2017, Vol. 38
2. 苏州科技大学环境生物技术研究所, 苏州 215009
2. Institute of Environmental Biotechnology, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China
铁自养反硝化菌是一种化能自养反硝化菌, 能够完成Fe(Ⅱ)氧化还原脱氮反应, 硝酸盐被还原成氮气, Fe(Ⅱ)被氧化生成Fe(Ⅲ).在利用微生物处理水中污染物过程中, pH值是一个非常重要的环境条件, 对微生物有重要的影响作用. pH值会直接影响细胞内的电解质平衡, 影响微生物的活性甚至决定其能否存活; pH值还会影响基质或抑制物的浓度, 间接影响微生物的活性[1]; pH值影响细胞膜表面, 对铁的腐蚀增加二价铁底物有重要作用, 对产物三价铁是否形成氢氧化物吸附在细胞表面有重要作用.因此, 探讨pH对铁自养反硝化菌的影响有必要性.
pH是一个影响微生物的活性和铁形态的重要参数.在化学反应中, 低pH能促使铁与硝酸盐快速地反应[2].然而在酸性条件下, Fe(Ⅱ)虽是稳定的, 但大多数反硝化生物活性会被抑制[3].另一方面, 接近中性的pH值对反硝化生物的活性是有利的, 但Fe(Ⅱ)却难以产生和被氧化, 使微生物的活性底物缺少.大多数研究报道铁自养反硝化纯菌最适的培养pH范围并不统一.王宏宇等[4, 5]认为反硝化微生物一般适合在中性条件下进行反硝化作用, 所以其在铁自养反硝化菌的培养过程中, pH控制在7.2.也有研究表明, 该菌发生反应效率最高的pH区间在6.4~6.7之间[6].然而Kanaparthi等[7]在湖水呈酸性(pH为4.5), 底泥中富含腐殖酸、硝酸盐(2 μmol·L-1)和亚铁盐(3~40 μmol·L-1), 发现并分离铁自养反硝化菌.薛蕾[8]在培养1株以单质铁为电子供体的反硝化细菌的整个过程中, 培养液的pH值始终保持在8~8.5之间. Zhang等[9]在反应器内研究认为在以Fe(Ⅱ)为底物的自养反硝化作用中产生氢离子, 进水pH值为6.6, 出水pH变化过程从开始7.2下降到3.0, 随变化过程硝酸盐脱除率从95%降到20%, 所以Zhang建议反应的pH值要高于6, 以此维持生物反应过程.在连续流实验中, 硝酸盐去除率高于95%, 只要出水pH值为高于6. Wei等[10]报道了更高的最佳pH范围(8.5~9.5), 在一个结合单质铁微电解和自养反硝化的工艺中确定了这个最佳的pH范围.研究者们对铁自养反硝化菌最适pH的取值范围论断不一, 需要设计合理的实验来探讨自养反硝化菌最佳的pH值环境.
通过批量反应和连续流反应实验, 从pH对零价铁自养反硝化速率的影响考虑, 探究了pH值对自养反硝化菌活性和反硝化能力的影响, 找出过程中适宜的pH值.
1 材料与方法 1.1 实验装置如图 1所示, 罐体有效容积3 L, 加酸加碱泵、进出水泵、搅拌机的操作均由可编程控制器(PLC)自动控制.废水从2由泵泵入反应器底部, 后通过4上部的出水口由泵排出, 过程恒定pH作用则由7加酸加碱泵通过抽取8瓶中的液体自动控制, 发酵罐中搅拌棒周围用稳流刀片消弱搅拌剪切力, 维持出水层中污泥量较少, 较为清澈, 能较好避免污泥流失, 影响实验的对等性.
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1.自动控制面板; 2.进水口; 3.搅拌电机; 4.出水口; 5.气体平衡口; 6.预留口; 7.加酸加碱泵; 8.酸碱液瓶; 9.罐体加热套; 10.pH、温度等探头; 11.搅拌桨 图 1 连续流发酵罐实验装置示意 Fig. 1 Experimental device of continuous flow fermenter |
活性污泥来自在206 d的长期运行的上流式厌氧反应器内, 其MLSS在9 000~10 000 mg·L-1之间, 接种时其脱氮速率活性为0.85 mg·(L·h)-1.发酵罐内污泥接种量约为1.2 L, 批实验瓶中接种10 mL.瓶中加入的泥为从上流式反应器取出的污泥, 是同一批取出的, 经沉淀后, 移除上清液, 然后用量筒加入同等量湿泥; 水中硝态氮浓度为配制的80 mg·L-1的氮浓度, 然后选取一瓶测定了各形式氮的初始浓度, 取为各瓶初始氮浓度.
