环境科学  2018, Vol. 39 Issue (3): 1272-1277   PDF    
引用本文
顾澄伟, 陈方敏, 李祥, 黄勇, 尤星怡, 金润, 张文静, 董石语. 纤维载体的生物膜CANON反应器的启动特性[J]. 环境科学, 2018, 39(3): 1272-1277.
GU Cheng-wei, CHEN Fang-min, LI Xiang, HUANG Yong, YOU Xing-yi, JIN Run, ZHANG Weng-jing, DONG Shi-yu. Analysis of CANON Process Start-up with Fiber Carrier[J]. Environmental Science, 2018, 39(3): 1272-1277.
纤维载体的生物膜CANON反应器的启动特性
顾澄伟1,2, 陈方敏1,2, 李祥1,2, 黄勇1,2, 尤星怡1,2, 金润1,2, 张文静1,2, 董石语1,2     
1. 苏州科技大学环境科学与工程学院, 苏州 215009;
2. 苏州科技大学环境生物技术研究所, 苏州 215009
收稿日期: 2017-08-12; 修订日期: 2017-09-01
基金项目: 国家重点研发计划项目（2016YFC0401103）；国家自然科学基金项目（51478284，51408387）；江苏省特色优势学科二期项目；江苏省水处理技术与材料协同创新中心项目；苏州市分离净化材料与技术重点实验室项目（SZS201512）
作者简介: 顾澄伟(1993~), 男, 硕士研究生, 主要研究方向为水污染理论与控制, E-mail:2242291405@qq.com
通信作者: 李祥, E-mail:lixiang@mail.usts.edu.cn
摘要: 为研究纤维载体在CANON工艺中的运行特性，同时接种亚硝化污泥及厌氧氨氧化污泥启动CANON反应器.结果表明经过85 d运行，成功启动了CANON反应器，NRR从0.09 kg ·（m3 ·d）-1提升至0.9 kg ·（m3 ·d）-1并能稳定运行，说明纤维载体有利于富集污泥，反应器内能维持较高的生物量.随着微生物的富集生长，生物膜变厚，反应器的能力提升，反应器中DO达到5 mg ·L-1.利用微电极测得生物膜由表及里的DO梯度为0.32~0 mg ·L-1，说明生物膜变厚，氧对生物膜的穿透力减弱，亚硝化微生物量降低.荧光定量PCR结果表明，启动前后NOB菌数量维持在较低水平，AOB菌的丰度增长不大，ANAMMOX菌细胞增长了一个数量级.
关键词: CANON工艺      启动      亚硝化      厌氧氨氧化      定量PCR     
Analysis of CANON Process Start-up with Fiber Carrier
GU Cheng-wei1,2 , CHEN Fang-min1,2 , LI Xiang1,2 , HUANG Yong1,2 , YOU Xing-yi1,2 , JIN Run1,2 , ZHANG Weng-jing1,2 , DONG Shi-yu1,2     
1. School of Environment Science and Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China;
2. Institute of Environmental Biotechnology, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China
Abstract: A CANON reactor with fiber carrier was started up by seeding nitrification sludge and ANAMMOX sludge to study the operating characteristics of a fiber carrier. The results showed that total nitrogen removal load rose from 0.09 kg·(m3·d)-1 to 0.9 kg·(m3·d)-1 and remained steady in the 85th day. This indicated that fiber carrier is beneficial to the accumulation of sludge, and the reactor can maintain a higher biomass. The DO in the reactor reached 5 mg·L-1 with the enrichment of microorganisms, biofilm thickening, and the improvement of the reactor's ability. The DO gradient of the biofilm from the outside to the inside was 0.32-0 mg·L-1, which could be obtained by a microelectrode. It was shown that the permeability of oxygen to the biofilm decreased, and the amount of nitrifying microorganisms decreased with biofilm thickening. The quantitative PCR results showed that the abundance of ANAMMOX was an order of magnitude more than before. The abundance of AOB increased slightly, while the abundance of NOB stayed at a relatively low level.
Key words: CANON process      start-up      nitrosation      ANAMMOX      quantitative PCR     

近年来, 厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation, ANAMMOX)技术的发展, 为氨氮废水尤其是有机碳源低的高氨氮废水提供了一个切实有效的方法.其与传统生物脱氮工艺相比具有耗能低, 效率高, 无需要添加有机碳源, 污泥产量低等诸多优点, 适用于许多高氨氮废水的处理[1~5].而ANAMMOX反应需要氨氮和亚硝氮作为反应基质, 因此, 应用ANAMMOX的前提是实现短程硝化, 在此基础上, 多种以ANAMMOX为主要手段的脱氮工艺被开发出来.这些工艺主要分为两类, 一类是亚硝化和ANAMMOX分开在两个反应器中进行的工艺, 代表工艺为SHARON-ANAMMOX工艺; 另一种工艺是亚硝化和ANAMMOX在一个反应器中进行的工艺, 代表工艺为CANON(completely autotrophic nitrogen removal over nitrite)工艺.

