2018, Vol. 39
2. 中国科学院大学, 挥发性有机物污染控制材料与技术国家工程实验室, 北京 101408;
3. 中持水务股份有限公司, 北京 100192
2. National Engineering Laboratory for VOCs Pollution Control Material & Technology, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 101408, China;
3. CSD Water Service Company, Beijing 100192, China
在污水厌氧处理以及垃圾填埋过程中, 有大量的甲烷生成[1].甲烷是重要的温室气体, 其温室效应是二氧化碳的26倍[2].甲烷氧化是自然界中甲烷减少的重要途径之一[3].海底沉积物[4]、水稻田土壤[5]、湿地底泥[6]等生境中存在氧化甲烷的微生物.Raghoebarsing等发现[7], 甲烷厌氧氧化可以协同硝酸盐还原, 在这个过程中甲烷氧化为二氧化碳, 硝酸盐和亚硝酸盐转化为氮气.并且获得了甲烷厌氧氧化的微生物菌群.参与甲烷氧化和硝酸盐还原作用的微生物包括隶属于NC10菌门的细菌[8]和甲烷氧化古菌(anaerobic methanotrophic archaea, ANME)ANME-2[7, 9].目前发现的甲烷厌氧氧化协同硝酸盐还原主要发生在自然界中.
生活污水和化肥生产等工业排放的废水中含有大量的硝酸盐[10], 未经处理排放到环境中, 会导致水体富营养化和地下水污染, 从而危害人体的健康[11].在厌氧条件下, 利用硝酸盐作为电子受体, 厌氧氧化甲烷, 在处理含硝酸盐废水的同时, 有效削减了温室气体甲烷的排放.因此, 本研究分别从实验废水处理污泥、污水处理厂厌氧污泥和填埋场覆土中驯化富集甲烷氧化协同硝酸盐还原的菌群, 比较了3种菌群的甲烷厌氧氧化效果; 考察了硝酸盐的加入量对甲烷氧化效果以及微生物群落结构的影响, 以期为含甲烷废气与含硝酸盐废水的协同处理提供技术与方法.
1 材料与方法 1.1 甲烷厌氧氧化-硝酸盐还原菌群的驯化方法甲烷厌氧氧化-硝酸盐还原菌群的驯化接种物取自北京某污水处理厂厌氧段污泥、实验室装置厌氧池污泥和垃圾填埋场的覆土.将接种物与营养液按一定比例混合, 混合液的污泥浓度分别为3 529 mg ·L-1、3 928 mg ·L-1(填埋场覆土取10 g加入100 mL水中, 振荡20 min后静置, 取悬浊液), NaNO3的浓度为2.5 g ·L-1.营养液的成分为:NH4Cl 1.5 g ·L-1, MgSO4 0.2 g ·L-1, K2HPO40.7 g ·L-1, FeSO4 ·7H2O 0.1 g ·L-1, NaCl 0.7 g ·L-1, pH 6.67, 所用试剂均为分析纯, 国药集团化学试剂有限公司生产.混合液50 mL加入100 mL血清瓶中, 再通入50 mL甲烷(体积分数40%, 余气为氦气), 将血清瓶密封后放入恒温摇床(30℃, 120 r ·min-1)中厌氧培养.每周取样1~2次, 测定反应瓶中甲烷、硝酸钠及其产物的量, 监测反应效果.连续驯化80 d, 反应瓶内的甲烷浓度持续减少, 驯化完成.为了对比不同来源接种泥的驯化效果, 设计了系列驯化实验, 驯化条件见表 1.选用3个体系中, 甲烷氧化效果最好的体系, 用驯化好的污水处理厂厌氧污泥在不同条件下进行甲烷厌氧氧化研究.
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表 1 驯化条件1) Table 1 Microbial acclimation conditions |
1.2 分析方法
采集的样品包括气体, 溶液及污泥.气体分析甲烷、二氧化碳、氮气, 使用气相色谱仪(安捷伦6890型, 美国)检测.外标法计算气相中相应气体浓度.CH4采用氢火焰离子检测器, N2为载气; HP-5毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm, Agilent); 进样口温度、柱温和检测器温度分别为:50、100和250℃.CO2和N2采用热导检测器, He为载气; 不锈钢填充柱Tbx-0(2 m,Φ 2 mm, 60~80目); 进样口温度、柱温和检测器温度分别为:110、100和250℃.溶液分析包括NO3-浓度和总有机碳(TOC), 分别采用DIONEX ICS1000离子色谱仪(美国)和TOC-V CPH测定仪(日本)测定.采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定污泥中Cu、Fe、Mn、Ni、Zn的含量, 所用仪器为Optima 2000 DV(Perkin Elmer, 美国).总悬浮固体(TSS)和挥发性悬浮固体(VSS)用重量法测定(国家标准GB/T 11901-1989).