批实验反应瓶中初始硝酸盐浓度为83.2 mg·L-1, 亚硝态氮浓度为3.3 mg·L-1, 氨氮浓度为0, 各瓶初始总氮质量之和为17.3 mg, 各瓶中加入1 g还原铁粉, 用1 mol·L-1的稀盐酸将各瓶调至初始pH值.连续流实验用水为自配水, 加入硝酸钠, 进水硝酸盐氮浓度是50mg·L-1; 还原铁粉每10 d添加一次, 投加量为7.5 g.加入碳酸氢钠作为微生物生长繁殖用的碳源, 碳酸氢钠浓度为0.16g·L-1, 还原铁粉目数为200目.
1.3 测定方法实验中各污染物指标的监测方法均参照国家环保总局发布的标准方法[11], 硝态氮：紫外分光光度法、亚硝酸盐氮：N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法、氨氮：纳氏试剂分光光度法、总铁：邻菲啰啉分光光度法、pH值：pHS-3TC型酸度计测定.
1.4 实验方法与内容批实验采用200 mL的血清瓶, 加入底物和培养成熟的铁自养反硝化活性污泥(在上流式反应器中培养了206 d), 置于恒温振荡器中, 温度设置为30℃, 设置了初始pH值6.2、6.7、7.5和8.8的梯度瓶实验, 并设置了一个没有添加活性污泥的零价铁化学还原的对比实验, 此瓶初始pH值为6.7, 通过测定瓶中氮素各形态浓度的变化, 对比观察找出铁自养反硝化过程中pH变化规律.
利用连续流恒定pH的反应过程, 削弱批实验过程pH值变动对底物、微生物、铁的产物的影响, 对比不同pH值过程的氮产物变化和氮脱除速率, 找到较好的适合自养反硝化菌生长的溶液pH值环境.则利用了能够严格控制pH值的发酵罐进行了恒定pH值连续流实验, 设置了pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0这5个值, 分别经过一段时间培养, 获得稳定运行下的反应情况.在下一个pH值的实验中用EDTA对污泥清洗, 以防上一次实验中的三价铁物质对污泥活性的抑制, 保证同等的初始污泥活性.通过计算硝酸盐氮单位时间内脱除量衡量了不同pH值条件下的铁自养反硝化菌活性, 总结了铁自养反硝化菌在不同pH值条件下的反应规律.温度控制在33~35℃, 搅拌转速控制在110 r·min-1, 水力停留时间是20 h.
2 结果与讨论 2.1 零价铁自养反硝化批实验过程中pH值的变化在批实验中, 进行的4个不同初始pH值6.2、6.7、7.5和8.8的实验瓶分别计为A、B、C、D瓶, 一个没有添加活性污泥的零价铁化学还原的对比实验记为E瓶, 初始pH值为6.7.如图 2中对比了批量实验硝酸盐氮转移的情况, 由于考虑到取样体积对浓度数值大小的影响, 将各瓶中氮素含量换算为质量mg代替, 结果显示B瓶中显示出相比其他瓶中较高的氮转化效率, 硝酸盐转化率为83.8%, D瓶次之, 为63.7%, A瓶、C瓶最后且水平相当, 为55.2%, 实验期间氨和亚硝酸盐积累均较低, 两者氮素之和占初始总氮量百分率平均在2.7%.对比无添加污泥的反应瓶, 较多的硝酸盐被零价铁还原为氨, 硝酸盐转化率为55.6%, 转化量中有56.2%转化生成氨.