CANON工艺的启动方法大多是以生物膜为载体或者是颗粒污泥技术, 其原理主要在膜外或颗粒污泥表面形成好氧区实现短程硝化, 在膜内及颗粒污泥内部形成厌氧区实现厌氧氨氧化, 这样得以实现联合脱氮[6].

利用生物膜法启动CANON工艺可以起到增加反应器单位体积的污泥浓度, 提高功能菌的单位体积数量.研究表明海绵、火山岩及活性炭等填料有利于微生物依附于其表面和内部孔道, 维持反应器内较高的生物量, 相比较而言, 聚乙烯填料黏附性差, 表面积小不具备保留污泥[7~10].本实验试图以纤维载体为填料, 同时接种亚硝化污泥和ANAMMOX絮状泥启动CANON, 研究生物膜在反应器中的运行特性, 以期为研究CANON反应器不同的运行方式提供依据.

1 材料与方法 1.1 实验装置

本实验采用30 cm×15 cm×100 cm的反应器, 如图 1所示, 由有机玻璃制成, 有效体积为38.25 L, 废水从反应器底部进入, 由上部出水口排出, 反应器内挂有带状的辫带式填料.进水方式由蠕动泵控制稳定连续流, 曝气量由转子流量计调节, 运行温度维持在33℃±1℃, 反应器整体pH控制在8.0左右.

1.配水桶; 2.蠕动泵; 3.空气泵; 4.曝气条; 5.纤维载体; 6.加热棒; 7.出水口; 8.三相分离器 图 1 CANON反应器实验装置示意 Fig. 1 Schematic diagram of test equipment for the CANON reactor

1.2 接种污泥与进水水质

亚硝化污泥来源于实验室的亚硝化反应器, 厌氧氨氧化污泥来源于实验室长期运行的厌氧氨氧化种泥反应器出水絮状污泥.

用水采用人工配水, 在自来水中添加适量的NH4HCO3、NaHCO3与KH2PO4配制而成.考虑到自来水中含有大量的微量元素, 因此在原水中不再投加微量元素.由于自来水中含有接近饱和的溶解氧, 在实验过程中也没有对原水进行吹脱, 且大气中的氧气也会不断溶于水, 因此原水中会有一定的NO2--N, 自来水中的NO3--N是进水中的NO3--N来源, 但含量很少, 可忽略不计.

1.3 分析方法

NH4+-N采用纳氏分光光度法(哈希2800, 美国); NO2--N和NO3--N采用离子色谱法(戴安IS-9001, 美国); pH值采用pHS-3E型酸度计测定; DO采用溶氧仪测定.

1.4 荧光定量PCR

ANAMMOX、AOB及NOB定量实验所用的引物对分别是AMX809F/AMX1066R, AOB16sF/AOB16sR, NOB16sF/NOB16sR, 其引物序列如表 1所示.

表 1 ANAMMOX、AOB及NOB菌Real-time PCR引物及反应条件 Table 1 Primers and parameters of the real-time PCR

为了考察启动前后ANAMMOX、AOB及NOB细菌丰度的变化, 对启动前后的污泥进行了定量PCR实验.采用20 μL反应体系, 其中包括0.8 μL上游引物, 0.8 μL下游引物, 2 μL基因组DNA, 0.4 μL ROXⅡ, 2 μL Dntp, 10 μL EXTaqⅡ, 6 μL超纯灭菌水.每个样品重复3次, 取其平均值.反应程序为：95℃预变性5 min, 接40个循环, 每个循环包括95℃变性30 s, 57℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 最后延伸5 min.

将提取好的基因组DNA采用PCR扩增后进行纯化回收, 提取的DNA样品用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测, 然后送入上海生物工程有限公司进行测序, 制作标准品.将制作好的标准品梯度稀释后进行荧光定量PCR(ABI7500, 美国)检测, 得到标准曲线.

2 结果与讨论 2.1 CANON工艺启动阶段氮素的变化

反应器启动初期, 保证污泥能够吸附在生物载体上, 避免污泥流失.控制反应器内pH值为8.0±0.1, 温度为33℃±1℃, 使得AOB处于最佳的生存条件, 从而获得稳定的亚硝酸盐积累.为避免DO对ANAMMOX菌的影响, 以及亚硝酸氧化菌(nitrite oxidizing bacteria, NOB)和AOB形成竞争关系, 根据它们的氧半饱和常数不同(分别为2.2 mg·L-1和0.6 mg·L-1), 在初期控制反应器中DO浓度为0.5 mg·L-1.这样AOB活性可以不受影响并充分利用DO进行半短程硝化, 而NOB活性受到影响从而抑制硝化反应发生.

