单级自养脱氮是一种基于亚硝酸盐氮的全程自养脱氮工艺, 其理论基础是在一体化反应器体系内同时实现半量短程硝化(也称氨氧化)与厌氧氨氧化反应(anaerobic ammonia oxidation, ANAMMOX)[1].如图 1所示, 从微生物生长方式来说, 实现CANON工艺的具体途径为:在生物膜表面或颗粒污泥表面, 处于低溶解氧环境, 部分氨氮(ammonia nitrogen, NH4+-N)在好氧氨氧化菌(aerobic ammonia oxidation bacteria, AOB)的作用下被氧化成亚硝酸氮(nitrite nitrogen, NO2--N); 而在生物膜内部或颗粒污泥内部, 处于厌氧环境, 产生的NO2--N和剩余NH4+-N在厌氧氨氧化菌(anaerobic ammonium oxidation bacteria, AnAOB)的作用下反应生成氮气(nitrogen, N2), 并产生很少量的硝酸氮(nitrate nitrogen, NO3--N), 从而实现NH4+-N从废水中的去除[2, 3].该工艺的总反应方程式如式(1)所示[4], 由该式可知, CANON工艺理论总氮(total nitrogen, TN)最大去除率为89%.
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图 1 CANON工艺模型 Fig. 1 Different models for the CANON process |
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由于该工艺存在启动周期较长[5]、运行易失稳的问题[6, 7], 因此前人的工作内容主要针对反应器类型[8]、工艺启动方式[9~11]和工艺参数优化方面[12~14], 通过构建功能微生物生长的适宜环境, 使其快速富集成优势微生物并保持良好的活性, 最终实现工艺的快速启动和稳定的脱氮性能.本实验采用与以往不同的工艺启动方法, 在淹没式生物滤池反应器内, 采用前期更替曝气的满负荷启动方法, 通过严格控制体系中的温度和DO, 实现CANON的快速启动与长时间稳定运行.
研究CANON微生物种群演化特性, 对深入了解CANON快速启动和稳定运行非常关键.实验采用16S rDNA宏基因组高通量测序技术对该体系微生物群落结构特征进行定性定量分析, 掌握接种期、启动期和运行期不同时期该体系微生物的变化特征, 这对于指导CANON工艺的快速启动和稳定运行提供了客观的科学依据, 具有重要意义.
1 材料与方法 1.1 实验装置实验装置如图 2所示, 圆柱形反应器主体采用有机玻璃制作, 其内径为11.0 cm, 高度38.0 cm, 总容积3.6 L, 有效容积3.0 L.反应器内部悬挂组合填料供微生物附着生长, 外部包裹2.5 cm厚的水浴夹层用于保温.实验所用组合填料材质为醛化纤维, 单位质量为3.2 kg·m-3, 比表面积为265 m2·m-3, 单个填料由纤维束、塑料环片、套管、中心绳组成, 见图 2(b).其结构骨架是扣压的双圈大塑料环, 并将醛化纤维压在塑料环的环圈上, 纤维束在中间塑料环片的支撑下均匀分布, 避免了纤维束中心结团的现象; 内圈是雪花状塑料枝条, 既能挂膜, 又能有效切割气泡, 提高氧的转移速率和利用率, 使水气生物膜得到充分交换, 起到良好的布水、布气作用.每个反应器内悬挂一串填料, 每串由6个单个填料组成.
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图 2 本实验的装置示意 Fig. 2 Equipment used in this experiment |
取城镇污水处理厂二沉池的普通活性污泥作为种泥, 颜色为浅黄褐色, pH在7.0~7.2范围内, MLSS在3 000~4 000 mg·L-1范围内.经12 h沉淀后, MLSS在14 000~14 500 mg·L-1范围内, MLVSS在8 000~8 500 mg·L-1范围内, 备用.
1.3 实验用水本实验采用人工模拟氨氮废水, 其主要成分为:氯化铵0.33~0.44 g·L-1, 磷酸二氢钾0.03 g·L-1, 硫酸镁0.01 g·L-1, 氯化钙0.02 g·L-1, 碳酸氢钠1.00 g·L-1, 微量元素溶液0.35 mL·L-1.
微量元素溶液成分为:氯化铁3.52 g·L-1, 氯化锰0.36 g·L-1, 硫酸铜0.08 g·L-1, 硫酸镁0.30 g·L-1, 氯化钴0.38 g·L-1.实验进水水质见表 1.
