2018, Vol. 39
2. 中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室, 长沙 410125;
3. 湖南省农业科学院土壤肥料研究所, 长沙 410125;
4. 宁乡县回龙铺镇农业服务中心, 长沙 410606
, LIU Yi2
, TANG Hai-ming3 , SUN Zhi-long4 , LI Bao-zhen2 , GE Ti-da2 , WU Jin-shui1,2
2. Key Laboratory of Agro-ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China;
3. Hunan Soil and Fertilizer Institute, Changsha 410125, China;
4. Integrated Service for Agriculture Ningxiang County Huilongpu Town, Changsha 410606, China
土壤微生物不仅驱动着土壤物质转化和养分循环, 还可作为土壤中植物有效养分的储备库[1].因此, 土壤微生物在农业土壤生态系统中的作用日益受到关注.施肥不仅能显著增加土壤肥力、改善土壤容重、水分含量和团聚体含量等物理化学性质, 同时对土壤微生物的数量、多样性和活性等也会产生显著影响[2~6].已有研究结果表明, 化肥配施有机肥和单施化肥均能增加土壤中微生物生物量碳的含量[7].李秀英等[8]的研究发现化肥配施有机肥不仅能增加土壤细菌、放线菌和真菌数量, 还能促进固氮菌、氨化菌等功能菌的繁殖, 对土壤氮素循环有重要作用.陈晓芬等[9]的研究表明施用有机肥能显著提高土壤有机碳、全氮及微生物量碳、氮的含量.王晶等[10]的研究也发现, 施用化肥处理的土壤微生物量显著高于对照处理(不施肥处理); 然而, 长期施肥对稻田土壤微生物量、群落结构和活性的影响仍不明确.
随着研究的深入, 越来越多的方法被应用到对土壤微生物的研究中.其中磷脂脂肪酸(PLFA)分析技术以其能够快速、直接、有效地分析出微生物含量、组成及群落信息等优点而被广泛应用在对土壤微生物的研究中[11~14].在对微生物群落水平生理特征的研究方面, 可以同时分析土壤微生物群落结构、微生物活性的MicroRespTM方法受到了越来越多研究者的欢迎, 与传统微生物平板培养法、Biolog微平板法和多重底物诱导呼吸(Multi-SIR)相比较, MicroRespTM方法具有分辨率高、原位性好、操作更为简便等优点, 被认为是一种具有广阔应用前景的分析微生物活性和群落结构的方法[15], 目前已经在不同生态系统类型的研究中得到了广泛的应用. Macdonald[16]等利用MicroRespTM方法研究了土地利用方式的改变对草地土壤微生物的影响, 发现土地利用、管理方式是影响草地土壤微生物代谢活性的关键因素. Wakelin等[17]的研究发现土壤类型比农业管理措施更能决定土壤微生物的代谢功能. Licona[18]利用MicroRespTM方法研究了耕地和草地土壤微生物群落对铬元素的反应, 发现土壤微生物群落对添加的铬元素反应强烈.
本研究以湖南宁乡稻田长期定位试验为平台, 采用长期不同施肥处理的定位试验土壤, 经相同淹水处理(9 d)后, 采用PLFA和MicroRespTM技术对土壤微生物量、群落结构和活性进行分析, 通过明确长期不同施肥处理的土壤微生物量、群落结构和活性的差异, 以期为提高该地区土壤肥力、促进土壤养分良性循环提供有效的科学支撑.
1 材料与方法 1.1 试验地点田间试验于1986年设立, 位于湖南省宁乡县农技中心(112°18′E, 28°07′ N), 该地区是典型的双季稻主产区, 平均海拔36.1 m, 年均气温16.8℃, 年均降雨量1 553.70 mm, 年蒸发量1 353.9 mm, 年均无霜期在274 d左右.本文所用土样均采自排灌条件良好的河沙泥水稻土, 肥力中等.
1.2 试验设计与土壤样品的采集田间试验共设4个施肥处理(表 1)：①全化肥处理(NPK)：仅施氮磷钾化肥; ②秸秆还田+化肥处理(ST)：施用上一年度晚稻收割的秸秆和化肥; ③30%有机肥+70%化肥(OM)：施用的有机肥含有的氮素含量占总氮肥施用量的30%, 剩余的70%由含氮化肥补充; ④无肥对照(CK)：不施加任何肥料.
