2017, Vol. 38
2. 哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室, 哈尔滨 150090
2. State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China
近些年来, 随着纳米材料的产量及应用范围的日益扩大, 纳米颗粒进入环境后对人类健康及生态系统具有的潜在风险也备受关注[1].这其中, 纳米TiO2作为产量最大的纳米材料之一, 因其独特的物化特性, 在化妆品制造、半导体工业及水处理行业中都有广泛地应用[2].因而也有越来越多的学者着手研究纳米TiO2的生物危害. Simonin等[3]发现纳米TiO2能显著影响硝化菌及反硝化古菌的活性及丰度, 而亚硝酸盐氧化菌的活性则基本不受纳米TiO2投加量的影响. Leung等[4]在比较纳米TiO2和纳米ZnO对E. coli的毒性作用时发现纳米TiO2对E. coli的毒性更强, 并认为这主要是由于纳米TiO2能显著抑制细胞膜上与清除超氧自由基(ROS)相关的抗氧化蛋白酶的正调控. Liu等[5]则发现纳米TiO2能破坏小球藻的光合膜结构, 进而导致藻细胞凋亡. Gu等[6]在评估人脐静脉内皮细胞在对纳米TiO2暴露的响应时发现纳米TiO2并不会导致内质网应激现象, 即纳米TiO2产生的ROS对人体细胞的氧化还原平衡尚不能造成显著危害.上述结论尽管对纳米TiO2对生物体是否具有抑制作用尚不能达成一致, 但足以说明不同生物体对纳米TiO2的暴露具有不同的响应.
作为纳米颗粒进入天然环境的最后“屏障”, 已有纳米TiO2在污水处理系统中检出的报道[7], 这些纳米颗粒95%以上都会被活性污泥吸附并截留, 这将导致活性污泥中的Ti含量可能要比进入高几个数量级[8].因此, 研究纳米TiO2对各活性污泥处理工艺中的微生物的影响是十分必要的.鉴于纳米TiO2在日化行业的大量使用, 研究适于处理日化工业废水的厌氧颗粒污泥处理工艺[9]对纳米TiO2暴露的响应尤为迫切.特别是在纳米TiO2持续暴露下产甲烷菌群与其它功能菌群关系的变化, 将有助于深入认识纳米颗粒对厌氧处理系统的影响, 并对纳米颗粒污染物的排放控制具有重要意义.然而, 目前现有研究多关注于短期暴露下纳米TiO2对厌氧微生物的影响, 缺乏开展长期暴露的响应研究[10~12].
因此, 本研究通过比较纳米TiO2急性及长期持续暴露下对厌氧颗粒污泥体系影响的异同, 具体分析了纳米TiO2对厌氧反应器运行稳定性的累积效应及其在反应器内的归趋, 结合厌氧颗粒污泥微生物种群结构的变化, 以揭示纳米TiO2对厌氧颗粒污泥微生物的抑制机制, 以期为应对厌氧污水处理体系中纳米TiO2的生态风险提供理论支持和参考依据.
1 材料与方法 1.1 厌氧颗粒污泥及纳米TiO2的特性试验所用厌氧颗粒污泥来自于处理大豆蛋白废水的EGSB反应器, 并在小试ASBR反应器中采用模拟废水驯化一个月, 此时污泥最大比产甲烷活性为(1.08±0.03)g·(g·d)-1.经分析污泥中Ti的背景值(以VSS计, 下同)为(1.7±0.3)mg·g-1.
其中, 模拟废水中的主要成分有：葡萄糖(7 000 mg·L-1)、碳源及磷源(500 mg·L-1NH4Cl、26 mg·L-1 K2HPO4·3H2O、酵母浸粉及胰蛋白胨各0.25 mg·L-1)、pH缓冲剂以及参考文献[13]矿物质培养基配置的微量元素液.