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表 1 模拟废水进水水质 Table 1 Influent quality of simulated wastewater |
1.4 反应器启动及运行
(1) 将1.2节中备用的种泥曝空气72 h后, 调整污泥浓度在14 000~14 500 mg·L-1范围内.取2.5 L该污泥倒入1.1节的SBAF反应器中.
(2) 将步骤(1)中的SBAF反应器底部通入纯氮气, 气压控制在0.20~0.25 MPa范围内, 持续通入72 h.反应器中的污泥逐渐附着在组合填料表面, 且颜色由浅黄褐色变为黑色, 此时停止通氮气并静置2 h后, 将剩余污泥从反应器底部排泥口排出.
(3) 采用恒流泵将1.3节实验用水送入SBAF反应器中, 并从该反应器底部微曝气.将该体系的DO和温度分别控制在0.10~0.30 mg·L-1和31℃±1℃的范围内, HRT控制为24 h;
(4) 该反应器连续启动并运行, 在启动过程中不排泥.
1.5 污泥微生物选取与制备在SBAF体系内, 分别取接种期、CANON启动期和CANON运行期的污泥进行分析研究.具体为:接种期的污泥取自原始混合污泥; 启动期的污泥取自反应器内上下层填料上附着的污泥; 稳定运行期的污泥取自反应器内上下层填料上附着的污泥.
污泥样品制备方法为:先用去离子水将膜上微生物冲洗至烧杯中, 待其沉淀后弃掉上清液留下浓缩的污泥微生物50 mL, 备用.
1.6 基于Illumina平台的16S rDNA宏基因组测序分别取CANON不同运行时期样品浓缩污泥, 用冷冻干燥机干燥后, 进行16S rDNA宏基因组测序, 其流程如下.
(1) 样品抽提与质检.采用离心吸附柱法进行样品DNA抽提, 并用Agarose Gel Electrophoresis和ND-1000Nanodrop进行样品质检.
(2) 文库构建与质检.通过质检的样品, 用TruSeq® Custom Amplicon Sample Prep Kit进行文库构建, 主要包括内侧特异性引物PCR扩增、外侧接头特异性引物PCR扩增及纯化, 并用Agilent2200TapeStation和Qubit2.0进行文库质检.
(3) 样本制备. ①通过质检的文库, 按照pooling比例进行混合, pooling后的浓度为2.1 nmol·L-1; ②将pooling样品与2.1 nmol·L-1Phix Control按照19:1比例进行混合; ③将2.0 mol·L-1NaOH稀释为0.2 mol·L-1NaOH; ④将②和③处理结果按照1:1比例进行混合, 室温孵育5 min; ⑤用HT1将④中混合物稀释100倍, 取420 μL作为测序样本.
(4) 上机测序使用Pair End Flow Cell, 进行MiSeq 2500上机操作, 并运行Pair End(2×100)标准测序程序.
(5) 数据分析测序程序运行完毕, 对所得数据进行生物信息学分析.首先对原始数据进行过滤, 去除低质量数据, 得到干净数据(clean data)后进行后续分析; 其次将Paired-end reads拼接为Tags, 并且去冗余, 获取Unique Tags; 然后对Unique Tags进行聚类, 生成OTU(operational taxonomic units); 最后利用生成的OTU进行物种注释、分类统计及α多样性分析.
1.7 分析项目及检测方法实验中氮素测定均采用国家标准方法[15].其中, NH4+-N测定采用纳氏试剂比色法, NO2--N采用N-(1-萘基)乙二胺光度法, NO3--N采用紫外分光光度法, TN=NH4+-N+NO2--N+NO3--N, COD测定采用重铬酸钾法, pH值、DO及温度采用便携式pH计(PJBJ-260, 上海雷磁)和便携式溶解氧分析仪(JPB-607A, 上海雷磁)测定.
