随着城镇化和工业化进程的加快, 人口、经济快速增长, 工业农业活动的区域不断扩大, 密集的人类活动导致的世界性的水质问题日益严重, 影响人类的生存环境.其中, 区域水环境中硝酸盐氮含量的增加是水质恶化的主要表现之一^[1].因此, 降低水体中不断增加的硝酸盐浓度已经引起了研究者们的广泛关注.

目前, 生物反硝化研究主要集中在单一电子供体的异养和自养反硝化领域, 而对采用混合电子供体的混养反硝化研究较少, 但是研究者们发现, 混养反硝化是一种更为普遍的自然现象.例如, Oh等^[2]通过同时投加硫源硫磺颗粒和甲醇、垃圾渗滤液等作为电子供体, 发现反应器中同时进行了自养和异养反硝化, 而且混养反硝化相较于自养反硝化有更高的NO₃^--N去除率.Xu等^[3]在SBR反应器实验混养反硝化过程发现, 该反应器对硝酸氮、亚硝酸盐氮和硫化物的最高去除率分别为100%、80%和100%, 并且通过微生物分析发现反应器中有近43%的兼性自养反硝化菌, 说明在混养反应器中, 自养、异养和兼养反硝化菌共同对脱氮起到了作用.甚至有研究者发现^[4], 即便是在单一电子供体的异养(或自养)反硝化反应器中, 也有大量的自养(或异养)、兼性反硝化菌同时存在.另外, 混养反硝化因为启动容易、脱氮效率较高、污泥产率较低、耗碱量小等优点, 渐渐引起研究者的关注^[5~8].

然而混养反硝化工艺的影响因素较多^{[9, 10]}, 工艺尚不成熟, 还没有可以参考的最佳电子供体配比, 可能影响混养反硝化的因素及其影响程度还不明确, 如外加无机盐、温度、pH和水力负荷等, 自养、异养和兼养反硝化菌在混养活性污泥中的组成比例也较多变.因此, 对于混养反硝化的研究还有很大空间.

本文研究了无机磷的添加对混养反硝化污泥的反硝化速率的影响, 对比添加无机磷前后混养污泥内生物量的变化以及活性的变化, 并根据高通量测序具体分析混养污泥微生物群落结构及其多样性, 通过比较考察磷对于生物群落结构的影响.

1 材料与方法 1.1 样品来源与采集

本实验中所使用的反硝化污泥来源于实验室内混合营养条件下的升流式生物滤池反硝化反应器, 连续反应器的进水利用自来水人工配制模拟硝酸盐污染水.本地自来水水中NO₃^--N浓度为2.5~2.9 mg ·L^-1, pH值为6.8~7.0, TP浓度低于检出限.反应器进水添加NaNO₃, 使NO₃^--N浓度为12 mg ·L^-1左右, 按照自养、异养各负担一半氮负荷的计划投加硫源和碳源, 碳源投加量按COD/N(质量比)为5 :1计算, 硫源投加量按照S/N(量比)为1计算, KH₂PO₄的投加量参考袁莹等^[11]对不同电子供体的硫自养反硝化的研究结果, 选用具有最优脱氮效果的Na₂S₂O₃投加量, 系统进水KH₂PO₄添加量按照NO₃^--N浓度等比例计算, 投加量见表 1.反应第一阶段运行120 d, 仅在原水中添加NaNO₃、Na₂S₂O₃ ·5H₂O和CH₃COONa.反应第二阶段运行100 d, 原水含氮量、碳源、硫源投加量不变, 另外添加KH₂PO₄.

反应器稳定运行期间, 分别于9月26日(第一阶段末期)和11月9日(第二阶段中期)从反应器下部取游离污泥样约200 mL, 测定其污泥活性(即单位干重的污泥对基质的降解速率).下文将第一阶段所取的污泥样编号为A, 将第二阶段污泥编号为B.

1.2 污泥活性的测定

污泥活性的具体测定方法如下.

