环境科学  2017, Vol. 38 Issue (12): 5184-5191   PDF    
厌氧氨氧化启动过程及微生物群落结构特征
汪瑶琪1 , 张敏1 , 姜滢1 , 徐乐中1,2,3 , 陈重军1,2,3 , 沈耀良1,2,3     
1. 苏州科技大学环境科学与工程学院, 苏州 215009;
2. 江苏省水处理技术与材料协同创新中心, 苏州 215009;
3. 江苏省环境科学与工程重点实验室, 苏州 215009
摘要: 采用UASB反应器以体积比1:2接种实验室培养的具有厌氧氨氧化(ANAMMOX)功能的厌氧污泥和城市污水厂的好氧污泥,耗时17 d成功启动ANAMMOX反应,启动阶段分为菌体水解期、活性提高期和稳定运行期.稳定运行后,逐步提高反应器容积负荷富集厌氧氨氧化菌,当容积负荷由0.10 kg·(m3·d)-1增至0.44 kg·(m3·d)-1时,总氮(TN)去除负荷也随之由0.09 kg·(m3·d)-1提高到0.42 kg·(m3·d)-1,反应器污泥逐渐由浅红色加深,粒径大于0.2 mm的污泥所占比例由10.90%增至38.37%.采用高通量测序对接种污泥和负荷提高期的污泥进行检测,其中绿曲挠菌门(Chloroflexi)、变形菌门(Proteobacteria)、WWE3门、放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)等占据主导.随着厌氧氨氧化菌富集程度的增大,脱氮功能菌中的变形菌门所占比例逐渐减少,从21.60%降至14.20%,而浮霉菌门随之增多,相对丰度由0.73%升至15.50%.当反应器的容积负荷增到0.44 kg·(m3·d)-1时,浮霉菌门中,Candidatus Brocadia属、Candidatus Jettenia属和Candidatus Kuenenia属是主要菌属,Candidatus Brocadia属占13.40%,是主要的厌氧氨氧化菌属.
关键词: 厌氧氨氧化      UASB反应器      容积负荷      高通量测序      群落结构     
Start-up and Characteristics of the Microbial Community Structure of ANAMMOX
WANG Yao-qi1 , ZHANG Min1 , JIANG Ying1 , XU Yue-zhong1,2,3 , CHEN Chong-jun1,2,3 , SHEN Yao-liang1,2,3     
1. School of Environmental Science and Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China;
2. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Technology and Material of Water Treatment, Suzhou 215009, China;
3. Jiangsu Key Laboratory of Environmental Science and Engineering, Suzhou 215009, China
Abstract: An anaerobic ammonium oxidation (ANAMMOX) reactor was successfully started up in 17 days, with the up-flow anaerobic sludge blanket (UASB) reactor being seeded with mixed anaerobic sludge from laboratory cultures with an ANAMMOX function and aerobic activated sludge from a municipal sewage treatment plant in a volume ratio of 1:2. The processes could be divided into two phases of hydrolysis, enhanced and steady. Anaerobic ammonium oxidation bacteria (AAOB) were enriched by improving the reactor volume load gradually after the steady phase. When the volume load increased from 0.10 kg·(m3·d)-1 to 0.44 kg·(m3·d)-1, the removal of total nitrogen (TN) also increased from 0.09 kg·(m3·d)-1 to 0.42 kg·(m3·d)-1. The color of the sludge changed from a light red that deepened gradually in the UASB reactor. At that time, the proportion of the sludge particle size greater than 0.2 mm increased from 10.90% to 38.37%.The sludges from the inoculation phase and from the phase when the volume load was increasing were analyzed by high-throughput sequencing, indicating that Chloroflexi, Proteobacteria, WWE3, Actinobacteria, Planctomycetes, and so on were the dominant species. The proportion of Proteobacteriain the denitrification bacteria was gradually reduced from 21.60% to 14.20% with an increase in the degree of AAOB enrichment, while the Planctomycetes increased from 0.73% to 15.50%. Candidatus Brocadia, Candidatus Jettenia, and Candidatus Kuenenia were the main species of Planctomyceteswhen the volume load increased to 0.44 kg·(m3·d)-1 in the reactor, and the Candidatus Brocadia was the main species of AAOB, which accounted for 13.40%.
Key words: ANAMMOX      UASB reactor      volume loading      high-throughput sequencing      microbial community structure     

厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation, ANAMMOX)反应因无需碳源、无需曝气、产泥量少等优点为污水脱氮提供了新思路[1, 2], 但厌氧氨氧化菌(anaerobic ammonium oxidationbacteria, AAOB)倍增时间长达11d, 导致快速培养AAOB成为该工艺用于实际工程的瓶颈[3], 因此研究如何快速启动ANAMMOX反应并在富集培养过程中减少AAOB的流失至关重要.研究表明, 序批式反应器(SBR)、膜生物反应器(MBR)、完全混合式反应器(CSTR)等多种类型反应器均能成功启动ANAMMOX反应[4].上升式厌氧污泥床反应器(up-flow anaerobic sludge bed, UASB)因具有三相分离器可高效截留生物量并维持微生物多样性被认为是启动ANAMMOX反应的首选反应器[5, 6].反应器内成功启动ANAMMOX反应后, 需要对AAOB进行富集获取较高的氮素去除负荷.通常采用提高基质浓度或缩短水力停留时间来实现[7].当进水没有采取除氧处理时, 缩短水力停留时间会使反应器内的溶解氧因进水流量的增加而增加, 不利于AAOB的生长.同时, 较短的水力停留时间会使反应器过载影响处理效果[8, 9].因此, 本研究通过逐步提高进水基质浓度使AAOB慢慢适应高基质浓度, 以求获取具有较高去除负荷的AAOB富集物.

高通量测序技术可同时对百万个DNA分子进行同时测序, 快速准确, 且成本较低, 逐渐广泛应用于环境领域微生物的鉴定[10].但目前在UASB反应器中对富集AAOB各阶段的微生物群落分析方面还少有研究.本研究拟在成功启动ANAMMOX反应后, 通过逐渐增大容积负荷富集AAOB, 并通过高通量测序技术对不同负荷条件下的泥样进行分析, 获取启动和富集过程中反应器的微生物群落结构变化情况.

1 材料与方法 1.1 实验装置

实验装置采用UASB反应器, 由有机玻璃制成.反应区的内径8 cm, 沉淀区内径10 cm, 高127.40 cm, 持水高度119.90 cm, 有效容积为19.70 L.反应器依靠外层的水浴夹套保持温度在(32±1)℃, 整体用遮阳塑料膜盖住避光, 并通过蠕动泵控制进水流速.反应器见图 1.

1.集气管; 2.三相分离器; 3.出水口; 4.水浴加热出水口; 5.取样口; 6.进水口; 7.蠕动泵; 8.进水管; 9.水浴加热进水管; 10.水浴加热进水口 图 1 UASB反应器装置示意 Fig. 1 Schematic of the UASB reactor

1.2 实验接种污泥

本实验接种污泥采用混合污泥, 分别是实验室培养的低负荷下运行的具有ANAMMOX功能的厌氧污泥和城市污水厂A2O工艺好氧池的污泥, 两者以1:2的体积比混合.接种污泥总体积为8L, 占反应器有效容积的40.60%.接种后, UASB反应器内污泥MLSS为11.96 g·L-1, MLVSS为6.40g·L-1, MLVSS/MLSS为53.50%, 接种污泥颜色为黑褐色.

1.3 实验用水

本实验用水采用人工配水, 进水组组分包括(NH4)2SO4, NaNO2, 以及KH2PO4 0.03 g·L-1, MgSO4 0.30 g·L-1, CaCl2 0.18 g·L-1, KHCO3 0.50 g·L-1, 1 L配水添加1 mL微量元素Ⅰ和Ⅱ [11].

启动初期采用低负荷进水, 保持氨氮(NH4+-N)和亚硝态氮(NO2--N)浓度为50 mg·L-1, 启动成功后分步提高基质浓度, NO2--N浓度以100、150、200、250、300 mg·L-1的梯度增加, 按NO2--N:NH4+-N=1.32的进水基质比, 控制NH4+-N浓度对应分为75.76、113.64、151.52、189.39、227.27 mg·L-1.

