2017, Vol. 38
6:2氟调醇(6:2 FTOH)及其同系物是一类多氟烷基物质(PFASs), 具有独特的疏水和疏油性质, 可取代长链多氟烷基物质(≥7个氟代碳原子), 被用于工业和消费品中, 如作为涂层和防水剂用在包装、纺织品、润滑油和涂料中[1~3].近来一项关于食物接触材料中氟调醇的研究显示, 6:2 FTOH最为常见, 其次为8:2 FTOH和10:2 FTOH[4]. PFASs在工业和消费品中的使用已导致环境中PFASs浓度升高[3~8]. 6:2 FTOH对哺乳动物有毒害作用[9, 10], 其在环境中的存在对生态和人体健康构成威胁.
环境中的6:2 FTOH可进行生物降解, 产生全氟羧酸(PFCAs)[11~14].以往对6:2 FTOH生物降解的研究多注重鉴定降解产物和分析降解途径[5].已有结果显示, 6:2 FTOH在土壤、沉积物和活性污泥中可发生氧化降解, 生成一系列的产物, 其中5:2 sFTOH为主要的中间产物, 5:3 Acid、PFHxA、PFPeA和PFBA为主要的稳定产物[15]. 6:2 FTOH及其上述降解产物已在环境中被检测[16, 17], 有可能对当地的微生物群落结构造成影响.到目前为止, 这方面的研究还很少, 仅有一篇报道了全氟烷基酸(PFAAs)对沉积物中细菌群落组成和动态的影响[18].
本研究的目的是通过基因分析方法研究6:2 FTOH生物降解对表层沉积物中细菌群落结构的影响.这对多氟烷基物质的环境风险评估与污染环境修复具有重要意义.沉积物微生物系统具有高度的多样性, 包含好氧微生物和厌氧微生物[19].本研究中, 通过微宇宙装置来模拟表层沉积物的环境.采用两种基因分析方法, 即变性梯度凝胶电泳(DGGE)和高通量测序, 两者都是直接从样品中提取微生物的基因组DNA, 采用基于核糖体RNA基因的通用引物进行扩增. DGGE基于分子指纹谱图来分析群落结构的变化, 比较直观, 但精度低, 只能对样品中丰度较大的微生物进行测定.高通量测序精度高, 信息丰富, 可从不同水平分析群落结构[20].
1 材料与方法 1.1 试剂多氟烷基和全氟烷基化合物6:2 FTOH、PFHxA、PFPeA和PFBA购自Sigma-Aldrich公司(美国). 5:2 FT Ketone购自TCI America公司(美国). 6:2 FTCA、6:2 FTUCA、5:2 sFTOH、5:3 Uacid、5:3 Acid和4:3 Acid由DuPont公司(美国)合成.所用试剂的纯度均在97%或以上. 表 1给出本研究中多氟烷基和全氟烷基化合物的缩略词、全称和分子结构.
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表 1 本研究中多氟烷基和全氟烷基化合物的缩略词、全称和分子结构 Table 1 Acronym, full name and chemical structure of the polyfluoroalkyl and perfluoroalkyl substances |
用于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)定量分析的内标为[1, 1, 2, 2-D; 3-13C] 6:2 FTOH[F(CF2)513CF2CD2CD2OH](DuPont公司, 美国)和[1, 2-13C] PFHxA [F(CF2)413CF213COOH](Wellington Laboratories, 加拿大). C18萃取柱(600 mg吸附剂)购自Alltech公司(美国).乙腈和其它溶剂(色谱纯)购自国药集团北京化学试剂(中国).高纯水(18 MΩ·cm)由Milli-Q系统产生(Millipore, 德国).
1.2 样品采集新鲜的表层沉积物样品和河水采自天津海河入海口.沉积物样品用柱状取样器采集, 然后用自封袋包装(袋内留有一定空气), 放入HDPE大口瓶中, 旋盖密封.河水用HDPE塑料桶采集后, 旋盖密封.所有样品在运输过程中保存在冷藏箱中, 运回实验室后保存在4℃冰箱内.