使用100 mL的透明玻璃西林瓶, 将相同体积的反硝化污泥放入各西林瓶中, 西林瓶内污泥量为15 mL, 其中干污泥量为(2.36±0.10) g ·L^-1, 加入少量(约1 mg ·L^-1 NO₃^--N)的NaNO₃、Na₂S₂O₃(S/N=1, 量比)或CH₃COONa(C/N=5 :1, 质量比), 瓶口使用铝盖和丁基胶塞密封.将所有西林瓶放入摇床培养, 设置温度为30℃, 转速为180 r ·min^-1, 培养24 h以简单驯化并消耗瓶中的基质.

为了分别测定污泥的自养和异养反硝化活性, 每份污泥进行碳源和硫源两个实验组.开始测定时, 向各西林瓶中注入配置好的较浓基质使瓶内初始NO₃^--N的浓度约为10 mg ·L^-1, 碳源实验组中只添加CH₃COONa(C/N=5 :1, 质量比), 硫源实验组中只添加Na₂S₂O₃ ·5H₂O(S/N=1, 量比), 继续在摇床中培养, 温度和转速条件和驯化培养时相同.定时从西林瓶中取水样, 每次取2 mL混合液, 立即离心后分析上清液中的NO₃^--N、NO₂^--N、S₂O₃^2-和SO₄^2-浓度, 每个样品连续取样8 h, 测定结束后分析西林瓶中的反硝化污泥的MLSS和MLVSS.

1.3 数据分析

NO₃^--N、NO₂^--N、S₂O₃^2-和SO₄^2-的测定使用瑞士万通生产的MIC型万思得研究级离子色谱仪, 活性污泥的SS和VSS根据国标中的重量法测定^[12].

采用QIAamp DNA提取试剂盒(QIAGEN, Germany)提取反硝化污泥样品中的DNA, 然后对细菌16S rRNA基因在V4-V5区内进行PCR扩增.25 μL扩增体系中包括:DNA模板2 μL, 5×reaction缓冲液5 μL, 5×GC缓冲液5 μL, dNTP(100mmol ·L^-1)2 μL, 正向引物(GTGCCAGCMG CCGCGGTAA, 10 μmol ·L^-1)1 μL, 反向引物(CCGTCAATT CMTTTRAGTTT, 10 μmol ·L^-1)1 μL, Q5^® High-Fidelity DNA聚合酶0.25 μL, 以及无菌水8.75 μL.扩增程序为:初始变性98℃ 2 min, 30个循环, 其中变性98℃ 15 s, 退火55℃ 30 s, 延伸72℃ 30 s, 循环结束后最终延伸extension 72℃ 5 min.PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳-紫外透射核实扩增成功后进行高通量测序.采用Illumina MiSeq平台对群落DNA片段进行2×300 bp的双端(Paired-end)测序, 采用滑动窗口法对双端序列逐一作质量筛查并对通过质量初筛的双端序列根据重叠碱基进行配对连接.用运用QⅡME软件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology, v1.8.0, http://qiime.org/调用USEARCH(v5.2.236, http://www.drive5.com/usearch/)进行质量控制, 调用UCLUST对前述获得的高质量序列按97%的序列相似度进行归并和OTU(operational taxonomic unit, 可操作分类单元)划分.MiSeq测序和OTU分类均由上海派森诺生物科技股份有限公司完成.)

2 结果与讨论 2.1 运行第一阶段反硝化污泥对NO₃^--N的去除速率和NO₂^--N的积累速率

在未加磷的第一阶段, 混养反硝化污泥以Na₂S₂O₃作为单一电子供体时, 对NO₃^--N去除速率和NO₂^--N、SO₄^2-的积累速率见图 1, 反映混养反硝化污泥A的自养反硝化活性.