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表 1 4种不同施肥处理土壤的基本性质1) Table 1 Basic soil properties for the four different fertilizer treatments |
土壤样品于2016年6月30日采集, 采用蛇形采样法, 每个小区分5点采样, 采集耕作层(0~20 cm)土壤约4 kg并混匀.从采集的新鲜土样中取2份.一份200 g风干磨碎过100目筛用于土壤基本理化性质的测定.一份500 g过2 mm筛后混匀, 淹水2~3 cm培养9 d后重新采样, 取其中300 g用于土壤微生物生物量的测定和MicroRespTM分析; 剩下的经冷冻干燥后于-70℃冰箱保存, 用于PLFA的测定.每种施肥处理做3个重复.
1.3 样品分析 1.3.1 样品基本理化性质的测定pH测定以水为浸提剂, 水土比为2.5:1, 土壤全磷的测定是采用氢氧化钠熔融-钼锑抗比色法[19].土壤总碳和总氮采用碳氮元素分析仪(VARIO MAX C/N, Germany)测定(干烧法).土壤微生物量碳(MBC)采用氯仿熏蒸提取-碳自动分析法测定[20].称取4份新鲜土样, 每一份土壤25.00 g(烘干基), 其中2份作为未熏蒸对照直接加入0.5 mol·L-1 K2SO4溶液, 振荡(3 000 r·min-1)30 min后提取.另2份在真空干燥器内用氯仿熏蒸(24 h), 除去氯仿后立即同上提取.取10.00 mL提取液与10.00 mL六偏磷酸钠溶液(c=50 g·L-1, pH=2.0)混合后以碳自动分析仪(Phoenix 8000)测定提取的有机碳.以熏蒸土样与不熏蒸土样提取的有机碳的差值乘以转换系数KC(2.22)计算土壤MBC含量.
1.3.2 磷脂脂肪酸(PLFA)的测定磷脂脂肪酸是按照改进后的Bligh-Dyer方法进行提取[21], 使用美国MIDI公司的磷脂脂肪酸数据库对提取物进行定量和定性分析[22].具体步骤如下：首先, 称取2.00 g经过冷冻干燥的土样, 用氯仿:甲醇:柠檬酸缓冲液(c=0.15 mol·L-1, pH=4.0)=1:2:0.8(体积比)共22.8 mL分两次提取, 通过SPE柱洗脱分离得到磷脂, 添加内标十九烷酸甲酯后, 采用温和甲基化方法甲酯化后用气相色谱仪(N6890, Agilent, USA)分离后由与其相连的火焰离子检测器(FID)进行定性和定量分析.含量用其中脂肪酸甲酯的摩尔百分比表示.
一般脂肪酸的命名格式为(a/i)X:YwZ(c/t), 其中X表示碳原子数, Y表示双键数, 中间以冒号隔开; w为自甲基端起双键的位置, Z表示双键所在的碳原子位置; c/t表示顺/反式脂肪酸; a/i表示反式/异式支链脂肪酸; cy为环状脂肪酸, 10Me表示距离羧基末端第10个碳原子上有一个甲基团.
本文中表示不同类群土壤微生物的特征磷脂脂肪酸见表 2.
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表 2 表征土壤微生物类型的特征磷脂脂肪酸 Table 2 PLFA characterizing microbes |
1.3.3 MicroRespTM分析
配制质量分数为3%的琼脂粉混合液在121℃下灭菌30 min后与甲酚红溶液(18.75 mg·L-1甲酚红, 16.77g·L-1氯化钾, 0.315g·L-1碳酸氢钠)按照1:2(体积比)的比例充分混匀后放置在60℃的水浴锅中; 将混合液加到96孔透明酶标板中, 每孔150 μL, 作为检测板, 用保鲜膜包好放在装有生石灰的干燥器中备用.
将土样过10目筛后均匀地加入到96孔深孔板中并记录平均每孔样品重, 将25 μL不同碳源加入到对应深孔中, 碳源种类和浓度如表 3所示, 将做好的检测板倒扣在深孔板上, 中间用橡胶垫片隔开, 使孔与孔一一相对扣紧, 用夹具固定后放在25℃, 避光条件下培养6 h.根据微孔板检测指示剂对特定波长光的吸收情况来计算土壤中的微生物在6 h内CO2的产生率(%).