1.4 测试项目与方法

启动阶段每隔2 d采取反应器进出水, 测定NH4+-N、NO2--N、NO3--N的浓度; 每隔5 d取泥样测定MLSS和MLVSS; 每改变一个工况取泥测定污泥粒径. NH4+-N:纳氏试剂分光光度法; NO2--N:N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法; NO3--N:紫外分光光度法; MLSS、MLVSS采用重量法; 污泥粒径:筛分、重量法.

微生物群落多样性:样品1取自UASB反应器的接种污泥, 样品2、3、4分别取自接种后第33 d、100 d、150 d反应器内的混合污泥, 采用Illumina MiSeq测序平台对4个样品中的微生物进行测序分析, 包括DNA提取、PCR扩增、MiSeq文库构建和MiSeq测序[12].

2 结果与讨论 2.1 启动阶段

UASB反应器耗时17 d成功启动ANAMMOX反应, 根据氮素去除规律可将启动阶段分为菌体水解期、活性提高期、稳定运行期, 见图 2.

图 2 启动过程中氮素的变化 Fig. 2 Variation of nitrogen during the start-up

2.1.1 菌体水解期

启动初期第1~3 d反应器的出水NH4+-N浓度高于进水, 原污泥中的反硝化菌利用周围环境和原污泥带进的有机物及电子受体NO2--N进行脱氮反应, 使NO2--N的去除率高达99.28%.张海芹等[13]在研究ANAMMOX启动时, 初期出水较浑浊, 出水NH4+-N含量明显高于进水且亚硝含量基本为零, 与本研究初期规律一致.接种污泥一部分来自城市污水厂, 菌群中含有较多的异养菌[14], 接种后在反应器内用无机溶液培养, 异养菌不能适应避光厌氧的新环境而水解, 释放出有机物和铵态氮.

2.1.2 活性提高期

第4~17 d, NH4+-N出水浓度逐渐降低, NO2--N的出水浓度慢慢升高.反应器内有机物逐渐消耗且AAOB的活性一步步变强, 使得反应器内异养菌失去电子供体导致脱氮作用逐渐减弱, 亚硝出水量有所增加[15].第17 d开始, NH4+-N和NO2--N出现了同步去除的规律, 去除率分别达到97.91%和95.42%.有研究表明, NO2--N出水浓度由高到低的过程正是AAOB活性由弱变强的过程, 也是AAOB逐渐淘洗掉异养反硝化菌的过程[11].此阶段出水pH值比进水高, 呈碱性, 这均说明ANAMMOX作用在反应器内正在逐渐增强[16, 17].

2.1.3 稳定运行期

第18~35 d, NH4+-N和NO2--N实现同步高效去除, 氮素去除稳定, 且NH4+-N的去除量与NO2--N去除量、硝态氮(NO3--N)生成量成一定比例, 该阶段总氮(TN)平均去除率和去除负荷分别为93.20%和0.09 kg·(m3·d)-1, 表明在UASB反应器内, ANAMMOX反应得以成功启动[4].

Suneethi等[18]通过在厌氧膜生物反应器中接种厌氧污泥, 经350 d成功启动ANAMMOX反应; 张少辉等[19]经过3个月的运行用城市污水处理厂厌氧硝化池的污泥使反硝化生物膜ANAMMOX反应器的容积TN负荷达0.14 kg·(m3·d)-1, TN去除率约86.52%.此次启动的时间周期相比于其他研究在时间上具有优势, 是因为接种污泥中存在具有ANAMMOX功能的菌种[20], 且UASB反应器内的三相分离器最大程度地截留了AAOB, 促使出水的流失大大减少, 促进了ANAMMOX反应的启动.

2.2 负荷提升阶段结果与讨论

UASB反应器内ANAMMOX反应成功启动后, 开始以提升容积负荷方式富集AAOB, 提升反应器氮素去除负荷. NO2--N浓度以50 mg·L-1的梯度增加, NH4+-N浓度按NO2--N:NH4+-N=1.32的进水基质比配置.每个负荷阶段在TN浓度低于50 mg·L-1且TN去除率高于70%时, 稳定2周左右, 进入下一阶段.

