941, 而MFC样本的Shannon指数下降至2.21~2.90之间, Simpson指数则均增高至0.13以上, 说明在OTC的长期胁迫下, MFC中的群落多样性开始下降.以上结果均说明在以OTC为唯一碳、氮源的情况下, 随着运行时间的延长, 微生物群落中的物种会向特定功能群落演化, 从而导致物种丰富度和多样性的下降.
2.4 微生物群落结构变化分析图 4是接种猪粪及在经过OTC驯化150 d后的生物膜上微生物群落在门水平下的组成分布情况.从中看出, 在接种猪粪样品中, 主要由厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、螺旋菌门(Spirochaetae)和变形菌门(Proteobacteria)组成, 其中厚壁菌门(Firmicutes)所占比例最大(79.30%), 而变形菌门(Proteobacteria)的比例最小(2.84%).在阳极生物膜样品中, 厚壁菌门(Firmicutes)的数量也占据优势地位(66.20%~84.26%), 但是螺旋菌门(Spirochaetae)和拟杆菌门(Bacteroidetes)大量减少, 同时放线菌门(Actinobacteria)的数量有所上升, 变形菌门(Proteobacteria)的比例则大幅提高至8.92%~22.75%. Kiely等[23]的研究表明, 厚壁菌门在以乙酸和乙醇等简单有机物作为底物时所占比例极小或没有, 而当底物更换为乳酸等复杂有机物作为碳源时, 其常为优势种群, 可见厚壁菌门在降解转化复杂污染物质方面具有一定的优势.原始猪粪中富含有大量纤维素等复杂底物, 故变形菌门占据优势地位, 这与焦燕等[24]发现长期以牛粪为底物时, 变形菌门为MFC阳极的优势菌门的结果相一致. OTC是一种具有十二氢化并四苯基本结构的抗生素, 结构稳定且复杂, 在以其为唯一底物时, 厚壁菌门仍为优势菌门.变形菌门是细菌中最大的一门, 常在处理抗生素污染的系统中发现其处于优势地位. Liang等[12]利用生物阴极强化氯霉素的降解时发现, α-、β-和γ-Proteobacteria在阴极生物膜上占据优势地位.而Xia等[25]利用缺氧/好氧膜生物反应器处理OTC、四环素和磺胺甲恶唑等多种抗生素也发现β-和γ-Proteobacteria属于优势菌门, 可见变形菌门对抗生素污染物起到了一定的降解转化作用, 这与本研究发现在以OTC为唯一碳源下, 阳极生物膜中变形菌门比例增高的结果相一致.
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图 4 微生物群落门水平柱形图 Fig. 4 Barplot analysis of microbial communities on phylum level of raw pig mature and anodic biofilms |
图 5是原始猪粪及在经过OTC驯化150 d后的生物膜上微生物群落在属水平下的热图.从中看出, Geobacter、Xanthobacter和Gordonia等菌属丰度相比于原始接种猪粪均有提高. Geobacter是一类电化学活性的菌, 在MFC电刺激的作用下出现一定富集.而真细菌属(Eubacterium spp.)的比例显著提高, 从0.004 1%提高至20.49%~49.00%.可见真细菌属菌群对OTC的降解起到重要作用. Qiu等[26]使用混合上流式厌氧污泥床-膜生物反应器(UASB-MBR)处理含黄连素抗生素废水, 发现Eubacterium在上流式厌氧污泥床中为优势菌属, 从OTC和黄连素二者的结构式比较发现存在一定的相似性, 均具有多个苯环相连.此外Schneider等[27]发现1株Eubacterium ramulus具有α-和β-d-葡萄糖苷酶活性, 能够降解橡黄素、木樨草素和圣草酚等多种黄酮类药物. Wang等[28]分离得到1株Eubacterium sp. Strain SDG-2, 能够在芳香环上的进行脱羟基作用, 且能够断开儿茶素的C和B环从而使其降解.可见, Eubacterium sp.中的一些纯菌对多种氧杂环芳香族化合物具有一定的生物降解能力, 而从结构式分析, OTC也是一种含有多羟基的杂环化合物, 故结合本研究结果, Eubacterium spp.是一类具有降解OTC的功能微生物菌属, 故其在以OTC为唯一底物时, 占据优势地位.
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图 5 微生物群落属水平热图 Fig. 5 Heatmap of microbial communities on genus level of raw pig mature and anodic biofilms |
(1) 经过一定时间的生物膜驯化, MFCs能够实现OTC的有效去除.在运行150 d后, MFC对10 mg·L-1OTC在132 h内的去除率达到99.0%, 表明利用MFC去除含OTC污废水是完全可行的.
(2) 通过对群落丰富度与多样性研究可知, 在MFC中, 长期地以OTC为唯一底物运行会降低阳极微生物群落的丰富度与多样性.对群落组成分析可知, Eubacterium spp.可能是一类具有较强OTC降解能力的功能微生物, 为后期分离纯化高效OTC降解菌株和工业废水处理快速启动等提供了科学依据.
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