1.3 降解实验设置使用采集的沉积物和河水混合物(体积比约为2:3) 进行实验.实验装置为120 mL血清瓶, 内盛25 mL沉积物和河水混合物与5 mL矿质培养基(pH 7.0).矿质培养基的成分为：KH2PO4 85 mg·L-1、K2HPO4 218 mg·L-1, Na2HPO4·2H2O 334 mg·L-1、NH4Cl 5 mg·L-1、CaCl2·2H2O 36.4 mg·L-1、MgSO4·7H2O 22.5 mg·L-1和FeCl3·6H2O 0.25 mg·L-1.配制6:2 FTOH储备溶液, 含24 g·L-1 6:2 FTOH, 溶于50%乙醇(乙醇和水的体积比为1:1).实验设置活菌组(3个平行)、灭菌组(两个平行)以及溶剂对照组(两个平行).在活菌组中, 加入20 μL 6:2 FTOH储备溶液.在灭菌组中, 培养液经高温灭菌(121℃, 1 h)并冷却后, 加入20 μL 6:2 FTOH储备溶液.在溶剂对照组中, 仅加入20 μL 50%乙醇.加入6:2 FTOH储备溶液或乙醇后, 立即用丁基胶塞塞住瓶口, 用镂空的铝盖密封.为了保证培养物表层为有氧条件和捕获挥发性降解产物, 将一根注射针和C18萃取柱相连, 针头穿透丁基胶塞至培养瓶顶空.所有实验瓶用铝箔纸包住, 竖直放在振荡培养箱中振荡培养(转速150 r·min-1, 温度20~25℃).
采用破坏性方式采样, 在培养第0、3、7、14、28、100 d取不同处理组的整瓶样品, 进行6:2 FTOH及其降解产物的分析.取活菌组第0、3、7、14、28 d和溶剂对照组第0、28 d的沉积物样品, 提取基因进行DGGE分析.取活菌组第0和100 d的沉积物样品, 提取基因进行高通量测序分析.第0 d取样, 指在实验设置好的当天取样.
1.4 6:2 FTOH及其降解产物分析取样时, 在培养瓶内顶空相泵入空气约3 min使顶空相内气体通过C18萃取柱吸附所有易挥发物质, 然后用5 mL乙腈洗脱C18萃取柱, 将萃取液直接加入培养瓶内.培养瓶的丁基橡胶塞被推入瓶内. 60 mL乙腈被加入到样品瓶内萃取沉积物、水和橡胶塞混合物, 用新的丁基橡胶塞塞住瓶口, 铝盖密封, 铝箔纸包裹, 在摇床上水平振荡2 d(转速200 r·min-1, 室温).之后, 萃取液在400 r·min-1转速离心15~20 min, 取20 mL上清液经孔径为0.45 μm的尼龙滤纸过滤, 滤液保存于20 mL玻璃样品瓶中, 用于LC-MS/MS分析. 5:3 Acid在分析中易受其它代谢产物的干扰.为避免干扰, 取上述萃取液用EnviCarb碳粉吸附处理[11], 具体如下：在2.0 mL离心管内加入1.2 mL乙腈、0.4 mL萃取液、60 μL 1 mol·L-1 NaOH溶液和30 mg EnviCarb碳粉, 涡旋1 min使加入物充分混合, 接着离心管置于摇床内水平振荡6 h(转速200 r·min-1, 室温), 然后取出离心管并离心15 min(转速2 000 r·min-1), 吸取上清液经0.45 μm孔径的尼龙滤膜过滤, 滤液保存在1.5 mL玻璃样品瓶中, 用于分析.