2.2.1 水质情况变化

在负荷提升阶段AAOB的活性得以显著提高, 每个负荷增加时, 初始几天因污泥内菌种对环境的不适应状态使氮素去除率降低, 一周之后NO2--N和NH4+-N的去除率均可达到80%以上, TN去除负荷也随之增大(图 3).第70 d时, 反应器TN去除负荷由第20 d的0.09 kg·(m3·d)-1增至0.24 kg·(m3·d)-1, 随着反应器容积负荷的继续增大, 在第155 d时TN去除负荷达到0.42 kg·(m3·d)-1, TN去除率为86.70%.这一变化趋势与赵少康[21]的研究相一致, 在反应器的容积负荷由0.10 kg·(m3·d)-1提高到0.80 kg·(m3·d)-1时, TN去除负荷相应地从0.04 kg·(m3·d)-1增至0.62 kg·(m3·d)-1.但出水NO3--N的浓度也随着反应器容积负荷的增大而增大, 可见在以增大容积负荷来富集AAOB的过程中NO3--N的处理在实际应用中也应引起重视.

图 3 负荷提升阶段氮素的变化 Fig. 3 Variation of nitrogen during the increase in loading

2.2.2 三氮比变化

待每阶段氮素去除稳定后, 计算ΔNH4+:ΔNO2-:ΔNO3-的平均值, 见表 1. ANAMMOX成功启动初期, TN容积负荷为0.10 kg·(m3·d)-1, ΔNH4+:ΔNO2-:ΔNO3-为1:1.06:(-0.06).当容积负荷提高时, 氮素去除比例随之变化, NO2-的去除量和NO3-的生成量相对提高, 在负荷提升后期三者之比达1:1.29:0.07.

表 1 负荷阶段ΔNH4+:ΔNO2-:ΔNO3-的平均值 Table 1 Average of ΔNH4+:ΔNO2-:ΔNO3- between every loading stage

当ANAMMOX反应成功启动后, ΔNH4+:ΔNO2-:ΔNO3-的值在1:1.32:0.26左右波动, 但学者们的研究结果均不同.陈胜等[22]在研究中表明ANAMMOX反应启动成功后ΔNH4+:ΔNO2-:ΔNO3-为1:1:0.14.刘晓萍[23]通过接种不同硝化污泥和反硝化污泥, 在3个反应器R1、R2、R3中成功启动ANAMMOX反应器, 稳定运行阶段ΔNH4+:ΔNO2-:ΔNO3-分别为1:1.30:0.23、1:1.35:0.10和1:1.23:0.18.此种现象是因为各个实验中接种物、实验操作方法、进水水质等的不同, 使与厌氧氨氧化反应共存的反应不同[24], Strous等[25]的研究表明不同反应器内启动ANAMMOX反应时, ΔNH4+:ΔNO2-的值一般在0.25~2.00之间.

本研究中NO2--N的消耗量与理论值接近, NO3--N的生成量相对较少甚至出现出水值比进水值低的情况, 可能是因为接种污泥中存在有反硝化菌, 且用于启动的UASB反应器径向长度较大, 上部污泥菌体因营养不足而裂解, 导致反硝化菌利用配制进水中存在的少量有机物菌体裂解产生的有机物进行反硝化, 消耗掉AAOB产生的NO3--N, 造成NO3--N产量偏低.

2.2.3 污泥颜色变化

图 4所示,启动初期污泥颜色为黑褐色, 菌体水解期由于反应器内氧气消耗殆尽, 污泥颜色变为墨黑色.活性提高期, ANAMMOX功能逐渐加强, 污泥颜色变黄.运行35 d后, 污泥变成浅红色.经过提高负荷培养后, 红色逐渐加深, 并在反应器底部呈现颗粒状, 见图 4. Molinuevo等[26]的研究表明因AAOB的细胞中含有大量的细胞色素C而使ANAMMOX污泥呈红色, 红色加深表明AAOB成功得到富集.