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图 2 A、B、C、D、E瓶反应过程中pH值和各种氮含量随时间的变化 Fig. 2 The pH value and various nitrogen content changes in A, B, C, D, and E with time in the reaction process |
观察图 2中对过程pH值的监测, 铁自养反硝化反应对水溶液pH值影响较大, 反推出pH值是铁自养反硝化反应条件中较为重要的影响因素之一. 4个加了活性污泥的瓶子中初始pH值在经过1 d的反应后都有较大的变动, 均向pH值7.5靠近, 第1 d后A瓶的pH值从初始pH值6.2变到7.5, B瓶从6.7变到7.7, C瓶从7.5变到7.8, D瓶从8.8变到7.4, 而未加污泥的E瓶从6.7变到8.8, 在靠近7.5后的随后时间内A、B、C、D四瓶的pH检测值的大多数均处于7.5~8.0的区间内, 有的在此区间波动较大, 有的变化较小, 与未加入污泥的铁化学还原硝酸盐过程形成对比, 并未像化学还原那样pH上升到10.0左右后趋近于稳定, 而是类似缓冲溶液具有了稳定pH值的效果, pH值在稳定的区间波动, 必定存在有氢离子或氢氧根离子的补充与消耗的内在机制导致了此种现象的发生.那么, 对于有生物参与的A、B、C、D四瓶中pH值在开始均急速变化, 后集中稳定范围, 而未加入污泥的对照组pH值一直升高, 产生上述差异的原因是生物反应过程消耗了氢离子, 氢离子与硝酸根中的氧负离子结合生成了氧化氢, 生物反应的硝酸盐产物为氮气, 氢离子减少则相应溶液pH值升高, 而后由于三价铁与氢氧根离子的反应维持了pH值的稳定; 而在E瓶中化学还原硝酸盐中, 化学还原硝酸盐的产物为氨, 氢离子则更多集中到了氨根离子中, 硝酸盐中的氧分子被置换下来, 产生更多的氢氧根离子, 使化学反应的pH值升高.在后续的化学反应稳定过程, 是由于无较多氢离子的供给, 导致反应趋近没有发生的能力, pH变化也趋近了某一值附近.
那么, 在pH值6.7反应条件下为何会表现出较强的反应活性, 而不是pH值6.2情况下, 因为pH低的情况下, 铁自养反硝化菌细胞内电解质平衡受到影响, 生物反应过程会受到抑制; 细胞表面电位点降低, 排斥二价铁物质进入细胞内.并不是氢离子浓度越高, 越利于铁自养反硝化反应.综上过程, 在批实验反应中初始pH值极快地被改变, 随后均集中在7.5~7.8之间, 揭示了零价铁自养反硝化过程pH值的变化规律.
2.2 连续流下恒定pH值对零价铁自养反硝化过程的影响对上述提出的问题进行了连续流控制pH恒定的实验设计, 在发酵罐内做了控制研究, 分析了6.0、6.5、7.0、7.5、8.0这5个pH值下的零价铁生物自养反硝化过程, 反应过程和结果如图 3所示.观察发现, 该生物反应是一个消耗氢离子的反应, 在pH值的研究过程中观察到消耗了盐酸溶液, 未有氢氧化钠溶液的消耗.如图 4, 通过计算, 得到pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的硝酸盐氮转化速率和氮脱除速率分别为1.27、1.66、1.08、1.16、0.89和0.81、1.35、0.98、1.02、0.47 mg·(L·h)-1, 两者差值分别为0.46、0.31、0.1、0.14、0.42 mg·(L·h)-1.从两者的变化速率来看, 随pH从酸到碱的变化均先减小后增大, 后又减小, 说明pH对过程有较强的影响作用, 偏酸环境增长率大利于反应过程, 偏碱过程增长率为负值, 不利于零价铁自养反硝化反应过程, 中性环境增长率变化不明显, 对反应过程则影响较小.
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图 3 不同pH值条件下连续流发酵罐实验中氮素的转移情况 Fig. 3 Nitrogen transfer in the continuous flow fermenter experiments with different pH values |
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图 4 连续流实验中不同pH值条件下铁自养菌的反硝化速率 Fig. 4 Denitrification rate of iron autotrophic bacteria under different pH values in continuous flow experiments |
在pH值6.0时, pH值较低, 影响了铁自养反硝化细菌酶的活性, pH值影响酶的结构, 大多数酶是蛋白质, 酶的催化效果又由其结构决定, 其结构与环境pH有密切关系, 而对于同一个酶, 其最适pH因缓冲液和底物的性质不同而有差异. pH值在8.0时, 碱性条件造成三价铁产物对污泥的吸附包裹更为严重, 造成污泥活性下降, 如图 3(e)显示的氮脱除速率在反应后期逐渐下降.