ARR计算公式为:
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CANON在SBAF体系中的启动运行经历了两个阶段(如图 3所示)Ⅰ启动阶段(1~51 d)和Ⅱ运行阶段(52~278 d).该区分依据为:在出水NH4+-N浓度和NO2--N浓度下降的同时, 体系TN去除率达到70%时, 即可认定启动完成.其中在启动阶段, 从第1~4 d, 污泥处于接种初期, 低DO严重抑制AOB和NOB活性, 导致绝大多数NH4+-N未能被氧化, 出水NH4+-N平均质量浓度为105.8 mg·L-1, 出水NO2--N平均质量浓度为0.0mg·L-1, 出水NO3--N平均质量浓度为3.1mg·L-1.在第5~35 d时, 体系内大量AOB富集和少量NOB存在, 引起出水NH4+-N平均质量浓度降低为51.1 mg·L-1, 出水NO2--N平均质量浓度升至26.0 mg·L-1, 出水NO3--N平均质量浓度微量增加至5.7 mg·L-1.从第36~50 d时, 体系开始富集AnAOB引起ANAMMOX现象, 出水NH4+-N和NO2--N质量浓度值同时下降, 出水NO3--N质量浓度略微增加.当体系进入运行阶段后, 在第52~278 d, 进水NH4+-N平均质量浓度为96.0 mg·L-1时, 出水NH4+-N平均质量浓度为9.4 mg·L-1, 出水NO2--N平均质量浓度为5.8 mg·L-1, 二者均稳定保持在低水平.根据公式(1)计算, 出水NO3--N质量浓度理论值为10.6 mg·L-1, 实际出水NO3--N平均质量浓度为14.1 mg·L-1.实际值比理论值偏高, 说明体系内微量NOB仍会引起硝化反应.
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图 3 本实验各氮素变化情况 Fig. 3 Variations of nitrogen concentration in this experiment |
为了满足厌氧氨氧化反应中NH4+-N/NO2--N达到1/1.32的条件, 体系在启动初期只需进水中56.9%的NH4+-N氧化为NO2--N即可[16]. 图 4为SBAF内CANON启动运行过程中的NH4+-N变化情况.在第1~4 d, 由于污泥处于接种初期, ARR低于6.0%.在第5~24 d时, AOB出现富集, ARR逐渐上升, 最大ARR为58.3%, 平均ARR为46.2%, 与理论值56.9%存在偏差.其原因在于该阶段污泥中有NOB存在, 少量NH4+-N被氧化为NO3--N[17].在第25~35 d时, 出水NH4+-N逐渐降低至38.0 mg·L-1, ARR为50.0%, AOB富集情况良好.在第36~51 d时, 在体系内AOB、AnAOB和少量NOB的作用下, 出水NH4+-N持续降低至1.0 mg·L-1, ARR从45.4%逐渐提升至98.9%.体系进入运行阶段(52~278 d)后, 出水NH4+-N平均质量浓度保持在9.4 mg·L-1, ARR平均值保持在95.1%, 系统NH4+-N转化能力很稳定.
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图 4 本实验NH4+-N变化情况 Fig. 4 Variations of NH4+-N concentration in this experiment |
TN变化对CANON脱氮性能有着重要的指征作用[18]. 图 5为本实验的TN变化情况.在启动阶段第1~35d, SBAF体系经历污泥接种和半量亚硝化阶段, 此阶段主要富集AOB和AnAOB、洗脱NOB, 因此并不具有TN去除作用, TN去除率低且波动很大.在第36~51 d, 系统的出水TN浓度逐渐下降, 从83.0 mg·L-1降至28.0 mg·L-1.当启动到51 d时, 进水TN质量浓度为90.0 mg·L-1, 出水TNR达到70.1%, CANON工艺完成快速启动.当体系从52 d运行到278 d时, 进水TN平均质量浓度为93.3 mg·L-1, 出水TN平均质量浓度为23.2 mg·L-1, 出水平均TNR为75.1%, 出水最大TNR为85.9%, 说明CANON工艺运行稳定.
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图 5 本实验TN变化情况 Fig. 5 Variations of TNconcentration in this experiment |
根据公式(1), 理论上CANON工艺最大TNR为88.0%, 而本实验TNR比理论值偏小, 其主要原因是体系内ANAMMOX反应产生的一部分NO3--N和存在少量NOB发生硝化反应产生的一部分NO3--N, 引起体系内有少量NO3--N累积, 从而影响了TN的去除率[19~21].
2.4 SBAF体系内NO3--N产生量变化分析CANON启动运行过程中, NO3--N会出现累积现象.这是由于一方面在AnAOB作用下, NO2--N和NH4+-N被转化为N2和NO3--N, 导致NO2--N和NH4+-N浓度同时下降, 并会产生少量NO3--N; 另一方面体系内存有极少量NOB产生硝化作用, 少量NO2--N会被氧化为NO3--N, 这两方面均对体系TN去除有影响.
图 6为本实验的NO3--N产生量变化情况.在启动阶段第1~51 d, NO3--N产生量(ΔNO3-)保持在低水平, 其平均质量浓度为3.8mg·L-1, 进入运行阶段52~278 d, ΔNO3-缓慢上升后维持在稳定水平.其中在第235 d, 由于系统ARR突然降低, 导致ΔNO3-骤降至1.1mg·L-1, 经DO调整后, 体系ARR提升, 引起ΔNO3-再次缓慢上升.整个运行阶段ΔNO3-平均浓度质量为12.1mg·L-1.