生物相分析:分别对不同体系中微生物的总DNA进行提取(omega, 美国).随后选择真细菌通用引物616F(5′-AGA GTT TGA TYM TGG CTC AG-3′)和630R(5′-CAK AAA GGA GGT GAT CC-3′)[12]、古细菌通用引物20F(5′-TTC CGG TTG ATC CYG CCG G-3′)和958R(5′-YCC GGC GTT GAM TCC AAT T-3′)[13]对细菌16S rDNA进行PCR扩增.扩增反应体系(50 μL)包括:DNA模板2 μL, 10×PCR Buffer 5 μL, dNTP混合物4 μL, 引物各0.75 μL, Ex-Taq DNA聚合酶0.25 μL, ddH2O 37.25 μL.PCR扩增程序为:94℃预变性3 min, 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 31个循环, 72℃延伸10 min.扩增完毕后, 取5 μL扩增产物, 在120 V电压下, 于10 g ·L-1的琼脂糖凝胶中电泳30 min, 凝胶成像系统(Bio-Rad, 美国)采集图像, 鉴定PCR扩增效果.
对PCR产物进行进一步纯化(Omega E.Z.N.A. Gel Extraction Kit Ⅰ, 美国), 将纯化后的PCR产物片段与pMD 18-T载体连接(Promega, 美国), 转入大肠杆菌感受态细胞(DH5α , 中国)中.转化后的菌体涂布于预加有氨苄、X-Gal和IPTG的LB培养基中, 12h后进行蓝白斑鉴定.挑取白色阳性克隆子进行测序分析.
获得的序列经过去载体、拼接、去除嵌合体后, 分析每个样品中所有序列的同源性(DNAMAN), 并根据序列相似度的差异来划分操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU), 相似度大于等于97%的归为一个OTU.每个OTU中选择一条代表序列, 提交美国国家生物技术信息中心(NCBI, National Center of Biotechnology Information)的GenBank数据库进行序列比对, 根据相似序列信息, 构建获得每个样品的克隆文库.
以覆盖度(coverage,C )来评估所构建的文库对细菌多样性的体现, 公式为[14]:
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(1) |
式中,N :阳性克隆子的数目,n :具有不重复序列的克隆数.
本文所测序列均提交到NCBI GenBank数据库中获得登录号.
以香农威纳指数(Shannon-Weiner index,H )来反应每个体系的微生物群落多样性, 计算公式为[15]:
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(2) |
式中,H :香农威纳指数;Pi :样品中属于第i 种的个体的比例.
选择每个OTU中代表序列和数据库比对获得的相似序列进行细菌系统发育树构建, 系统发育树的构建选用MEGA 6.1软件的邻接(neighbor joining, NJ)算法.
2 结果与讨论 2.1 甲烷氧化-硝酸盐还原菌群的驯化富集定期取样, 测定驯化体系中的甲烷量, 监测甲烷体积分数的变化.SS、SF和SW体系的培养时间为80 d(图 1).接种垃圾填埋场覆土的SF体系中甲烷逐渐减少.培养80 d后, 甲烷体积分数从40%减少至34.95%, 甲烷的平均消耗速率为0.02 mg ·d-1.相似的, SW体系的甲烷体积分数随着驯化时间延长逐渐降低, 期间呈现波动变化.驯化开始时, 体系中甲烷的体积分数为40%, 甲烷体积分数逐渐降低至27.98%, 80 d内甲烷平均减少速率0.05 mg ·d-1.在驯化期间, SS体系中的甲烷体积分数也呈现波动变化, 但是甲烷体积分数逐渐增加.80 d后, 甲烷的体积分数增加至41.05%, 增加了0.35 mg.43 d时, 甲烷的体积分数最大为52.37%, 增加量为4.12 mg.经过80 d的培养, 接种污水厂污泥的体系甲烷减少量最多, 氧化效果最好, 接种处理实验室废水装置污泥的驯化体系, 甲烷减少量最少.