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表 3 MicroRespTM深孔板中所添加的碳源种类和含量 Table 3 Concentrations of different carbon sources added into the deep-well of MicroRespTM |
CO2产生率和指示剂对特定波长光的吸收值变化的标准曲线根据以下公式进行计算[15]：
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式中, A=-0.226 5, B=-1.606, D=-6.771.
采用下述公式将数据规范化：
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式中, At6为样品添加碳源并培养6 h后检测板的吸光值; At0为样品未添加碳源培养时检测板的吸光值
CO2产生率[μg·(g·h)-1]根据下式计算：
CO2产生率=(CO2×100%)×L×(44/22.4)×(12/44)×[273/(273+T)]/(W×U)/t
式中, T为培养温度(25℃), L为检测板孔体积(945 μL), W为土壤鲜重, U为土壤含水率, t为培养时间(6 h)
1.4 数据处理试验数据采用Microsoft Excel 2010和SPSS20.0统计软件处理和分析; 多重比较采用Duncan法计算检验差异显著性(3次重复).不同处理差异显著性用One-wayANOVA(单因素方差分析)检验, 用Canoco4.5做磷脂脂肪酸主成分分析.
2 结果与分析 2.1 土壤各菌群磷脂脂肪酸含量的变化4种不同施肥处理的土壤总PLFA含量之间存在显著差异(图 1), OM处理的土壤总PLFA含量最高(140.98 nmol·g-1), ST处理(130.11 nmol·g-1)和NPK处理(113.94 nmol·g-1)的次之; CK处理(98.71 nmol·g-1)的土壤总PLFA最低.相比CK处理, 细菌、真菌、放线菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌在3个施肥处理中均有一定幅度的增加, 尤其在ST和OM处理中显著增加.说明长期施肥促进土壤微生物的生长, 尤其是长期秸秆还田和施加有机肥显著促进土壤微生物的繁殖.
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CK代表不施肥处理, ST代表秸秆还田+化肥处理, NPK代表全量化肥处理, OM代表 30%有机肥+70%化肥处理，下同 图 1 4种不同处理土壤特征磷脂脂肪酸含量 Fig. 1 PLFA contents of four different fertilized paddy soils |
利用PCA对4种不同施肥处理的稻田土壤微生物群落结构进行分析后发现(图 2), 相比CK处理, NPK、ST和OM处理中微生物群落结构均发生了改变, 特别是ST和OM处理变化更为显著, 表明化肥配合秸秆还田或配施有机肥能够显著改变微生物的群落结构.
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图 2 4种不同施肥处理的土壤微生物特征磷脂脂肪酸主成分分析 Fig. 2 Principal component analysis of PLFAs structures in the four different fertilized paddy soils |
各菌群PLFA含量与土壤性质的相关性分析如表 4所示, 4种不同施肥处理的土壤有机碳含量与总PLFA、细菌PLFA、革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌PLFA含量呈显著正相关(P＜0.05), 说明土壤有机碳是4个施肥处理中微生物量和群落结构存在显著差异的核心驱动因子.
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表 4 各菌群PLFA和土壤理化性质的相关性分析 Table 4 Correlation between soil PLFAs and soil physiochemical properties |
2.4 MicroRespTM结果分析
MicroRespTM结果如图 3所示, 4种不同处理的土壤微生物基础呼吸值分别为, CK处理0.56 μg·h-1, NPK处理0.50 μg·h-1, ST处理0.60 μg·h-1, OM处理0.98 μg·h-1, 表明化肥配合秸秆还田或配施有机肥能够促进土壤微生物的碳代谢活性.添加15种不同碳源后, 在碳源为丙氨酸, 半乳糖, 阿拉伯糖和果糖时, OM处理的土壤碳源利用率显著高于其他3种施肥处理, 且15种碳源中只有精氨酸对土壤微生物呼吸起抑制作用, 其二氧化碳产生率小于基础呼吸值.在OM和CK中, 碳源为酮戊二酸时的二氧化碳产生率最高, ST处理土壤在碳源为赖氨酸时, 其二氧化碳产生率在全部的15种碳源中最高, 在碳源为果糖时, 全量化肥处理土壤的二氧化碳产生率最高, 说明不同施肥处理土壤微生物对不同碳源利用的偏好情况存在明显差异.