1.接种污泥; 2.菌体水解期; 3.活性提高期; 4.稳定运行期; 5.负荷提高后期 图 4 污泥颜色变化 Fig. 4 Variation of sludge color during the start-up

2.2.4 污泥粒径变化

UASB反应器内污泥的粒径随着容积负荷的增大而有所变化, 当负荷不断提高时, 直径小于0.2 mm的污泥逐渐变少, 大于0.2 mm的逐渐增多, 见图 5.启动初期, 反应器的容积负荷为0.10 kg·(m3·d)-1, 此时污泥中粒径小于0.2 mm的组分占总污泥量的质量分数为89.10%, 0.2~2.0 mm、2.0 mm以上的分别占10.44%、0.46%.当容积负荷提高到0.44 kg·(m3·d)-1时, 粒径小于0.2 mm的污泥质量占比减少到61.63%, 而粒径在0.2~2.0 mm和大于2.0 mm的比例分别增至33.71%和4.66%.路青等[27]在厌氧序批式反应器中接种厌氧颗粒污泥, 成功启动ANAMMOX反应后, 新形成的污泥粒径在0.5~1.0 mm之间.闾刚等[11]研究得出在ABR和MBR反应器中接种相同硝化污泥时, 稳定运行ANAMMOX反应期, ABR反应器中颗粒污泥粒径主要集中在0.2~1.25 mm之间, 而MBR反应器中的污泥主要以絮状形态存在.由此可看出, 在上升式流体反应器有利于培养ANAMMOX颗粒污泥.

粒径单位:mm 图 5 负荷提升阶段污泥粒径的变化 Fig. 5 Variation of sludge particle size during the increase in loading

3 启动阶段和负荷提升阶段微生物分析 3.1 各阶段细菌多样性及丰度分析

表 2可知, 4个样品检测的盖度均大于0.99, 表明检测结果可以代表绝大部分微生物的16S rRNA[28].进行高通量测序的污泥样品1取自接种污泥, 样品2、3、4分别取自总氮容积负荷为0.10、0.26、0.44 kg·(m3·d)-1稳定运行期间反应器内的混合污泥.

表 2 各样品中细菌丰度变化 Table 2 Richness and diversity of microbial communities in the samples

随着反应器内容积负荷的提高, 微生物的序列数也在25 086~37 718之间变化, 接种污泥和负荷为0.10 kg·(m3·d)-1时序列数变化不大, 但当负荷提升至0.26、0.44 kg·(m3·d)-1时, 序列数逐渐增大. Chao指数和ACE指数越大表明物种数越多[29].当反应器内容积负荷不断增大时, Chao指数和ACE指数开始有稍微的上升, 然后不断下降, 这表明反应器内的微生物种类在负荷不断提高的环境下趋于下降. Shannon指数指示生物群落组成复杂程度, 其值越大, 表明群落复杂程度越大; Simpson指数越大表明优势菌群占总体生物菌群比例越大.表中数据表明, 当负荷从0.10 kg·(m3·d)-1变化到0.44 kg·(m3·d)-1时, Shannon指数逐渐减小, 同步地Simpson指数不断增大, 这与氮素去除规律相一致.当负荷增大时, 污泥群落结构复杂度降低, 优势菌群比例增大.

3.2 各阶段微生物在门分类层面上的比对

为进一步研究不同容积负荷下污泥样品中的微生物群落组成情况, 将微生物群落结构在门分类层面上进行统计, 结果如图 6.