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SF-M:SF体系甲烷体积分数; SW-M:SW体系甲烷体积分数; SS-M:SS体系甲烷体积分数 图 1 SW、SS和SF驯化时甲烷体积分数变化 Fig. 1 Methane concentrations in SW, SS, and SF |
菌群结构与底物成分有关, 接种物的成分有差异, 导致不同驯化体系的微生物群落结构各具特色, 甲烷的氧化量相应发生变化.
驯化开始时SF、SW和SS这3个体系的接种物分别为填埋场填埋区覆土、污水处理厂厌氧污泥和实验室废水处理装置污泥, 接种物来源不同, 成分差异明显(表 2).实验室废水处理装置污泥和污水处理厂厌氧污泥含有较高的有机质, 其质量浓度分别是填埋场填埋区覆土有机物质量浓度的4.55倍和3.97倍.SS和SW驯化体系中存在大量的有机质, 在厌氧条件下, 有机质被微生物降解, 产生溶解性的小分子有机物.这些溶解性的小分子有机物能够被产甲烷菌利用, 产生甲烷[16].因此, 出现甲烷增加的现象.与其他两个驯化体系相比, 实验室废水处理装置污泥有机质含量最高, 甲烷增加的最多.研究结果显示, 污水厂厌氧污泥适于作为驯化甲烷厌氧氧化协同硝酸盐还原生物体系的接种物.
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表 2 接种物成分分析/mg ·L-1 Table 2 Characteristics of the inoculum/mg ·L-1 |
3个驯化体系均加有硝酸盐, 硝酸盐会抑制甲烷的生物合成[17].首先, 硝酸盐的还原比产甲烷更容易消耗H2, 减少了产甲烷过程可利用的底物.另外, 硝态氮的存在还会抑制产甲烷菌的活性.由于在同一个体系中, 同时发生产甲烷与甲烷氧化两个反应.因此, SS和SW的体系中出现甲烷浓度明显波动的现象.垃圾填埋场覆土的有机质含量低, SF体系中的甲烷浓度没有明显的波动.
对产甲烷和甲烷氧化过程中微生物的金属酶和微量金属生理学的研究发现, 富金属酶途径有多种, 包含了产甲烷过程和甲烷氧化过程[18].产甲烷过程需要大量的铁、镍和锌等元素, 而甲烷氧化过程需要量较少.因此驯化体系中的重金属如铁、镍和锌等浓度高时, 有利于甲烷的合成.重金属的量影响微生物的活性, 浓度高时, 产甲烷酶活性增强, 甲烷氧化菌活性受到抑制.当体系中铜离子和铁离子浓度分别大于10 μmol ·L-1和20 μmol ·L-1时, 会抑制甲烷氧化菌的活性[19].接种物的重金属含量分析显示, 实验室废水处理装置污泥重金属质量浓度均高于污水处理厂厌氧污泥和填埋场填埋区覆土, 其中Fe、Cu、Zn和Ni的质量浓度是污水处理厂厌氧污泥的1.7、25.9、10.9和5.7倍, 是填埋场填埋区覆土的1.2、46.6、38.9和3.8倍(表 2).高浓度的Zn、Ni、Cu和Fe影响了驯化体系中甲烷氧化菌的活性, 降低了甲烷氧化效率.因此, 高浓度的重金属是导致SS体系甲烷氧化效率低, 及甲烷波动明显的原因之一(图 1).
2.2 硝酸盐浓度的影响利用驯化后得到的污水处理厂厌氧污泥富集产物, 分别加入不同浓度的硝酸盐进行甲烷氧化反应(M1及M2), 研究其对甲烷氧化效果的影响, 实验条件如表 3.体系M1和M2中的甲烷浓度均随着反应时间的延长而减少(图 2).在体系M1中, 甲烷体积分数随时间逐渐降低.反应15 d后, 甲烷体积分数从45%减少至37.8%, 反应至第20 d, 体系中甲烷体积分数升至38.8%.反应30 d后, 甲烷体积分数降低至27.4%, 然后甲烷体积分数基本不发生变化.整个反应过程中, 甲烷减少了5.86 mg.M2体系中甲烷体积分数随时间的变化与之类似, 反应38 d后, 甲烷体积分数降低至11.8%, 甲烷减少了11.06mg.之后, 甲烷体积分数趋于平稳.M2体系中甲烷的减少量是M1体系中的1.89倍.