分析6:2 FTOH及其降解产物的液相质谱仪为岛津API4000, 色谱柱为安捷伦Zorbax RX-C8(150 mm×2.1 mm, 粒径5 μm, 孔径8 nm), 采用电喷雾离子化源(ESI), 负离子模式, 离子源温度120℃, 去溶剂温度80℃, 去溶剂气体流速500 L·h-1, 锥孔气体流速50 L·h-1.流动相由溶剂A(0.15%醋酸水溶液)和溶剂B(0.15%醋酸乙腈溶液)组成, 流速为0.4 mL·min-1.柱温35℃, 进样量为10 μL.采用内标法对测定物进行定量, 内标为[1, 1, 2, 2-D; 3-13C] 6:2 FTOH和[1, 2-13C] PFHxA, 标线范围为10、20、50、100、200、300、400 μg·L-1, 所测氟化物的标线R2均在0.99以上, 检测限为0.2~11 μg·L-1.
1.5 细菌群落结构分析 1.5.1 变性梯度凝胶电泳取0.5 g沉积物(离心去水), 用FastDNA SPIN土壤提取试剂盒(MPBIO, 美国)提取全基因组.使用TC-25/H热循环仪(Bio-Equip, 中国), 用带GC夹的细菌16S rDNA通用引物(341F-GC：5′-CGC CCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCC CGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′, R518：5′-ATTACCG CGGCTGCTGG-3′)对提取的DNA进行扩增.扩增采用降落PCR法, 50 μL PCR体系中包括：1.5 mmol·L-1 Mg2+, 50 mmol·L-1 KCl, 200 μmol·L-1 dNTPs, 1 μmol·L-1引物, 2.5 U DNA聚合酶, 0.5 μL(1 pg~1 ng)模板DNA. PCR程序为：94℃预热5 min; 循环一：变性94℃ 1 min, 杂交65℃ 1 min(每个循环降0.5℃), 延伸72℃ 1 min, 循环数20;循环二：变性94℃ 1 min, 杂交55℃ 1 min, 延伸72℃ 1 min, 循环数10;最后一次延伸72℃ 10 min; 然后4℃保存.升温程序设置为2℃·s-1, 降温程序设置为-1.5℃·s-1, 热盖.
配制丙烯酰胺胶, 丙烯酰胺变性浓度范围为35%~65%.在基因突变分析系统(INGENYphorU System, the Netherlands)中, 将DNA扩增产物40 μL和6X载样缓冲液8 μL混匀后用50 μL注射器注入孔道. 60℃、100V高压预电泳5 min, 然后打开循环水泵, 换成60℃、70V恒温恒压电泳16 h以上.取出胶体浸入3 L EB染液中, 避光染色45 min, 换至清水中避光脱色20 min后, 在凝胶成像系统观察DNA条带.对一些特征条带进行切胶, 用无菌水浸泡12 h, 然后用不带GC夹的细菌16S rDNA通用引物(F341：5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′, R518：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)对浸泡液中的DNA进行PCR.配制1.5%琼脂糖凝胶, 取3 μL PCR产物与0.6 μL 6X缓冲液混合上样.用100V恒压电泳40 min, 在凝胶成像系统中显像, 观测DNA产物.将扩增产物送到生工(上海)有限公司进行测序.所得结果与美国国立生物信息中心的基因库进行比对, 确定其种属.
1.5.2 高通量测序取0.5 g沉积物(离心去水), 用FastDNA SPIN土壤提取试剂盒(MPBIO, 美国)提取全基因组.使用TC-25/H热循环仪(Bio-Equip, 中国)对样品中16S rRNA基因的V3-V4区进行扩增, 正向和反向引物分别为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′).在正向引物的5′端添加带6个碱基长度Barcode序列区分样品.反应体系(50 μL)包含25 μL 2×PCR反应混合物(Takara Premix TaqTM Version 2.0, 日本)、0.5 μL正向引物(100 μmol·L-1)、0.5 μL反向引物(100 μmol·L-1)、1 μL DNA模板、以及23 μL灭菌高纯水.循环参数如下：在94℃预热5 min, 随后进行30个循环, 每个循环变性94℃ 30 s、杂交55℃ 30 s、延伸72℃ 1 min, 最后延伸72℃ 10 min. PCR产物经2%琼脂糖电泳检测阳性后, 送至上海美吉生物医药科技有限公司, 使用MiSeq PE300高通量测序平台(Illumina, 美国)进行高通量测序.
