头孢类抗生素具有抗菌谱广、杀菌力强的特点, 是国内外临床应用最多的抗感染药物之一^{[1, 2]}, 大量的市场需求使得我国头孢类药物产量逐年增加.然而抗生素在为人类及动物健康作出贡献的同时, 其对环境与人类所产生的潜在危害, 特别是抗生素废水的有效处理, 引起了人们的广泛关注.当前抗生素废水的处理多以生物处理为主体, 包括活性污泥法与厌氧生物处理技术等, 但由于抗生素的自身特点, 使得传统生物处理方法不能将废水中残留的抗生素进行高效地去除^[3~5].

近年来, 高级氧化法(AOPs)被认为是处理含有毒性与难生物降解废水的具有潜力的技术^[6].在AOPs中, 芬顿技术因其处理高效、操作简便、反应条件温和而被人们所接受^[7~9].特别是多相类芬顿技术, 由于其具有工作区pH条件宽、无铁泥处理问题和有机污染物去除高效等优点被诸多学者广泛研究^[10].当前多相类芬顿技术实际应用的关键因素之一就是催化剂的制备与选择, 磁性纳米Fe₃O₄(Fe₃O₄ NPs)具备制备和改性容易、毒性低、反应活性高、易在外部磁场的作用下实现回收利用这些优点而受到人们的青睐, 其作为催化剂所构成的多相类芬顿体系对难生物降解有机物具有良好的去除效果^[11~13].同时芬顿反应组合生物工艺处理工业废水也引起了人们的浓厚兴趣^{[13, 14]}.然而当前人们对多相类芬顿反应的研究更多关注高效催化剂的制备与降解有机污染物最佳反应条件的确定^[15], 多相类芬顿反应组合生物工艺用于处理工业废水的研究还鲜有报道; 且与均相芬顿反应不同, 多相类芬顿反应体系中由于存在催化剂, 催化剂可能进入后续的生物处理反应器中, 因此催化剂对生物处理单元的影响也应当引起人们的重视, 但当前对此还缺乏系统研究.

鉴于此, 本文系统探讨了Fe₃O₄ NPs作为多相类芬顿催化剂对厌氧颗粒污泥的影响.首先研究了Fe₃O₄ NPs对厌氧颗粒污泥去除有机污染物的影响; 继而对Fe₃O₄ NPs对厌氧颗粒污泥溶解性微生物产物(SMP)、疏松胞外聚合物(LB-EPS)、紧密胞外聚合物(TB-EPS)的含量与组分的影响进行了分析; 而后利用扫描电镜(SEM)、高通量测序对长期暴露于Fe₃O₄ NPs下, 厌氧颗粒污泥的表观形态、污泥中古细菌与总细菌的群落结构进行了探讨, 以期为保障Fe₃O₄ NPs多相类芬顿-厌氧生物有效处理提供科学的指导.

Fe₃O₄ NPs购于华北金属材料某有限公司, 称取100 mg Fe₃O₄ NPs置于1 L超纯水(pH 6.9)超声1 h(250 W, 40 Hz), 此悬浮液经动态光散射(Malvern Instruments Ltd, UK)分析得平均粒径为60~80 nm.厌氧颗粒污泥取自广西某啤酒厂厌氧发酵罐的颗粒污泥, 其粒径为1.5~3.0 mm.

本实验使用人工配制COD浓度为2 000 mg ·L^-1左右的抗生素废水, 为了降低头孢氨苄本身对于厌氧颗粒污泥的抑制, 控制头孢氨苄的浓度, 具体成分如下(mg ·L^-1):头孢氨苄(20)、葡萄糖(3000)、NH₄Cl(200)、KH₂PO₄(44)、NaHCO₃(2000);配制废水的pH值为7.0~7.5.

厌氧反应装置为250 mL锥形瓶两个, 其中一个为对照组, 另一个为实验组.对照组(A)不投加Fe₃O₄ NPs, 实验组(B)中Fe₃O₄ NPs的投加量逐渐增大^[16]:50 mg ·L^-1(1~12 d)、100 mg ·L^-1(13~24 d)和150 mg ·L^-1(25~40 d).取人工配制的抗生素废水160 mL、40 mL厌氧颗粒污泥加入锥形瓶中, 其污泥浓度约为20 g ·L^-1.两个锥形瓶中充氮气10 min, 然后密闭置于(35±1) ℃恒温振荡进行实验.研究过程中, 每天对进、出水COD变化情况进行分析; 本实验结束后, 对装置中的厌氧颗粒污泥SMP、LB-EPS、TB-EPS进行分析, 同时利用SEM、高通量测序技术对污泥的表观结构、微生物群落组分进行探讨.