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表 3 不同NaNO3浓度实验条件 Table 3 Test conditions for different nitrate concentrations |
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M1-M:M1体系甲烷体积分数; M2-M:M2体系甲烷体积分数; M1-C:M1体系二氧化碳体积分数; M2-C:M2体系二氧化碳体积分数 图 2 不同NaNO3浓度反应体系甲烷-二氧化碳体积分数变化 Fig. 2 Concentrations of methane and carbon dioxide with different NaNO3 volume fraction |
M1和M2体系中, 甲烷体积分数减少的同时检测到二氧化碳的产生.随着反应的进行, M1体系中二氧化碳的体积分数随时间逐渐增加(图 2).当反应至第23 d时, 体积分数为2.7%, 当反应30 d后, 二氧化碳的体积分数增加至7.3%, 随后逐渐降低.反应结束时, M1中二氧化碳体积分数为2.75%, 二氧化碳产生了2.29 mg.M2中二氧化碳的体积分数也呈现先增加后降低的现象, 反应至第42 d时, 体系中二氧化碳体积分数达到最大值21%, 整个反应过程中, M2体系中二氧化碳增加了12.08 mg, 比M1体系多产生了9.79 mg二氧化碳.
根据以往的研究(图 3), 甲烷厌氧氧化协同硝酸盐还原反应过程中, 硝酸盐经过一系列还原酶的作用转化为N2, 并同时产生O2.甲烷在甲烷氧化菌的作用下被O2氧化生成甲醇并最终转化为二氧化碳[2, 20].硝酸盐增加时, 有可能促进了氧的生成, 将甲烷氧化为甲醇, 进而转化为二氧化碳.适当增加硝酸盐, 有利于甲烷转化为二氧化碳.
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图 3 甲烷厌氧氧化协同硝酸盐还原途径 Fig. 3 Methane oxidation coupled to denitrification with anaerobic conditions |
分别构建M1和M2体系的16S rDNA克隆文库, 分析硝酸盐浓度对群落结构的影响.M1体系归并细菌OTU数目为34个, 古菌OTU为12个, 它们的覆盖度分别为72.9%和92%.M2体系归并的细菌和古菌的OTU数目分别为28个和16个, 相应的覆盖度为74.7%和78%.
2.3.1 硝酸盐对该富集物微生物群落组成的影响M1和M2古菌群落(图 4和表 4)中, OTU-G1-4、OTU-G2-2、OTU-G2-3和OTU-G2-5与甲烷八叠球菌Uncultured Methanosarcinales 的相似度较高.OTU-G1-5、OTU-G1-10和OTU-G2-11与甲烷微菌Uncultured Methanomicrobiales 有较高的相似度.甲烷八叠球菌和甲烷微菌具有甲烷氧化功能.甲烷氧化菌(ANME)分为3个类群:ANME-1、ANME-2和ANME-3[21, 22].其中甲烷八叠球菌与甲烷微菌与ANME-1具有亲缘关系, ANME-2属于甲烷八叠球菌, ANME-3与拟甲烷球菌进化关系较近[23, 24].Meyerdierks等[25]对海底甲烷泄漏区的底泥进行富集培养, 获得了ANME-1的富集产物.通过研究, 他们发现ANME-1可利用氨作为无机氮源生长, 并通过氧化甲烷成二氧化碳来获得能量.与ANME-1不同的是, ANME-2能够利用硝酸盐为电子受体氧化甲烷.Haroon[9]的研究中指出, 硝酸盐还原型甲烷氧化菌是ANME-2型的甲烷厌氧氧化古菌, 这类古菌隶属于甲烷八叠球菌, 它们利用硝酸盐作为电子受体氧化甲烷.ANME-2型甲烷氧化菌的甲烷氧化速率和硝酸盐还原速率分别能够达到1.47 mmol ·d-1和1.1 mmol ·d-1.M1和M2体系中均含有甲烷微菌和甲烷八叠球菌的相似菌, 甲烷氧化速率分别达到1.47 mg ·(L ·d)-1和2.77 mg ·(L ·d)-1.接种物的来源, 反应器的规模以及硝酸盐浓度等因素均会影响到甲烷的转化率.