从氮素变化(图 2)可知, 在开始的10 d, 进水NH4+-N浓度从100 mg·L-1上升到350 mg·L-1, 出水NH4+-N、NO2--N、NO3--N浓度分别稳定在40、8、20 mg·L-1, 总氮去除速率(NRR)从0.09 kg·(m3·d)-1上升到0.45 kg·(m3·d)-1, 并且发现反应器内污泥有贴壁生长的现象.在10~55d进水NH4+-N浓度在300~350 mg·L-1之间波动, 出水NH4+-N先快速增长到100 mg·L-1左右, 出水NO2--N浓度只有25 mg·L-1左右, 出水NO3--N浓度在30 mg·L-1左右, 此时总氮去除速率为0.6 kg·(m3·d)-1, 反应器内纤维载体和壁上出现红色细小颗粒污泥.当进水NH4+-N浓度达到400 mg·L-1时, 不再提升浓度, 通过缩短HRT来提升进水负荷.到85 d反应器的NRR达到0.9 kg·(m3·d)-1左右并能稳定运行, 此时进水NH4+-N浓度为410 mg·L-1左右, 出水NH4+-N、NO2--N、NO3--N浓度分别稳定在40、30、35 mg·L-1左右.其中HRT为8 h, 反应器中的DO浓度达到了5 mg·L-1.在DO浓度为5 mg·L-1以下, 反应器出水NO3--N浓度能够维持在35 mg·L-1左右, 说明NOB并没有处于竞争优势.由已有报道得知当温度大于25℃时, AOB的生长速率大于NOB形成竞争优势[14], 当pH在8.0左右时AOB与ANAMMOX的反应速率最大[15~17], 本实验控制温度在33℃左右, pH在8.0左右, 在此条件下AOB对氧的竞争优势大于NOB.

图 2 启动过程中氮素变化 Fig. 2 Variations of nitrogen concentrations during startup

2.2 CANON工艺运行效果

反应器的脱氮能力总体来看是一直在稳步上升的, 到稳定阶段总氮去除能力维持在0.9 kg·(m3·d)-1左右(图 3).在反应器稳定运行一段时间后总氮去除能力开始降低, 但又很快恢复, 这是由于随着运行时间延长, 膜上生物不断生长使得生物膜变厚, 营养基质从膜外传到膜内阻力增大, ANAMMOX细菌得不到足够的营养基质导致除氮效率降低.此时, 将反应器中的膜取出, 刮掉表面的一层膜.在刮下的污泥中发现有一部分泥已经发黑发臭, 这说明膜内有部分微生物因得不到营养基质已经死亡.刮膜后3 d NRR就恢复到原来的0.9 kg·(m3·d)-1左右并能够再次稳定运行.膜内ANAMMOX泥没有受到抑制, 只是生物膜变厚, 在膜内的AOB菌因接触不到氧而数量减少, 不能产生足够的亚硝酸盐, 使得反应器表现出能力下降的现象.需要注意的是如果不及时将死亡的污泥清除, 微生物死亡后所产生的有机物及毒素会对反应器内的AOB及ANAMMOX细菌产生毒害作用, 降低反应器脱氮能力甚至导致反应器系统失稳.

图 3 启动过程中速率变化及ΔNO3--N/ΔTN Fig. 3 Speed change and ΔNO3--N/ΔTN during startup

ANAMMOX菌要能够实现脱氮功能需要NH4+-N、NO2--N作为基质, 因此反应器中亚硝酸盐的积累也是CANON工艺启动过程中一个很重要的参数.在反应器中亚硝酸盐生成速率(NPR)与NRR是一样的趋势, 在稳定阶段NPR与NRR保持稳定, 并占总氮去除速率的60%左右(图 3).这与CANON工艺中保证进水中的NH4+-N有50%~60%被短程硝化转化为亚硝酸盐, 接着ANAMMOX菌利用剩下的NH4+-N和NO2--N进行厌氧氨氧化反应实现脱氮效能, 说明此时CANON工艺的运行状态良好.

CANON工艺运行稳定的另一个判定依据就是ΔNO3--N/ΔTN, 当CANON工艺运行良好时ΔNO3--N/ΔTN的理论值为0.127.本实验中ΔNO3--N/ΔTN在开始的10 d里从一开始的0.6左右降到0.12左右, 之后就一直稳定在0.12左右, 说明在刚开始阶段NOB菌在反应器中处于优势, 之后随着控制反应器中的运行条件, NOB菌被抑制, AOB和ANAMMOX菌处于良好的生存环境.本实验中ΔNO3--N/ΔTN的平均值为0.133, 较理论值0.127及其他研究人员所得的比值均高[10, 18], 这是因为反应器中的DO浓度达到了5 mg·L-1, 在高溶解氧下还是存在一定的硝化反应使得出水硝酸盐较理论值偏高.