纳米TiO2购自Sigma-Aldrich公司, 纯度＞99.5%, 平均粒径为25 nm, 并用超纯水制备2 g·L-1的纳米TiO2贮备液, 在4℃下储存.对储备液中纳米TiO2形貌的观察结果如图 1所示.可见, 纳米TiO2颗粒以团聚体形式存在, 其尺寸约为(19.2±9.5)nm, 与MSDS描述基本一致.
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图 1 TEM下纳米TiO2形貌图 Fig. 1 TEM images of TiO2 NPs in isopropanol |
考虑到目前纳米TiO2在环境中的累积量及其持续扩大的使用范围必将导致更多的纳米TiO2向环境中释放[8], 短期暴露试验选用了5、30、150 mg·g-1这3种剂量来研究短期暴露下纳米TiO2对厌氧颗粒污泥各代谢阶段的影响.纳米TiO2对产酸阶段和产甲烷阶段的影响分别用末端发酵产物(VFAs)浓度及总产烷量占对照组相同参数的相对百分含量来确定.产酸阶段影响试验以葡萄糖(2 000 mg·L-1)为碳源, 同时加入30 μL BES抑制产甲烷菌活性.分别将驯化好的颗粒污泥(2 g·L-1)、培养液及一定量的纳米TiO2储备液共40 mL加入150 mL血清瓶后, 氮气吹脱5 min后用胶塞密封, 置于35℃±1℃的恒温摇床(110 r·min-1避光培养, 2 d后测定各血清瓶中VFAs的浓度.产甲烷阶段影响试验与产酸阶段影响试验的过程基本相同, 但以乙酸钠(2 000 mg·L-1)为碳源且不加入BES, 8 d内固定时间间隔测定甲烷产量.累计产烷量试验与产甲烷阶段影响试验的过程基本相同但采用葡萄糖(2 000 mg·L-1)为碳源.
1.3 长期暴露试验长期暴露试验在两个完全相同、有效容积为2.5 L的ASBR反应器(R1和R2)内进行.进水成分同上文模拟废水, 反应器水力停留时间为48 h.每24 h运行一个周期, 具体运行参数如下：进水10 min、沉降15 min、排水10 min, 其余为厌氧消化反应时间.加入纳米TiO2前, R1和R2先运行足够长时间直至两者出水参数差距在10%以下, 此时, 两反应器内的污泥浓度约为6 g·L-1.随后, 由蠕动泵随进水向R2反应器内打入纳米TiO2溶液(5 mg·L-1), R1则作为对照.长期暴露试验共进行90 d.
通过每日测定pH值、VFAs的含量和成分、生物气产量和成分、出水中纳米TiO2及Ti4+的浓度来监测反应器运行效果.
1.4 荧光原位杂交(FISH)本研究采用4种寡核苷酸荧光探针对厌氧颗粒污泥中特定的微生物种群进行定量分析, 探针信息见表 1.样品的预处理则参考了文献[14, 15]的方法.
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表 1 FISH中用到的荧光探针 Table 1 Oligonucleotide probes used in FISH |
为确定上述微生物的相对丰度, 将样品继续进行DAPI染色.在FV10i激光共聚焦显微镜下进行观察, 将杂交呈阳性的细胞与同视野下总活细胞数的比值定为该类微生物的相对丰度.
1.5 其它分析方法COD、SS、VSS及pH等的测定都采用标准方法.生物气及VFAs的含量及成分采用气相色谱法测定.出水及污泥经预处理后[7], 其中的Ti元素采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测定.
长期暴露试验结束后, 从R1及R2反应器底部随机采集10批厌氧颗粒污泥样品, 参照Alphenaar等[18]的方法对污泥进行预处理后, 在扫描电镜(SEM)下观察污泥对纳米TiO2的吸附及污泥形貌的变化, 并利用X射线能谱仪(EDX)对样品进行元素成分分析.