图 6 各样品细菌分类(门)的群落组成相对百分比 Fig. 6 Taxonomic classification of the bacterial communities in every sample at the phylum level

4个样品中含量较多的菌群均主要有绿曲挠菌门(Chloroflexi)、变形菌门(Proteobacteria)、WWE3门、放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)等门类.其中脱氮功能菌主要有变形菌门和浮霉菌门, 随着反应器内容积负荷的提高, 变形菌门所占比例逐渐减少, 而浮霉菌门随之增多.接种污泥中的变形菌门、浮霉菌门的丰度分别为21.60%、0.73%;当负荷增至0.44 kg·(m3·d)-1时, 它们的丰度分别变为14.20%和15.50%.目前研究表明, AAOB主要属于浮霉菌门[30], 由图 5可看出, 浮霉菌门在负荷为0.44 kg·(m3·d)-1阶段得到大量富集, 在此阶段, 反应器对TN去除率达到90%以上, 与微生物变化规律相一致.宋雨夏等[31]发现在ANAMMOX成功启动后, 厌氧氨氧化颗粒污泥中的群落结构发生了显著变化, 浮霉状菌门的丰度大幅提高为23.24%, 相比于接种污泥增加了14倍.厌氧反应器中还会经常检测出变形菌门[32], 甚至有研究者发现在ANAMMOX反应启动成功后, 变形菌门所占相对比例还会高于浮霉菌门[12].

3.3 各阶段微生物在属分类层面上的比对

为对UASB反应器内的脱氮功能菌进行详细分析, 选取样品中检测出的变形菌门和浮霉菌门进行属分类层面上的比对.

变形菌门中属分类较多, 可检测出的属占变形菌门中所有属的80%以上.接种污泥中Denitratisoma属含量较少, 而Rhodoplanes属相对较多, 占所有细菌比例的0.25%和3.02%;当容积负荷增大至0.44 kg·(m3·d)-1时, 这两个主要属的丰度呈现相反的变化, Denitratisoma属增至6.58%, Rhodoplanes属减少为0.49%.有研究得出, 在ABR反应器内, Denitratisoma属在AAOB功能区所有细菌中占比高达8.20%[33].表明随着AAOB的富集, Denitratisoma属比变形菌门中其他属种的菌类更具有与AAOB共存的能力.

浮霉菌门中检测出有Candidatus Brocadia属、Candidatus Jettenia属、Candidatus Kuenenia属、norank_f_Planctomycetaceae属、norank_c_om190属等常见属种(表 3).当反应器容积负荷增大时, Candidatus Brocadia属的富集程度最为明显, 其在总细菌数中的比例从最初的0.07%增至后来的13.4%.曹雁等[34]的研究表明, 在UBF厌氧氨氧化反应器中培养AAOB, 当负荷由0.29增至1.24 kg·(m3·d)-1时, Candidatus Brocadia属丰度由0.01%增到1.00%;邓杨帆[35]在SBBR反应器内检测到Candidatus Brocadia属是单级自养脱氮系统内的优势AAOB.而Candidatus Jettenia属和Candidatus Kuenenia属直到负荷增为0.44 kg·(m3·d)-1时才开始出现, 丰度分别为0.61%和0.11%. norank_f_Planctomycetaceae属、norank_c_om190属在负荷较小时所占比例较大, 分别达到0.47%、0.09%, 后面随负荷增大逐渐消失.

表 3 浮霉菌门中主要菌属的丰度变化/% Table 3 Change of the main genus in Planctomycetes communities/%

4 结论

(1) 采用UASB反应器, 接种具有ANAMMOX功能的厌氧污泥和城市污水厂好氧污泥的混合污泥启动ANAMMOX反应, 历经17d启动成功.启动阶段历经菌体水解期、活性提高期、稳定运行期, 污泥颜色由黑褐色逐渐变为浅红色, 在稳定运行期TN去除率达93.20%.

(2) 通过增大进水基质浓度逐步提高反应器的容积负荷, 当负荷增至0.44 kg·(m3·d)-1时, 反应器内污泥颜色变为深红色, 且在底部呈现颗粒状.粒径大于0.2mm的污泥在改变容积负荷前后占比分别为10.90%和38.37%.

(3) 通过高通量测序法对不同负荷情况下反应器污泥群落结构进行检测, 发现绿曲挠菌门(Chloroflexi)、变形菌门(Proteobacteria)、WWE3门、放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)等是主要微生物, 其中浮霉菌门中检测出有Candidatus Brocadia属、Candidatus Jettenia属、Candidatus Kuenenia属等, 其中Candidatus Brocadia属增幅最大, 其丰度从0.07%%增至13.40%.

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