综上所述, 以纤维载体为填料, 同时接种亚硝化污泥及ANAMMOX泥启动CANON工艺, 历时145 d反应器可成功启动CANON工艺.在启动初期, ANAMMOX菌并没有受到DO的影响.这是由于纤维载体利于污泥挂膜, 形成生物膜不易流失, 使得ANAMMOX泥处于纤维载体内部的厌氧区, 亚硝化泥处于纤维载体表面的好氧区, 快速构成了CANON工艺模式.经过85d TN去除负荷达到了0.9 kg·(m3·d)-1, 但随着运行时间增长, 生物膜越长越厚会影响TN去除负荷, 需要刮泥, 刮完泥后能很快恢复.虽然运用纤维载体作为填料启动CANON工艺长时间运行时需要刮泥, 但是考虑到它能够快速启动CANON工艺, 并且刮下的泥是成熟的CANON污泥, 也可以用来处理高氨氮废水.因此纤维载体有利于快速启动CANON工艺.

2.3 生物膜中DO的变化

CANON是一种AOB与ANAMMOX菌在同一个反应器内的工艺, AOB是好氧菌而ANAMMOX菌是厌氧菌, 因此DO对于CANON是一个至关重要的参数.本实验在后期稳定阶段DO达到了5 mg·L-1, 这与文献[19~22]报道的高DO下CANON工艺容易脱稳失活, 脱氮过程被抑制有很大的不同, 这可能与生物膜的厚度有关.本实验所用的纤维载体填料, 这种填料利于生物体吸附从而促进生物膜生长, 使得膜内外DO梯度明显.生物膜变厚, 原先的好氧区会变成厌氧区, 导致好氧微生物量减少, 因此需要提高DO浓度来提高氧对生物膜的穿透力[23~25].但生物膜的内部还是处于厌氧状态, ANAMMOX菌不会受到DO的影响.为验证这一猜想, 采用微电极测定生物膜由表及里的DO的变化.取小部分膜测定DO变化, 结果如图 4所示.从中可以看出, 生物膜的表面处于缺氧状态, 随着生物膜厚度增加, DO不断下降, 在距离生物膜表面1000 μm处DO几乎为0.这符合CANON工艺形成状态, 厌氧菌由好氧菌包裹, 在膜内部形成适合厌氧菌生存的厌氧环境.为了让CANON工艺处于良好的运行状态, 生物膜厚度与DO之间要匹配恰当.

图 4 生物膜内DO变化 Fig. 4 DO change in the biomembrane

2.4 菌群的丰度

本实验还通过定量PCR研究了各阶段反应器内AOB、ANAMMOX和NOB的丰度, 如表 2所示.结果表明, 随着反应器中微生物的生长, 反应器内ANAMMOX菌和AOB均有较大增长, NOB的丰度一直维持在较低的水平, 其中ANAMMOX菌的丰度增长了一个数量级, AOB的丰度增长了2倍.主要脱氮菌AOB和ANAMMOX菌都有所增长, 系统能够维持良好的脱氮能力(图 3).根据文献得知, CANON反应器中NOB的过量增殖会改变系统的脱氮途径, 使反应器的总氮去除能力下降, 这是CANON反应器崩溃的主要原因之一.在本实验中可以看到NOB一直维持在较低的水平, 这样短程硝化-厌氧氨氧化是主要的脱氮途径, 并且运行良好.从挂膜前后生物载体上泥的形状也可以看出ANAMMOX菌的增长, 在稳定阶段的生物载体上挂满了红色的生物膜(图 5), 这是ANAMMOX菌的典型特征之一.

表 2 实验各阶段反应器内菌群丰度(平均值) /copies·g-1 Table 2 Abundance of microbial communities in each phase (average)/copies·g-1

图 5 启动前后生物膜变化 Fig. 5 Biofilm changes before and after startup

3 结论

(1) 以纤维载体为填料, 同时接种亚硝化污泥和ANAMMOX泥, 控制pH、温度分别在8.0, 33℃左右, 在初始DO浓度为0.5 mg·L-1条件下可成功启动CANON工艺.启动初期也有总氮损失, 说明ANAMMOX泥在膜内并没有受到DO的影响, 并在膜内快速富集, 很快由原来灰褐色变成了ANAMMOX泥典型的红色特征.

(2) 随着生物膜越长越厚, 反应器所需的DO也越来越高, 从最初的0.5 mg·L-1提升至5 mg·L-1.为防止膜内微生物死亡, 需要及时刮泥.

(3) 通过定量PCR技术分析得出纤维载体填料有利于ANAMMOX泥的富集生长.在适宜的条件下, ANAMMOX菌的丰度很快就能比原来多一个数量级.同时控制合理的pH及温度可以很好地抑制NOB生长.

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