起始浓度为10.23 mg ·L^-1的NO₃^--N经过440 min后下降为9.27 mg ·L^-1.在此反应过程中, NO₃^--N浓度呈平稳线性下降趋势, 消耗速率为1.96×10^-3 mg ·(L ·min)^-1.NO₂^--N浓度均低于0.3 mg ·L^-1, 说明微生物在反硝化反应的过程中几乎没有NO₂^--N的积累, NO₃^--N还原限速步骤是硝酸盐转化为亚硝酸盐这一步骤.

西林瓶中SO₄^2-浓度可以作为监测自养反硝化反应的重要指标之一^[13].反应中SO₄^2-初始浓度为50.34 mg ·L^-1, 随着反应的进行, 浓度逐渐升高到67.45 mg ·L^-1, 将0.096 mg的NO₃^--N还原成N₂所产生的SO₄^2-的理论值为1.11 mg, 实际检测出西林瓶中SO₄^2-增加了1.71 mg, 可能的原因是部分S₂O₃^2-被氧气氧化.

以CH₃COONa为单一电子供体时的硝酸氮还原速率反映了在运行的第一阶段混养反硝化污泥的异养反硝化活性.NO₃^--N初始浓度为10.99 mg ·L^-1, 反应进行440 min后浓度下降为8.12 mg ·L^-1, 反应速率为4.43×10^-3 mg ·(L ·min)^-1.NO₂^--N浓度在反应过程中不断积累, 在440 min后浓度达到3.35 mg ·L^-1.说明反硝化反应后半段(即亚硝酸盐还原为氮气的阶段)的反应速率较低, 造成西林瓶中NO₂^--N的积累, NO₃^--N还原限速步骤是亚硝酸盐还原为氮气阶段.

从图 1可以看出, 运行第一阶段, 反硝化污泥的活性整体较低, 比较A样品在两种电子供体下对NO₃^--N的去除速率和NO₂^--N的积累速率, 可以看到, 混养污泥的异养反硝化活性明显高于自养, 但是反应中会有NO₂^--N积累的情况发生; 在以硫源Na₂S₂O₃作为电子供体的条件下, 反硝化速率相对较低, 但是几乎没有NO₂^--N的积累.

2.2 运行第二阶段反硝化污泥对NO₃^--N去除速率和NO₂^--N、SO₄^2-的积累速率

反应器运行第二阶段, 反应器中添加一定量无机磷后, 混养活性污泥的自养和异养反硝化速率测试结果见图 2.

在只有硫源为电子供体的条件下, NO₃^--N的还原速度较第一阶段明显加快, 440 min内从12.86 mg ·L^-1下降为7.12 mg ·L^-1.特别是前半段(250 min), 硝酸氮还原速率为1.66×10^-2 mg ·(L ·min)^-1.NO₂^--N仍维持在一个较低的浓度, 没有积累现象产生.SO₄^2-浓度从35.07 mg ·L^-1增加到76.02 mg ·L^-1.可见自养反硝化活性的提高关键在于硝酸盐转化为亚硝酸盐这一步骤的加快.

当以CH₃COONa作为电子供体时, B泥样的NO₃^--N去除速率和NO₂^--N积累速率如图 2(b)所示.80min内, 西林瓶内的NO₃^--N的浓度从9.14 mg ·L^-1下降至1.08 mg ·L^-1.反硝化速率达到6.61×10^-2 mg ·(L ·min)^-1.NO₂^--N浓度在反应过程中先是不断积累, 然后逐渐降低.表明亚硝酸盐还原为氮气的速度已经与硝酸盐转化为亚硝酸盐的速度基本持平, 不再成为限制步骤.

2.3 添加无机盐后, 混养反硝化污泥活性变化

另外, 磷的添加也有效提高了反应器中的污泥量, 添加磷之后, 反硝化污泥的MLSS从2.36 g ·L^-1增至5.15 g ·L^-1, MLVSS则从加磷前的1.16 g ·L^-1迅速增加到3.89 g ·L^-1, 而MLVSS/MLSS比值由0.49增加到0.75则表明, 污泥中有机体的含量明显增高.