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图 6 本实验NO3--N变化情况 Fig. 6 Variations of NO3--Nconcentration in this experiment |
由公式(1)可知, NO3--N产生量(ΔNO3-)与TN去除量(ΔTN)的理论比值为0.125.本体系因第1~51 d处于启动阶段, 则不做ΔNO3-/ΔTN分析.在运行阶段第52~278d, 该体系ΔNO3-/ΔTN实际平均值为0.13, 与理论值0.125非常接近.
2.5 SBAF体系内CANON微生物种群结构特征分析 2.5.1 CANON微生物聚类与α多样性分析微生物聚类分析:利用Qiime挑选OTUs, 将所有相似性大于97%的序列归为一个OUT, 默认聚类方法为uclust, 即一个OUT表示一个物种, 体系中OUT大于4 000, 微生物物种丰富.
微生物α多样性分析:chao1指数表示微生物的相对丰度, Shannon指数和Simpson指数表示微生物的多样性.其中, Shannon值越大, Simpson值越小, 说明群落多样性越高.
样本覆盖度:是指测序结果占整个基因组的比例.通常将该指标与聚类、α多样性指标的稀释曲线相结合, 用于评价测序量是否覆盖所有类群, 并间接反映样品中物种的丰富程度.当曲线趋于平缓或者达到平台期时则认为测序深度已基本覆盖样品中的所有物种[22].
为了研究SBAF体系内CANON微生物的种群结构特征, 本实验选取3个污泥样品, 分别为种泥(用样本A表示)、启动阶段污泥(46 d, 用样本B表示)和运行阶段污泥(196 d, 用样本C表示), 对这些微生物样品进行聚类与多样性分析, 其OTU数目、有效序列条数统计及微生物α多样性相关的各项指标见表 2和图 7所示.根据指标结果, 本研究中样品曲线基本趋于平缓, 各测序结果占整个基因组的97%以上, 覆盖度高, 证明样品测序能够准确反映出样品的物种丰度.
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表 2 微生物样品的α多样性 Table 2 The α diversity of the different microbial samples |
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图 7 α多样性指标的稀释曲线 Fig. 7 Rarefaction curve of α diversity indexes |
CANON工艺接种期、启动期和运行期的微生物群落结构有显著差异.通过对比不同时期SBAF体系中微生物的群落特征和丰度变化, 研究了门水平下微生物的演化进程, 检测结果如表 3所示.从接种期到启动期, 即A-B期, 在特定的培养环境下, 微生物驯化有效, 部分菌类不适应环境变化从系统中被洗脱出去, 微生物种群数量减少; 留下的微生物群落适合在CANON体系中生长.启动成功后至稳定运行时期, 即B-C期, 体系中微生物群落种类没有显著变化, 结构组成相对稳定, 而各丰度发生变化, 特别是CANON功能菌种AOB和AnAOB所在的Proteobacteria和Planctomycetes两个菌门变化最显著.
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表 3 SBAF体系内CANON工艺功能微生物门水平下的演化分析(相对丰度>1%)/% Table 3 Microbial evolution of the CANON process in the SBAF system at a phylum level (relative abundance>1%)/% |
在接种期, 除5.1%未检出或未识别的菌门, 种泥微生物共包括49个菌门, 其中>1%的共有11个菌门(如表 3), 其中变形菌门Proteobacteria和绿弯菌门Chloroflexi所占比例达到51.0%, 为种泥中的绝对优势菌门.其次, 各个菌门根据菌种丰度含量大小依次为:变形菌门Proteobacteria>绿弯菌门Chloroflexitalic>硝化螺旋菌门Nitrospirae>浮霉菌门Planctomycetes>放线菌门Actinobacteria>酸杆菌门Acidobacteria>拟杆菌门Bacteroidetes>疣微菌门Verrucomicrobia.
在CANON启动期, 污泥微生物由原来的49个菌门减少到38个菌门, 洗脱出11个菌门, 其中变形菌门Proteobacteria和浮霉菌门Planctomycetes所占比例达到43.6%, 成为启动期污泥微生物中的绝对优势菌门.各个菌门根据菌种丰度含量大小依次为:变形菌门Proteobacteria>浮霉菌门Planctomycetes>疣微菌门Verrucomicrobia>绿弯菌门Chloroflexitalic>绿菌门Chlorobitalic>芽单胞菌门Gemmatimonadetes>拟杆菌门Bacteroidetes>酸杆菌门Acidobacteria>放线菌门Actinobacteria.与接种期种泥对比, 此阶段代表厌氧微生物的浮霉菌门Planctomycetes和芽单胞菌门Gemmatimonadetes的相对丰度有所上升, 分别提升了8.5%和6.84%, 说明厌氧微生物开始显著富集, 而变形菌门Proteobacteria的相对丰度从39.7%下降到27.0%.此阶段代表好氧微生物的硝化螺旋菌门Nitrospirae的相对丰度由8.8%下降到0.01%, 说明属于硝化螺旋菌门的NOB已经被洗脱出反应体系中, 这保证了半量亚硝化的稳定实现.