MiSeq测序得到的为双端序列数据.使用FLASH将成对的reads拼接成一条序列, 同时对reads的质量和merge的效果进行质控过滤, 根据序列首尾两端的barcode和引物序列区分样品得到有效序列, 并校正序列方向.使用Usearch(V7.1) 对优化序列提取非重复序列, 去除没有重复的单序列.按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行操作分类单元(OTU)聚类, 在聚类过程中去除嵌合体, 得到OTU的代表序列.将所有优化序列map至OTU代表序列, 选出与OTU代表序列相似性在97%以上的序列, 生成OTU表格.使用97%相似度的OTU, 利用mothur软件(V1.30.1) 做稀释性(Rarefaction)分析, 并计算ACE、Chao1、Shannon-weiner、Simpson和Coverage参数. ACE和Chao1是表征群落丰度的指数, Shannon-weiner和Simpson是表征群落多样性的指数, Coverage是表征测序深度的指数.在Qiime平台上采用RDP classifier(V2.2) 贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析, 并在各个水平(界、门、纲、目、科、属、种)统计每个样品的群落组成, 置信度阈值为0.7.使用R程序(V3.3.0) 制作heatmap等图形.
2 结果与讨论 2.1 沉积物中6:2 FTOH的生物降解在为期100 d的实验中, 活菌组6:2 FTOH浓度明显下降且检测到多种降解产物, 灭菌组6:2 FTOH浓度下降但未检测到降解产物, 溶剂对照中未检测到6:2 FTOH及其降解产物.活菌组中, 测得的初始6:2 FTOH浓度为(8.95±1.56) mg·L-1, 第3 d时6:2 FTOH浓度已降至(3.28±0.32) mg·L-1, 之后持续下降至(0.13±0.05) mg·L-1.灭菌组中, 测得的初始6:2 FTOH浓度为(2.00±0.35) mg·L-1, 明显低于活菌组中6:2 FTOH的初始浓度, 其原因可能是沉积物经高温灭菌后岩性发生变化, 对6:2 FTOH的吸附增强.实验第3 d时灭菌组6:2 FTOH浓度降至约1.00 mg·L-1, 之后基本没有变化, 也无降解产物被检出. 图 1显示活菌组中6:2 FTOH及其代谢产物占初始6:2 FTOH的摩尔分数随时间的变化.
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图 1 活菌组中6:2 FTOH及其代谢产物占初始6:2 FTOH的摩尔质量百分数随时间的变化 Fig. 1 Change in the ratio of abundance (molar mass fraction of 6:2 FTOH and its degradation products as compared to the initial 6:2 FTOH) over time |
本研究中, 6:2 FTOH的半衰期小于3 d, 且至少检测到9种降解产物, 与文献中报道的结果基本一致[14, 21].实验初期, 6:2 FTOH迅速生成6:2 FTCA和6:2 FTUCA, 随后这两种物质的质量逐渐减少, 其它物质相继生成, 包括5:2 FT Ketone、5:2 sFTOH、5:3 Uacid、PFHxA、PFPeA、PFBA、5:3 Acid和4:3 Acid.根据报道[11, 14], 在有氧条件下, 6:2 FTOH被微生物迅速转化成6:2 FTAL, 继而被转化为6:2 FTCA, 再脱氟形成不饱和碳碳双键, 转化为6:2 FTUCA. 6:2 FTUCA有两条代谢途径：① 首先转化为5:2 Ketone, 而后转化为5:2 sFTOH, 最后生成PFHxA和PFPeA; ② 首先脱氟生成5:3 Uacid, 而后加氢形成主要终产物5:3 Acid和少量PFBA. 5:3 Acid可进一步降解生成4:3 Acid.本研究中, 在第100 d时, 主要的稳定产物PFHxA、PFPeA、PFBA、5:3 Acid和4:3 Acid量占6:2 FTOH初始量的摩尔分数分别为9.5%、2.5%、1.1%、14.8%和0.2%, 该结果与Zhao等[11]的研究结果略有不同, 其使用的实验沉积物和水样采自美国宾夕法尼亚州Brandywine小河, 培养体系中包括20 g沉积物(沉积物干重9.3 g, 含水10.7 mL)、25 mL河水和5 mL矿物培养基, 加入10 μL 6:2 FTOH储备溶液(5 g·L-1, 溶于50 %乙醇), 培养液中6:2 FTOH理论终浓度为1.2 mg·L-1, 经过100 d的有氧培养, 主要的稳定产物PFHxA、PFPeA、PFBA、5:3 Acid和4:3 Acid量占6:2 FTOH初始量的摩尔分数分别为8.4%、10.4%、1.5%、22.4%和2.7%.本实验中, 沉积物中6:2 FTOH的初始浓度较高, 可能对微生物活性有些抑制, 使得下游产物的摩尔分数较低.实验期间, 活菌组6:2 FTOH及其代谢产物占初始6:2 FTOH的摩尔分数之和为85.7%~104.0%, 表明产生的降解产物基本能解释6:2 FTOH的减少.