SMP与EPS的提取和分析^[17]:取泥水混合液, 至离心管中, 4 000 r ·min^-1离心10 min, 然后取一部分上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤后待测.然后在离心管内加入0.05%的NaCl溶液, 在20×10³ Hz的条件下, 超声2 min, 然后在150 r ·min^-1的条件下振荡10 min, 通过5 000 r ·min^-1离心10 min, 取一部分上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤后保存, 即为LB-EPS.剩余污泥用蒸馏水洗涤2次, 将洗涤好的污泥用0.9%生理盐水补足, 摇匀混合后于80 ℃的水浴锅中热提取30 min, 之后于5 000 r ·min^-1的离心机中离心10 min, 上清液用0.45 μm的微孔滤膜过滤后保存, 用于测定TB-EPS.然后利用三维荧光(EEM)光谱(Cary Eclipse, 美国Varian公司)对SMP与EPS的组分进行分析; 采用蒽酮比色法、考马斯亮蓝法测定SMP、EPS提取物中的多糖与蛋白质含量^{[18, 19]}.

SEM分析:①取10 mL污泥混合液, 用pH为6.8的磷酸盐缓冲液对污泥进行清洗; ②用2.5%的戊二醛淹没污泥于4 ℃条件下固定12 h; ③污泥样品分别用30%、50%、70%、80%、90%的乙醇脱水, 每次10 min, 然后用100%的乙醇脱水3次, 每次15 min; ④将处理后样品置于低温干燥机中进行干燥; ⑤在样品表面喷上1 500 nm的金膜; ⑥将喷金后的样品置于SEM(Vario Micro Cube, 德国Elementar公司)下进行观察^[20].

高通量测序技术分析:古菌PCR扩增所用引物为融合了MiSeq测序平台的V3-V4通用引物349F引物和806R引物.细菌PCR所用的引物为融合了MiSeq测序平台的V3-V4通用引物341F引物和805R引物.DNA扩增后, DNA信息库被构建, 并在MiSeq Illumina测序平台上被用于焦磷酸测序.所得到的高质量序列以97%的序列相似性阈值处理生成OTUs(运算分类单位), 并利用RDP(核糖体数据库项目)分类器进行分类分析样品中微生物群落结构与分布^[21].

另外COD采用快速消解法进行分析.

本文首先分析了投加Fe₃O₄ NPs后对厌氧颗粒污泥去除COD的影响, 结果如图 1所示.

图 1

Fig. 1

图 1 Fe3O4 NPs对COD去除率的影响 Fig. 1 Effects of Fe3O4 NPs on the COD removal rate during long-term exposure

由图 1可知, 在第33 d之前, 逐渐增加Fe₃O₄ NPs的投加量(50~150 mg ·L^-1), 实验组与对照组对平均COD去除率分别为83.6%和89.3%, 两者均对有机物的去除保持了良好的效果, 这表明在此投加范围内, Fe₃O₄ NPs为对厌氧颗粒污泥的除污效果未造成明显影响.在第33 d后, 对照组与实验组对COD的平均去除率分别为49.1%和45.6%, 均出现了急剧下降, 由于对照组同样出现了COD去除效率的降低, 因此可能的原因在于头孢氨苄属于难生物降解有机物, 且作为典型的抗生素具有一定的生物毒性, 其在反应器内逐渐累积到一定量后, 对厌氧颗粒污泥的活性造成明显的抑制作用, 从而造成COD去除率降低, 这也表明在处理有毒物质时, 单纯地采用厌氧生物处理技术存在一定的局限性.

EPS来自于正常的细胞分泌物、细胞裂解和水解产物, 由多糖、蛋白质、核酸等组成; EPS根据其空间位置的不同, 可分为紧密附着在细胞壁上的囊胞聚合物TB-EPS和以胶体和溶解状态松散于液相主体中的黏性聚合物LB-EPS; EPS对于厌氧颗粒污泥的形成以及保持其稳定性发挥着举足轻重的作用^[22].SMP是一种由基质代谢和生物质衰变产生的废水中的成分, 人们普遍认为, 大量SMP的存在不仅会降低生物处理反应器的出水质量, 还会对其运行产生不利影响^[23].因此本文对SMP与EPS的含量变化进行了分析, 结果如图 2所示.