2 结果与讨论 2.1 纳米TiO2对厌氧颗粒污泥产甲烷过程的短期影响简单底物的厌氧消化主要经过产酸阶段和产甲烷阶段两个过程, 因此, 本文首先分别研究了在不同剂量纳米TiO2的短期暴露下, 厌氧产酸阶段VFAs及产甲烷阶段总产烷量的影响, 结果见图 2.从中可见, 即使纳米TiO2的剂量达到150 mg·g-1, 各VFAs产量及产烷量都与对照组没有明显差别(P＞0.05), 说明高剂量纳米TiO2的短期暴露对厌氧颗粒污泥中微生物的代谢不会产生显著抑制. Gonzalez-Estrella等[12]的试验结果也同样证实了高达1500 mg·L-1的纳米TiO2的短期暴露对厌氧消化过程不会产生抑制作用.这一现象可能缘于两方面的原因：首先, 厌氧颗粒污泥对各种化学物质的冲击负荷都具有非常好的抵抗能力, 它致密的结构和良好的沉降性能可大大减少包裹在胞外聚合物(EPS)内部的产酸菌及产甲烷菌与进水中化学物质的接触几率[19]; 此外, 纳米TiO2的急性毒性一般被认为主要来自于其在氧气及光照存在时所释放的ROS, ROS能扰乱生物细胞内的新陈代谢, 损伤细胞抗氧化功能进而破坏胞内脂类、蛋白质、多糖及DNA等物质[20]; 而本试验均是在无氧的暗环境下进行的, 极大限制了ROS的产量, 这也是纳米TiO2对厌氧消化过程具有低急性毒性更重要的原因.而上述试验结果对采用厌氧颗粒污泥工艺的城市污水厂应对高纳米TiO2进水冲击时也具有一定指导意义, 即如果及时采取处理措施, 纳米TiO2进水冲击负荷不会对系统稳定性产生明显影响.
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(a)产酸阶段; (b)产甲烷阶段 图 2 纳米TiO2短期暴露对厌氧颗粒污泥产酸阶段及产甲烷阶段的影响 Fig. 2 Effects of TiO2 NPs short-term exposure to the AGS on the steps of acidogenesis and methanogenesis |
尽管上述试验证明, 纳米TiO2对产酸阶段及产甲烷阶段这两个独立过程没有明显影响, 但实际厌氧消化过程中上述两阶段是相互融合彼此协调的.因此, 通过累积产烷量随时间的变化情况考察了纳米TiO2对完整的厌氧消化产烷过程的影响, 结果见图 3.可见, 无论是单独考虑产烷过程还是厌氧消化完整过程, 纳米TiO2对最终产烷量都没有明显影响, 但值得注意的是, 150 mg·g-1的纳米TiO2使累积产烷量在第2 d即明显滞后于其它试验组及对照组(P＜0.05), 直到第6 d之后产烷量才与其它试验组接近.这说明, 尽管高剂量纳米TiO2的短期暴露不会损害产甲烷菌的代谢能力, 但可使其产烷速率减慢, 结合纳米TiO2短期暴露同样未对产酸菌代谢能力产生明显抑制的结论(图 2), 可推断产烷速率的暂时性下降主要是传质速率的降低, 即高剂量纳米TiO2阻碍了厌氧颗粒污泥中微生物维持原本的代谢速率, 这可能是由于大量纳米TiO2堆积在颗粒污泥表面占据了污泥表面的活性点位, 从而阻碍了营养物质向颗粒污泥内部的扩散[21].
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*表示与对照组有明显差异 图 3 纳米TiO2对累积产甲烷量的影响 Fig. 3 Effects of different dosages of TiO2 NPs on cumulative methane production |
尽管短期暴露试验说明, 纳米TiO2冲击负荷不会厌氧颗粒污泥中的微生物产生明显抑制作用, 但上述结论并不一定适用于解释纳米TiO2对持续运行的厌氧污水处理系统的累积影响.因此, 为了考察纳米TiO2对的长期影响, 本研究连续监测了厌氧颗粒污泥反应器在纳米TiO2长期暴露下的运行情况, 结果如图 4所示.