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图 4 M1、M2体系的优势古菌微生物系统进化树 Fig. 4 Phylogenetic tree of the dominant archaea in M1 and M2 |
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表 4 M1、M2体系中优势古菌的相似菌 Table 4 Similar archaea of the dominant archaea in M1 and M2 |
M1和M2体系的细菌群落结构(图 5和表 5)中, OTU-X1-2、OTU-X2-2与假单胞菌Pseudomonas stutzeri N2相似度较高.Pseudomonas stutzeri 能够在厌氧条件下利用硝酸盐为电子受体生长, 通过硝酸盐还原作用将硝酸盐逐级转化为氮气, 每毫克微生物的氮转化速率达到85.6 nmol ·min-1[26].OTU-X1-3的相似菌是梭状芽胞杆菌Uncultured Clostridia .厌氧条件下, 梭状芽胞杆菌能够在8h内将2mmol ·L-1的硝酸盐完全转化. Caskey在研究土壤中硝酸盐的转化过程时, 发现Clostridia 能够将硝酸盐转化为氨, 并且溶液中NH4+的积累不会抑制硝酸盐的转化过程[27].OTU-X2-28与热单胞菌Thermomonas 具有较高的相似度.热单胞菌Thermomonas 具有硝酸盐还原功能, 能够将硝酸盐还原为氮气.Qiu等[28]的研究中发现, 在进水硝酸盐浓度为85 mg ·L-1时, 有92%的硝酸盐能够被热单胞菌属Thermomonas 降解.同时, M1和M2中还检出绿弯菌门细菌(OTUs-X1-4、19)和(OTUs-X2-22、23), 互营菌门细菌(OTUs-X1-16、18、21)和(OTUs-X2-21、26、27)(表 5).在厌氧产甲烷过程中, M1体系中的绿弯菌门细菌(3.53%)、互营菌门细菌(3.54%)及M2体系中的绿弯菌门细菌(2.30%)、互营菌门细菌(3.45%)与产甲烷菌相互依存(表 5).绿弯菌门细菌将多糖、蛋白质等大分子有机物分解为乙酸等低分子有机酸[29], 这些产物能够被产甲烷菌和互营菌门细菌利用进行产甲烷作用[30].同一个反应体系中, 甲烷氧化菌古菌、产甲烷细菌同时存在, 因而出现甲烷氧化过程中的甲烷浓度波动变化现象.
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图 5 M1、M2体系的优势细菌微生物系统进化树 Fig. 5 Phylogenetic tree of the dominant bacteria in M1 and M2 |
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表 5 M1、M2体系中优势细菌的相似菌 Table 5 Bacteria similar to the dominant bacteria in M1 and M2 |
2.3.2 M1与M2微生物群落结构比较
体系M1的细菌和古菌的香农指数分别为2.8和1.6;M2体系中细菌和古菌的香农指数分别为2.8和2.0.香农指数是表征生物群落多样性程度的一种指标.M1与M2中的细菌多样性类似, 但是M2体系古菌多样性略高于M1体系.
其他反应条件相同时, 硝酸盐加入量的不同, 微生物群落结构有差异(表 6).M1体系中硝酸盐还原菌数量比为7.06%, 甲烷氧化菌所占的比例为48%;M2体系中硝酸盐还原菌的数量比为11.49%, 甲烷氧化菌所占的比例为41.67%.与M1相比, M2体系的硝酸盐还原菌数量较多, 甲烷氧化菌的数量较少.硝酸盐还原菌和甲烷氧化菌的种类在M1体系中的占比分别为5.88%和25%;在M2体系中的占比分别为7.14%和25%.与M1相比, M2体系中硝酸盐还原菌的占比较高, 甲烷氧化菌的占比相同.由于硝酸盐还原型甲烷氧化菌是属于ANME-2型的甲烷八叠球菌, 硝酸盐浓度高的体系硝酸盐还原细菌的数量多, 甲烷八叠球菌的种类较多, 有利于硝酸盐还原与甲烷氧化.因此, M2体系中甲烷的转化较多.
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表 6 硝酸盐还原菌、甲烷氧化古菌的数量及种类1) Table 6 Quantities and species of denitrifying bacteria and methane oxidizing archaea |
3 结论
比较了实验室废水处理装置污泥、污水处理厂厌氧污泥和填埋场填埋区覆土作为接种来源驯化培养硝酸盐还原型甲烷厌氧氧化菌群的甲烷氧化效果.经过驯化, 接种污水处理厂厌氧污泥的驯化体系甲烷减少量最多, 甲烷消耗速率是1 mg ·(L ·d)-1.污水处理厂厌氧污泥适合作为驯化富集甲烷氧化-硝酸盐还原菌群的接种物.硝酸盐的量影响甲烷的氧化效果, 并改变微生物菌群结构.
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