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图 3 4种不同处理土壤添加15种碳源和水在6h内的诱导产生CO2的平均速率和空白基础CO2产生的平均速率 Fig. 3 Respirometric evolution of carbon dioxide after 6 hwith addition of 15 different C sources and 0 blank for the four different fertilized paddy soils |
已有研究表明, 施肥能显著增加土壤微生物量[27]. Hatch等[28]的研究认为无机肥和有机肥配施能够明显增加土壤微生物量.本研究中, 相比于CK处理, 无论是NPK或ST处理还是OM处理, 长期施肥都不同程度地增加了土壤微生物量(图 1).对于NPK处理来说, 一方面含N、P、K化肥的施入为土壤微生物的生长提供了直接而充足的矿质养分, 另一方面含N、P、K化肥的施入在促进水稻生长的同时也增加了土壤中植物残留和根系分泌物, 为土壤微生物的生长繁殖提供了更多的碳源和养分.对于ST和OM处理来说, 在施入化肥的同时, 配合秸秆还田(ST)或配施有机肥(OM)增加了土壤有机质和有效养分含量, 为土壤微生物特别是异养微生物的生长和代谢提供物质和能量来源, 从而有利于微生物的繁殖.这与之前的研究结果一致[29, 30].例如, 孙瑞莲等[31]的研究发现, 化肥与有机肥长期配合施用能明显提高土壤有机质和氮磷钾养分含量, 促进微生物代谢和繁育.朱海平等[32]的研究也发现, 不同培肥管理措施对土壤有机质养分含量和微生物生态特征有显著影响, 其中施用猪厩肥产生的影响最大, 化肥产生的影响最小.
本研究中, 通过对4种不同施肥处理的土壤微生物磷脂脂肪酸相对含量进行主成分分析后发现：与CK相比, 其他3个处理土壤微生物群落结构都发生了变化, 其中ST和OM处理的群落结构改变尤为明显(图 2), 这可能与不同施肥处理中土壤有机质含量变化紧密相关(表 1和3).施加N、P、K肥料能促进水稻根系生长, 产生更多留田根茬和根系分泌物, 能够诱导某些适应此类环境的微生物选择性地富集, 从而土壤微生物的群落结构发生了改变.而秸秆还田或有机肥的施用则是直接增加了土壤有机质含量, 调节和优化了土壤C/N, 为土壤微生物的生长繁殖提供更多的能源、养分及适宜的土壤环境, 导致土壤中微生物群落结构发生显著改变.孟庆杰等[33]的研究也证实了施肥制度能够显著影响土壤微生物的多样性.武晓森等[34]的研究结果表明秸秆还田和有机无机配施能够显著提高微生物活性.本研究的MicroRespTM结果显示, ST和OM处理的土壤微生物基础呼吸值均高于CK处理, 表明无机化肥配合秸秆还田或配施有机肥能够促进土壤微生物对碳的代谢活性.而NPK处理相比CK处理略低.其原因可能是化肥的长期施用, 尤其是含氮化肥, 能够使土壤C/N比降低, 使土壤中原有有机碳加速分解, 导致土壤中积累的有机碳含量下降, 因而影响了土壤微生物的活性.这与徐阳春等[35]和李娟等[36]的研究结果一致.另外, 添加15种不同碳源后, 发现不同施肥处理中土壤微生物对不同碳源利用的偏好情况存在明显差异, 说明长期不同施肥处理针对某些特定土壤微生物进行了富集和驯化, 导致不同的施肥处理中存在独特的土壤微生物群落, 从而导致对不同碳源的代谢活性产生显著差异.张奇春等[37]的研究发现施用有机肥可以迅速提高土壤环境细菌和真菌的种类和数量, 从而改善土壤的生态环境.郭隽馥[38]的研究表明长期施用氮肥可以改变土壤细菌群落结构.武发思[39]的研究也发现不同施肥处理对根际细菌群落结构影响不同, 有机肥对细菌多样性的增加和群落结构的改变作用明显.
4 结论长期不同施肥处理能够影响稻田土壤养分、土壤微生物量、微生物群落结构和活性.虽然单施化肥对土壤养分含量和土壤微生物量、微生物群落结构和活性的影响不显著, 然而化肥配合秸秆还田或配施有机肥能显著改善土壤养分含量和土壤微生物量、微生物群落结构和活性, 其中化肥配施有机肥的效果最好.可见, 无机化肥合理配施有机肥对于培肥地力和优化土壤微生物群落极为重要.
致谢: 感谢中国科学院城市环境研究所姚槐应老师在PLFA测定和MicroRespTM方面提供的理论支持和技术指导！| [1] |
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