pH值在7.0时, 是溶液中氢离子和氢氧根离子的对等点, 该反应体系存在的脱氮反应消耗氢离子, 三价铁离子沉淀反应消耗氢氧根离子, 同时, 酸性的环境有利于零价铁与硝酸盐之间的化学反应的发生[2, 12], 硝酸盐氮转化速率和氮脱除速率两者的差值随pH值的降低逐渐增大, 表现为系统内氨的含量增多, 所以pH等于7.0的点是该反应的关键点.从反应效果得出, 在pH值大于等于6.5的环境中, 硝酸盐氮转化速率和氮的脱除速率均随pH值变大先减小后增大, 在pH为7.0时达到最小值, 引起该变化现象的主要原因是偏碱性环境下被细胞排斥离开细胞膜的三价铁铁离子在溶液中形成了沉淀物, 而不是在细胞膜界面产生沉淀物而附着在细胞膜上; 在偏酸性环境下, 例如本实验中pH值在6.5时, 表现出最好的反应效果, 首先为脱氮反应过程提供亚铁离子反应物, 再而影响了三价铁的水解平衡, 使溶液中有足够的三价铁离子, 与零价铁反应生成二价铁, 为微生物反应提供较多的电子供体, 较多量的底物促进了反应的正向进行.
在铁自养反硝化的过程, pH则起到了两个作用, 一对细胞膜有影响作用, 另一个对铁离子及其化合物有影响作用.据研究, 大多数细菌等电点的pH值为3~4, 而水中细菌细胞表面电荷的性质受pH值控制, 即水的pH值低于细菌等电点时, 细菌细胞表面带正电荷, 反之则带负电荷.并且该菌种能通过自身机制调节不利影响, 使用质子泵泵出质子, 产生微酸性环境, 使近细胞壁的三价铁呈溶解态, 当三价铁远离细胞壁时, 在溶液中形成三价铁氧化物或氢氧化物沉淀[13].该菌本身扮演了一个具有缓冲作用的角色, 既能消耗质子又释放质子, 且底物二价铁和产物三价铁的水解平衡是两个受pH变化影响的过程.零价铁的腐蚀同样也离不开与pH值的作用. Huang的研究表明[14], 在中性pH条件、没有pH缓冲剂的情况下用铁粉还原硝酸盐的作用是微小的, 但在pH缓冲剂的存在下该过程会被加强, 它并没有直接参与反应过程, 而是作为一个副作用存在, 与铁粉发生反应提供了更多的二价铁.在与生物耦合的应用零价铁脱氮的生物反应中, 零价铁的表面覆盖了羟基氧化铁代替了四氧化三铁或三氧化二铁, 其具有较四氧化三铁和三氧化二铁要高的比表面积和细微的颗粒结构, 阻止了从零价铁到硝酸盐的电子传递过程[15].所以较低的pH值条件影响了细胞内的电解质平衡, 提高了细胞膜内表面正电荷数, 与胞外三价铁形成排斥作用, 使三价铁远离细胞壁, 避免三价铁在细胞表面形成固态沉积物[16, 17].
在弱酸性环境中, 二价铁和三价铁化学形态主要以离子态和氢氧化铁状态存在, 氢氧化铁与二价铁离子之间的标准氧化还原电位为-0.236 V, 在中性和碱性环境中, 氢氧化铁与碳酸亚铁之间的标准氧化还原电位为+0.200 V, 所以在酸性环境下可以为微生物合成ATP提供更多的能量[18].在无机碳源环境中, pH值不同按照不同的化学反应方程式, 在中性或者偏碱环境中, 发生如式(1)的反应[19, 20], 在偏酸性环境发生如式(2)的反应[21], 因此微生物所利用到的自由能则不同, 从而pH值直接影响了微生物的生长代谢过程.
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(1) |
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所以零价铁与硝酸盐之间在生物作用下是一个复杂的生物化学反应过程, 其中pH值在这个过程中扮演一重要角色.经对比批量实验发现, 各实验瓶中后续反应的pH值均在7.5~7.8的区间内, 很难凸显出初始pH值在过程反应中的作用, 所以设计了一个稳定的pH的变化过程, 考察在一段适应时间下6.0~8.0的pH值对硝酸盐型铁氧化菌的影响作用, 从图 4连续流不同pH值条件下铁自养菌的反硝化速率的比较, 得到了适宜该菌进行反应的pH值为6.5.
3 结论(1) 通过批试反应过程pH值的测定, 得到零价铁自养反硝化反应是一个消耗酸但过程pH不会不断升高的反应, 并不像化学反应过程pH升高至10.0, 而是稳定在7.5~7.8之间.
(2) 零价铁自养反硝化过程在酸性条件下微生物的活性会降低, 在pH值为6.0时氮脱除速率为0.81 mg·(L·h)-1, 且产生较多的氨; 在碱性条件下铁的氢氧化物会影响微生物的活性, 在pH值为8.0时氮脱除速率为0.47 mg·(L·h)-1; 适宜微生物生长的pH条件是6.5, 在本实验中实现最高反硝化速率在1.35 mg·(L·h)-1.
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