图 2

Fig. 2

图 2 Fe3O4 NPs对SMP与EPS含量的影响 Fig. 2 Effects of Fe3O4 NPs on the contents of SMP and EPS

由图 2可知, 在投加Fe₃O₄ NPs后, SMP总量由34.88 mg ·L^-1降至27.44 mg ·L^-1, 其中蛋白质含量从27.39 mg ·L^-1降至23.23 mg ·L^-1, 多糖含量由7.49 mg ·L^-1降至4.21 mg ·L^-1.这表明投加Fe₃O₄ NPs后, SMP中的大分子有机物含量降低, 而这大分子有机物会增加后续处理单元的负担, 从这一角度分析而言, Fe₃O₄ NPs具有一定的积极作用.同时LB-EPS总量(以VSS计)由172.40 mg ·g^-1增至191.85 mg ·g^-1, 特别是多糖含量增加了86.4%, 这表明通过长期投加Fe₃O₄ NPs, 其投加量增加到150 mg ·L^-1, 会为厌氧颗粒污泥中的微生物产生一定的刺激, 从而刺激其分泌较多的EPS, 起到保护作用.而TB-EPS总量(以VSS计)由178.20 mg ·g^-1降至138.24 mg ·g^-1, 其中蛋白质含量从24.92 mg ·g^-1降至15.70 mg ·g^-1, 多糖含量由153.28 mg ·g^-1降至122.54 mg ·g^-1, 这表明Fe₃O₄ NPs的影响未深入到厌氧颗粒污泥内部.

为了进一步探讨Fe₃O₄ NPs对厌氧颗粒污泥的SMP、LB-EPS、TB-EPS的影响, 本文利用EEM光谱对其进行了分析(图 3).

图 3

Fig. 3

图 3 SMP与EPS的三维荧光谱图 Fig. 3 EEM spectra of SMP and EPS

如图 3所示, 在实验组与对照组的厌氧颗粒污泥SMP的EEM光谱中均出现了色氨酸蛋白(E_x/E_m=260~300/340~380 nm)、可见光区类腐殖酸(E_x/E_m=310~360/400~450 nm)^[24]及类富里酸(E_x/E_m=240~260/400~440 nm)的吸收峰^[25], 这表明投加Fe₃O₄ NPs后, SMP的组分未发生明显变化, 但类富里酸吸收峰有所增强.而对于厌氧颗粒污泥LB-EPS而言, 其EEM光谱中均出现了色氨酸蛋白和可见光区类腐殖酸及辅酶F₄₂₀(E_x/E_m=420/470 nm)的吸收峰^[26], 值得注意的是, 投加Fe₃O₄ NPs后, 厌氧颗粒污泥LB-EPS中微弱的紫外光区类腐殖酸(270~300/440~470 nm)吸收峰消失, 辅酶F₄₂₀的荧光峰强度明显降低, 这表明产甲烷菌的活性受到了一定的影响^[27].而对于厌氧颗粒污泥TB-EPS而言, 其EEM光谱中均出现了色氨酸蛋白和可见光区类腐殖酸的吸收峰, 投加Fe₃O₄ NPs后, 厌氧颗粒污泥的稳定性未受到影响.

本文利用SEM对实验组与对照组厌氧颗粒污泥的表现形态进行了分析, 结果如图 4所示.

图 4

Fig. 4

图 4 厌氧颗粒污泥的SEM与EDS Fig. 4 SEM images and EDS of anaerobic granular sludge

如图 4所示, 厌氧颗粒污泥通过扫描电子显微镜放大13 000倍观察时, 可以观察到未投加Fe₃O₄ NPs(A组)与投加Fe₃O₄ NPs(B组)的厌氧颗粒污泥表面菌种形态均以短杆状菌和小球菌为主, 两种菌相互交错, 丝状菌较少; 同时投加Fe₃O₄ NPs的颗粒污泥表面可明显观察到颗粒物吸附于微生物表面.继而通过能谱分析(EDS)对其进行分析可知, 投加Fe₃O₄ NPs的厌氧颗粒污泥能谱图中存在较强的Fe元素信号峰, Fe含量由0.64%增加到了44.78%, 再次验证Fe₃O₄ NPs附着在厌氧颗粒污泥表面, 但Fe₃O₄ NPs的附着并未对微生物活性造成明显抑制, 这与COD的去除率也是一致的.

为了更为全面地了解Fe₃O₄ NPs对于厌氧颗粒污泥中古细菌与总细菌的影响, 本文利用高通量测序技术对其进行了分析, 结果如图 5~8所示.

图 5

Fig. 5

图 5 古细菌科水平系统进化树分析 Fig. 5 Phylogenetic tree analysis of the archaeal community at the family level

图 6

Fig. 6

图 6 总细菌门水平系统进化树分析 Fig. 6 Phylogenetic tree analysis of the bacterial community at the phylum level

图 7

Fig. 7

图 7 古细菌属水平菌群结构与分布 Fig. 7 Archaeal community structures and distribution at genus level

图 8

Fig. 8

图 8 总细菌门水平菌群结构与分布 Fig. 8 Bacterial community structures and distribution at phylum level

如图 5所示, 对古细菌科水平系统进化树进行分析, 两个样品中的古细菌域主要有12类, 其中主要是甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)、甲烷规则菌科(Methanoregulaceae)、甲烷螺菌科(Methanospirillaceae)、甲烷微菌科(Methanomicrobiaceae), 其中甲烷杆菌科比例最高, 其次为甲烷规则菌科.甲烷杆菌科中样品A(未投加Fe₃O₄ NPs) < 样品B(投加Fe₃O₄ NPs)的含量, 甲烷规则菌科中样品A>样品B的含量, 表明投加Fe₃O₄ NPs对甲烷规则菌有一定的抑制作用.从进化角度分析, 甲烷规则菌科、甲烷微菌科、甲烷螺菌科属于同一个簇, 进化关系较为接近.