以单位重量MLVSS对硝酸氮的比降解速率表征污泥活性(以N/VSS计), 结果如图 3所示.混养反硝化污泥的自养反硝化活性由原来的0.019 mg ·(L ·min ·g)^-1提升为0.056 mg ·(L ·min ·g)^-1, 约原来的2.9倍; 而异养反硝化速率由原来的0.059 mg ·(L ·min ·g)^-1升高到0.232 mg ·(L ·min ·g)^-1, 约为原来的3.9倍.

比较A、B泥样的活性可知, 通过提高自养和异养反硝化微生物活性, 磷的适量添加有助于混养污泥更好地进行反硝化脱氮^[14].这在混养反应器的运行效果上也有很好的验证, 加入磷之后, 第二阶段的脱氮效果明显高于第一阶段.第一阶段在温度为25℃、水力停留时间为1.5 h时, 硝酸氮的去除率在65%~75%之间波动.而在相同条件下, 第二阶段硝酸氮的去除率在88%~97%之间波动.第一阶段中室温为20℃时, 偶尔向进水中添加一定量的无机磷后的几天内, 反应器对硝酸氮去除率从63.3%迅速上升到91.9%.停止投加后, 反应器还能继续维持一段时间的高效脱氮, 5~7 d以后硝酸氮去除率又回落至原来的水平.在相同的30℃室温和45 min水力停留时间条件下, 第一阶段NO₃^--N的平均去除率为80.7%, 而在第二阶段则增加到93.6%.

由此可知, 添加无机磷可以显著促进混养反硝化污泥的活性, 尤其是混养污泥中的异养反硝化微生物的活性.

第二阶段反应器连续运行过程中, 磷的投加量(以P计)为0.91 mg ·L^-1, 测得反应器出水中磷的含量平均为0.22 mg ·L^-1, 也就是说, 约有0.7 mg ·L^-1的磷被活性污泥中的微生物利用.这也说明磷的投加量略高于实际所需, 在以后的运行中可以略微降低.

2.4 投加磷前后微生物群落结构变化及其多样性 2.4.1 微生物群落多样性分析及其优势菌属

活性污泥样经过高通量测序后, 对原始测序数据进行质量控制并分析生物多样性指数, 具体统计结果如表 2所示.

选取微生物度量指数Chao1、ACE、Shannon和Simpson指数来衡量活性污泥中微生物群落的多样性.Chao1指数和ACE指数侧重于体现群落的丰富度, 一般而言, Chao1或ACE指数越大, 表明群落的丰富度越高^{[15, 16]}.Shannon指数和Simpson指数则综合考虑了群落的丰富度和群落均匀度, 两者数值越高也就代表群落的多样性越高^{[17, 18]}.

分析两个污泥样品的测序数据后发现, A泥样除了在ACE指数上均略低于B泥样, 其他三项指数均略高于B泥样.说明在相对程度上, 加磷前污泥的微生物多样性更高, 但是从各个细菌的丰富程度而言, 加磷后, 由于污泥中某些种属的细菌数量增殖较快, 丰富度显著提高, 因而其他细菌占比降低, 使得总体多样性下降.

在属水平上, 反硝化污泥样的微生物群落中主要细菌的种类和所占百分比如图 4所示, 其中other包括未被鉴定和占比小于0.4%的细菌.正如微生物群落的多样性度量指数所示, A泥样中占比超过0.4%的细菌有19个属, 而B泥样中只有大约15个属.但是B泥样中每种菌属的占比相对较高, 表明生物量更为丰富.其中, A泥样中的主要优势菌属有Dok59、Thiothrix、Sulfuritalea、Thiofaba等, 分别占总微生物群落的9.1%、4.0%、3.8%和2.8%;而B泥样中的主要优势菌属有Sulfurimonas、Thiothrix、Dok59、Acinetobacte等, 占比分别为25.1%、8.9%、5.6%和5.6%.