在CANON运行期, 污泥微生物菌门与启动期基本一致, 说明CANON体系中微生物群落结构已基本处于稳定状态, 但微生物各菌门相对丰度有所变化.其中浮霉菌门Planctomycetes和变形菌门Proteobacteria所占比例达到54.1%, 成为该体系的绝对优势菌门.这也说明AnAOB(所属浮霉菌门Planctomycetes)和AOB(所属变形菌门Proteobacteria)已成为CANON体系运行期的绝对优势菌[23~25].
2.5.3 SBAF体系内AOB、AnAOB富集及NOB洗脱分析CANON体系的关键点在于洗脱NOB和富集AOB、AnAOB.为了对SBAF体系内功能菌做更为细致的了解, 本实验在属水平下, 对AOB、AnAOB和NOB的特性做进一步分析, 其结果如表 4所示.在属水平上, AnAOB主要微生物为Candidatus Brocadia, 其相对丰度随着驯化时间的延长分别依次为:种泥1.8×10-5, 启动期14.3%, 运行期30.6%, 说明AnAOB得以快速富集, 逐渐成为体系中的优势菌.其次, 虽然AOB(变形菌Proteobacteria)主要微生物未能识别, 但从数据趋势上来看, 除门Proteobacteria纲Betaproteobacteria目Ellin6067的微生物有所增加, 其他AOB微生物含量逐渐减少.最后, NOB主要微生物为Nitrospira, 其相对丰度随着驯化时间的延长分别依次为:种泥8.8%, 启动期0.0%, 运行期0.2%, 说明从接种期到启动期, NOB成功洗脱出该体系; 从启动期到运行期, NOB又得到微量富集, 这也是引起体系出水NO3--N浓度值比理论值略高的主要原因.
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表 4 SBAF体系内属水平下的CANON功能微生物演化分析(相对丰度>1%)/% Table 4 Microbial evolution of the CANON process in the SBAF system on the genus level(relative abundance>1%)/% |
2.6 SBAF体系内氮素转化与微生物演化特性间的关系分析
微生物的演化显著影响SBAF体系内的氮素转化, 该结果如图 8所示.在接种前期, ARR和TNR平均值均为0;在启动期间, 浮霉菌门Planctomycetes和芽单胞菌门Gemmatimonadetes的相对丰度增加, 绿弯菌门Chloroflexi、变形菌门Proteobacteria的相对丰度降低, 硝化螺旋菌门Nitrospirae的相对丰度降为0, 此时ARR和TNR平均值由0分别提升至53.8%和15.1%;在运行期间, 浮霉菌门Planctomycetes相对丰度持续增加, 绿弯菌门Chloroflexi和变形菌门Proteobacteria相对丰度持续降低, 此时ARR和TNR平均值分别增加至95.1%和75.1%.由此也可说明, 浮霉菌门Planctomycetes相对丰度的增加, 对SBAF体系内TN去除起到关键作用.
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图 8 SBAF体系内氮素转化与微生物门水平下演化特性间的关系 Fig. 8 Relationship between the nitrogen conversion of the SBAF system and the microbial evolution at the phylum level |
(1) 在SBAF体系内, 采用前期更替曝气的满负荷启动方法, 于51 d成功实现CANON的快速启动, 并稳定运行278 d.实验结果表明, 该体系ARR平均值为95.1%, TNR平均值为75.1%, 体系存在少量NO3--N累积.
(2) 在门水平上, 在CANON运行期污泥微生物的优势菌为变形菌门Proteobacteria和浮霉菌门Planctomycetes.其中, Proteobacteria起亚硝化作用, Planctomycetes起厌氧氨氧化作用, 两者协同作用共同实现CANON中的TN去除.
(3) 在属水平上, AnAOB主要微生物为Candidatus Brocadia, 其相对丰度随着驯化时间延长而逐渐增大; AOB(变形菌Proteobacteria)主要微生物未能识别; NOB主要微生物为Nitrospira.
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