如图 6所示, 对总细菌门水平系统进化树进行分析, 两个样品中的细菌域主要有23类.在细菌域中, 比例最多的菌群为变形菌门(Proteobacteria), 其次是放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes), 接着是绿弯菌门(Chloroflexi).在变形菌门中, 样品A>样品B的含量, 在放线菌门中, 样品B>样品A的含量, 在厚壁菌门中, 样品B>样品A的含量, 在拟杆菌门中, 样品B>样品A的含量, 表明投加Fe₃O₄ NPs后, Actinobacteri、Firmicutes、Bacteroidetes能够很好适应投加Fe₃O₄ NPs的环境, 而Proteobacteria受到一定程度的抑制.从进化的角度进行分析, Bacteroidetes、Chloroflexi、Ignavibacteriae属于同一个簇, 进化关系较为接近; 衣原体(Chalmydiae)、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)和Verrucomicroba属于同一个簇, 进化关系较为接近.

为了更为全面地了解古细菌群落的变化情况, 如图 7所示, 在古细菌属分类水平进行分析, 未投加和投加Fe₃O₄ NPs的样品中优势菌群主要为:甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷丝菌属(Methanothrix)与Methanosphaerula.在投加Fe₃O₄ NPs后, Methanobacterium所占比例从76.15%增至86.76%, 而Methanothrix所占比例从17.10%降至7.51%, Methanothrix为乙酸型甲烷菌, Methanobacterium为产氢型甲烷菌, 投加Fe₃O₄ NPs对乙酸型甲烷菌产生了一定的影响, 这也体现在SMP的EEM中有机酸的吸收峰增强.整体而言甲烷杆菌属仍为优势菌群, 确保了厌氧反应器的稳定运行.主要原因在于, Fe₃O₄ NPs作为环境友好型材料投加入废水后, 即使在运行过程中, 出现铁离子的溶出, 由于溶出的铁离子是微生物生长所需的微量元素, 不会对微生物造成强烈的抑制, 表明采用Fe₃O₄ NPs多相类芬顿作为厌氧生物预处理是可行的.

如图 8所示, 对总细菌门分类水平不同菌群的具体比例进行分析, 未投加(A)和投加Fe₃O₄ NPs(B)的样品中优势菌群主要为:变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和绿弯菌门(Chloroflexi); 投加Fe₃O₄ NPs后, 变形菌门所占比例从66.44%降至47.16%, 放线菌门所占比例从8.97%增至17.33%, 拟杆菌门所占比例从8.07%增至17.74%, 厚壁菌门所占比例从10.54%增加到12.50%.厚壁菌门可以通过水解酶降解糖类和蛋白质, 而拟杆菌门在厌氧生物处理的水解过程中起到关键性作用, 因此正如图 2所示投加Fe₃O₄ NPs后SMP中的多糖与蛋白含量有所降低, 表明Fe₃O₄ NPs对于厌氧生物处理的产酸过程具有一定的促进作用^[28].但变形菌门比例有所降低, 可能会对于反硝化及甲烷化带来一定的影响, 特别是当废水中氮含量较高时^[29].

(1) Fe₃O₄ NPs作为催化剂对厌氧反应器去除COD未造成明显的抑制; 且长期投加Fe₃O₄ NPs后, 厌氧颗粒污泥SMP中多糖与蛋白含量降低.但LB-EPS中紫外光区类腐殖酸荧光峰消失, 产甲烷菌的活性受到了一定的影响.

(2) 长期投加Fe₃O₄ NPs后, 甲烷杆菌属与甲烷丝菌属仍为优势菌种, 特别是甲烷杆菌属占86.76%;而拟杆菌门、厚壁菌门所占比例增加, 可保障厌氧生物处理产酸与产甲烷过程的顺利进行.

(3) Fe₃O₄ NPs作为一种环境友好纳米材料, 在本实验中投加量小于150 mg ·L^-1时, 未对厌氧颗粒污泥特性造成明显影响, 因此采用Fe₃O₄ NPs多相类芬顿作为预处理单元, 处理含有毒物质或难生物降解工业废水时, 其本身不会对后续的厌氧生物处理单元造成不利影响.