Thiothrix在微生物群落中的占比增加, 百分比从4.0%升高到8.9%.Thiothrix是一种硫氧化反硝化细菌, 主要存在于含硫化物的流动水体中, 如进水中含有硫化物的活性污泥废水处理系统^{[19, 20]}.该菌属下的细菌存在以下3种营养方式:兼性自养^[21]、化能异养^[21]和兼养^{[21, 22]}, 从这类有多种营养型的菌属的大量存在, 可以推测Thiothrix更适合在混合营养环境中生存.Gao等^[23]通过自养强化表面流人工湿地和异养强化表面流人工湿地实验发现两者的污泥中同时存在Thiothrix, 占比分别为2.13%和1.86%, 指出Thiothrix可能同时进行自养反硝化和异养反硝化.Zhou等^[4]也发现在自养和异养生物滤池反硝化反应器中均有Thiothrix存在.

添加无机磷后, Sulfurimonas成为优势菌属, 占比高达25.1%, A泥样中也检测到这种菌属, 但是其占比较少仅为0.1%.Sulfurimonas属于化能无机自养反硝化菌, 可以利用硫单质、硫化物、硫代硫酸盐或氢气作为电子供体还原硝酸盐和亚硝酸盐从而获取能量, 普遍存在于地球上的氮、硫生物化学循环中^{[24, 25]}.虽然Sulfurimonas通常被分类为自养细菌, 但是新的研究发现一些有机物也能促进其生长.例如Takai等^[26]的研究发现S. paralvinellae除了单质硫, 还可以利用酵母提取物作为硫源.S. gotlandica除了无机硫化物, 还可以利用醋酸盐、甲酸盐和丙酮酸盐等有机碳源进行新陈代谢^[27].因此, 结合本实验结果可以推测Sulfurimonas能够存在于混养环境中进行反硝化, 而第一阶段运行中的Sulfurimonas占比较少可能是由于无机磷的缺乏导致.

此外, 虽然Dok59在A、B两个泥样中均占有一定比例, 一些ABR^[28]反应器连续流实验的活性污泥中也检测到有这种细菌的出现, 但是目前关于该细菌的研究较少, 其生理生化特征、在反应中的具体代谢过程和在反硝化反应中的作用有待后续进一步的研究.

2.4.2 反硝化菌群落结构分析

为了进一步研究各系统中自养反硝化菌、异养反硝化菌和兼养反硝化菌的菌群结构变化, 对各种营养型的反硝化菌功能菌按照属水平进行归类综合, 其结果如表 3和图 5所示.

两个污泥样品中, 自养、异养和兼养反硝化菌各占一定比例.相同之处在于自养反硝化菌均占比最高, 其次是兼养反硝化菌, 异养反硝化菌占比最少.但是在投加无机磷之后, 污泥中反硝化菌的总体占比(44.82%)明显高于加磷前(13.47%), 说明添加无机磷促进了反硝化菌的生长.尤其是自养和兼养反硝化菌, 其中兼养反硝化菌Thiothrix占比从3.99%增加到8.95%, Acinetobacte从几乎为零增长到5.62%, 自养反硝化菌Sulfurimonas占比从0.09%增加到25.05%, 说明这些细菌在有无机磷的环境中生长繁殖更为旺盛, 这可能也是反硝化效率显著提高的主要原因.以上结果表明, 投加磷使得混养污泥中的优势菌属发生显著变化, 并且有效促进了自养、异养以及兼性反硝化菌的生长.

3 结论

(1) 无机磷是影响混养反硝化作用的重要因子.对比混养反硝化污泥在有机碳源、硫源两种电子供体下的反硝化速率, 反硝化污泥的异养反硝化效率高于自养反硝化, 在混养污泥中添加无机磷后, 两者的脱氮效率都有明显提高, 无机磷的存在不仅提高了微生物量, 而且明显提高反硝化菌的活性, 其中异养反硝化活性的改善更为显著.

(2) 通过高通量测序对比加磷前后污泥的微生物群落结构与多样性变化, 发现无机磷的存在会促进污泥中的反硝化菌的生长, 提高其优势菌属的占比, 从而提高混养污泥的脱氮能力.