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图 4 纳米TiO2对厌氧颗粒污泥反应器运行稳定性的长期影响 Fig. 4 Comparisons of the operational stability of the control and TiO2 NPs treated reactors under long-term exposure |
纳米TiO2的长期作用使得R2反应器内的VFAs呈现出不同的变化趋势.乙酸是唯一能被产甲烷菌作为底物直接利用的VFAs, 因此, R2反应器内乙酸浓度与R1接近且都保持了较低的水平暗示了两个反应器内的产甲烷菌都能够有效地代谢乙酸.换句话说, 与短期暴露试验结果相近, 纳米TiO2的长期作用对产甲烷菌的影响并不明显.运行35 d后R2反应器内的丙酸浓度开始高于R1反应器且差距持续拉大, 说明R2反应器内丙酸氧化菌群(即产乙酸菌)生长受抑制, 这一般被认为是厌氧反应器运行不稳定的标志之一, 这也说明产乙酸菌对纳米TiO2的长期暴露要比产甲烷菌更加敏感.但R2反应器内丁酸积累直到运行50 d后才出现且直至试验结束也没有超过75mg·L-1, 似乎暗示着食丁酸产乙酸菌的代谢受纳米TiO2的影响并不像食丙酸产乙酸菌那样明显. Collins等[22]和Schmidt等[23]的研究结果同样证实了食丁酸产乙酸菌在不良环境冲击下代谢速率要高于食丙酸产乙酸菌, 因为氧化丁酸的过程中能产生更多的能量且食丁酸产乙酸菌对化学物质冲击的适应能力更强.反应器运行超过一个月后才出现丙酸和丁酸积累也说明, 用短期暴露试验来研究纳米颗粒对厌氧体系的长期累积效应是具有一定局限性的.
经过90 d的运行, R2反应器内的产气量和甲烷产率分别下降了30.70%和14.01%, 且产气量的下降(第24 d)明显早于甲烷产率的下降(第51 d), 即纳米TiO2对CO2和H2产量的抑制相较于CH4不仅更早而且更显著, 这表明纳米TiO2对产酸菌具有更显著的抑制作用, 这一现象也与图 4中VFAs的试验结果一致.
鉴于短期及长期暴露试验都证明了纳米TiO2对产烷过程影响不明显, 考虑到本试验条件下基本限制了纳米TiO2生成ROS及纳米TiO2极低的溶解度[7], 即排除了ROS或金属离子释放导致的抑制作用, 再结合上述“纳米TiO2长期暴露对产酸菌比对产甲烷菌的抑制更明显”的试验结果, 可推断纳米TiO2对厌氧颗粒污泥的抑制机制主要发生在颗粒污泥外层, 是一种“物理遮蔽”作用.一般认为, 厌氧颗粒污泥内的功能菌群是层状分布的, 即外层主要为产酸菌而内层则分布着产甲烷菌[9].鉴于本试验中纳米TiO2的团聚体尺寸超过了66 nm(图 1), 只可能被截留在颗粒污泥表面或外层[24], 因此只有位于外层的产酸菌有机会接触到纳米TiO2, 而逐渐被颗粒污泥所吸附的纳米TiO2则可能通过占据活性点位、降低污泥与基质的接触面积或者阻塞物质代谢通道等方式在产酸菌与液相间建立起一道物理屏障阻碍产酸菌对营养物质的摄入.此时, 颗粒污泥的层状结构具有双重作用, 一方面纳米TiO2通过改变外层产酸菌附近的微环境条件干扰了产酸菌的正常代谢; 另一方面, 外层产酸菌为处于颗粒污泥内部的产甲烷菌提供了保护屏障以远离因纳米TiO2长期暴露导致的外界不良环境.
2.3 纳米TiO2在厌氧反应器内的归趋为确定纳米TiO2在厌氧反应器内的归趋, 对R2反应器出水中的化合态(TiO2)及离子态(Ti4+)的Ti含量进行了测定, 结果如图 5所示.
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水平线表示测试指标平均含量 图 5 出水中纳米TiO2及溶解性Ti4+的浓度 Fig. 5 TiO2 NPs concentration and soluble Ti4+ concentration in the effluent |
由图 5(a)结果可见, 出水中TiO2的平均含量只有0.632 mg·L-1, 说明绝大多数纳米TiO2都被厌氧颗粒污泥截留在了反应器内. Gómez-Rivera等[25]和Lombi等[26]在研究纳米颗粒在污水处理构筑物中的归趋时同样发现绝大多数纳米颗粒会被活性污泥所截留.但随着运行时间的延长, 出水中TiO2的含量有增高的趋势.这可能与纳米TiO2的团聚特性和R2反应器内微环境条件随暴露时间延长有所变化有关.有研究表明, 液相中的有机物成分能明显改变纳米颗粒的团聚行为[27].因此, R2反应器内VFAs的积累不仅是纳米TiO2长期暴露的结果, 同时也能反作用于纳米TiO2的团聚、迁移及沉降行为.由于纳米TiO2吸附了更多的有机酸, 使得颗粒之间的静电斥力和空间位阻增大, 进而阻碍了颗粒的聚集, 增强了纳米TiO2在液相中的稳定性[28].另一方面, VFAs的积累将导致pH值有所下降, 从而使液相pH值更加远离纳米TiO2的等电点, 范德华引力降低而静电斥力增加, 纳米颗粒的聚集体尺寸减小, 从而进一步增强了纳米TiO2随出水迁移的能力.
图 5(b)表明纳米TiO2的溶解度极低, 纳米TiO2的溶解行为与暴露时间无关, 也证实了之前的猜测, 纳米TiO2对厌氧颗粒污泥的抑制作用与Ti4+释放无关, 这也与之前的多项研究结果一致[29~31].
2.4 纳米TiO2长期暴露下厌氧颗粒污泥形貌及种群动态的变化SEM-EDS分析可直观反映纳米TiO2是否可被厌氧颗粒污泥所截留.长期暴露试验结束后, R2反应器内的颗粒污泥样品SEM图像[图 6(a)]显示了颗粒污泥表面沉积了多个颗粒团聚体, 而EDS分析证实所观察到的颗粒物即为TiO2.扫描电镜图像还反映出纳米TiO2长期暴露后颗粒污泥形貌的变化. R1反应器内的污泥样品表面均匀覆盖了EPS[32], 且大量的具有产酸菌典型形态的丝状、棒状及不规则球状细菌[33]被包裹在EPS内[图 7(a)].而R2反应器的污泥样品出现了局部EPS剥落, 细菌直接暴露在了外部, 表明颗粒污泥外层结构受损[34][图 7(b)], 这也间接证明了上文“纳米TiO2的长期暴露会对位于颗粒污泥外层产酸菌产生一定抑制作用”的结论.
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图 6 纳米TiO2长期暴露后厌氧颗粒污泥表面的扫描电镜及能谱分析图 Fig. 6 Typical SEM images and EDX analysis of granular sludge in the reactors exposed to TiO2 NPs for 90 days |
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(a)、(b)分别代表R1及R2反应器内颗粒污泥形貌 图 7 纳米TiO2长期暴露下厌氧颗粒污泥形貌的变化 Fig. 7 SEM images showing structure changes of the AGS under long-term exposure to TiO2 NPs |
为考察纳米TiO2长期暴露对厌氧颗粒污泥微生物的种群结构的影响, 本研究中分别采用不同的特异性探针对两反应器内颗粒污泥中的真细菌、古细菌、产甲烷丝菌和产甲烷八叠球菌进行检测, 以确定其相对数量关系, 结果如表 2所示.
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表 2 纳米TiO2对厌氧颗粒污泥微生物种群结构的长期影响/% Table 2 Microbial community composition in the absence and presence of TiO2 NPs after 90 d of operation/% |
经过90 d的纳米TiO2暴露后, R2反应器内颗粒污泥中的总活细胞、真细菌及古菌含量没有明显变化, 说明纳米TiO2长期暴露对产酸菌及产甲烷菌都没有明显的致死效应, 侧面证实了前述“厌氧条件下纳米TiO2的抑制作用主要来自于物理遮蔽效应”的推论.
甲烷丝状菌和甲烷八叠球菌是最主要嗜乙酸产甲烷菌, 鉴于厌氧体系内70%以上的甲烷都来自于嗜乙酸产甲烷菌, 因此在正常运行的厌氧颗粒污泥反应器内, 这两种产甲烷菌一般占优势地位[13].纳米TiO2的长期暴露使产甲烷古菌的种群结构和相对丰度发生了比较明显的变化：甲烷丝状菌减少了19.4%, 而甲烷八叠球菌的含量则大幅增加了115.6%.可见纳米TiO2使得颗粒污泥内的微环境更适于甲烷八叠球菌的生长.这也可以从这两种产甲烷菌不同的生理生态特性角度解释.尽管R2反应器内的乙酸浓度更低, 更适于具有高基质亲和性的甲烷丝状菌生长, 但须注意的是, 乙酸浓度的减少不仅是嗜乙酸产甲烷菌代谢的结果, 同样也是产乙酸菌代谢受抑的表现.而甲烷丝状菌能利用的底物只有乙酸, 因此当乙酸浓度不足时, 甲烷丝状菌的生长会受到一定限制, 而甲烷八叠球菌可利用的基质种类更多, 在某一底物浓度不足时可转而利用其它底物生长, 更强的底物适应能力保证了其能在产乙酸菌受抑制时仍维持正常生长.从颗粒污泥本身的结构来讲, 由于纳米TiO2是从颗粒污泥外部干扰菌群正常代谢的, 因此颗粒污泥有减小其比表面积来减少与纳米TiO2接触的趋势, 而甲烷八叠球菌能比甲烷丝状菌分泌出更多的EPS[35], 因此甲烷八叠球菌为主的厌氧颗粒污泥结构更加密实, 具有更小的孔隙度, 能有效地将纳米颗粒摒除在污泥外部.不仅如此, EPS也能补偿纳米TiO2所占据的活性点位, 并藉由这些活性点位来运输底物, 弥补产酸菌代谢受抑造成的EPS分泌量不足[图 7(b)].
3 结论(1) 低于150 mg·g-1纳米TiO2的短期暴露对厌氧颗粒污泥的产酸阶段及产甲烷阶段的代谢产物总量没有明显影响, 但纳米TiO2的冲击负荷会减慢产烷速率.
(2) 纳米TiO2的长期持续暴露对厌氧颗粒污泥反应器的运行稳定性有负面影响, 出水指标显示产酸菌的代谢受抑比产甲烷更明显, 纳米TiO2对厌氧颗粒污泥的抑制机制是“物理遮蔽”作用与颗粒污泥的层状结构共同作用的结果, 污泥外层的产酸菌为内部的产甲烷菌提供了有效的保护.
(3) 出水中TiO2的平均含量只有0.632 mg·L-1, 绝大多数纳米TiO2都被截留在了反应器中, 纳米TiO2的团聚特性和反应器内微环境条件的变化能够影响纳米TiO2的归趋.
(4) 纳米TiO2的长期持续暴露能够破坏污泥表面覆盖的EPS; 尽管纳米TiO2对厌氧颗粒污泥中的各功能菌群没有明显的致死效应, 但能够改变颗粒污泥中产甲烷菌的群落结构.
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