2.2 沉积物中6:2 FTOH生物降解对细菌群落结构的影响实验前期利用DGGE方法研究细菌群落结构.取活菌组第0、3、7、14、28 d样品(D0、D3、D7、D14、D28) 和溶剂对照组第0和28 d样品(B-D0、B-D28) 进行分析, 电泳图谱见图 2.用天能凝胶成像系统自带的图像处理软件对各泳道的带条数、光密度和强度等进行分析, 计算Shannon-wiener指数和Simpson指数, 结果列于表 2.
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4-1: Glaciecola nitratireducens spp.; 5-1: Pseudomonas stutzeri spp.; 5-2: Pseudomonas denitrificans spp.; 6-1: Pseudomonas putida spp.; 6-2: Arcobacter nitrofigilis spp.; 8-1: Rahnella aquatilis HX2 spp.; 8-2: Sulfurovum spp.; 10-1: Clostridium sticklandii spp.; 10-2: Simiduia agarivorans spp.; 10-3: Bacteroidetes spp.; 10-4: Polaribacter spp.; 10-5: Sulfurimonas autotrophica spp.; 10-6: Pseudomonas synxantha spp.; 10-7: Pseudomonas aeruginosa spp.; 10-8: Shewanella baltica spp.; 10-9: Lacinutrix spp.; 10-10: Aequorivita sublithincola spp.; 11-1: Bacillus spp.; 11-2: Idiomarina loihiensis spp.; 11-3: Arcobacter spp.; 11-4: Thiomicrospira crunogena spp. 图 2 不同处理组细菌群落结构随时间的变化 Fig. 2 Changes in bacterial community structure over time for different treatments |
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表 2 不同处理组沉积物中细菌群落α多样性指数随时间的变化(平均值, n=2) Table 2 Change of α diversity indices of bacterial community in sediments under different treatments |
在活菌组中, 细菌群落结构随时间有明显变化.实验起始时(D0), DGGE条带的亮度较弱, 条带数较少, 表明细菌群落的生物量较低, 丰富度和多样性也较低, 其原因可能是6:2 FTOH刚加入到培养液时浓度较高, 对细菌产生较大的毒性.实验第3 d和第7 d时(D3和D7), 6:2 FTOH的浓度降低, 6:2 FTCA、6:2 FTUCA等产物浓度升高, 细菌群落的丰富度和多样性均增大.实验第14 d时(D14), 5:2 sFTOH、5:3 Uacid、PFHxA等产物浓度升高, 细菌群落的丰富度和多样性增至最大.实验第28 d时(D28), 细菌群落的丰富度和多样性略有下降, 可能是某些产物的积累对细菌的生长有抑制作用.在溶剂对照组中(B-D0和B-D28), 细菌群落结构随时间无明显变化, 表明微量乙醇的加入对细菌的群落结构影响不大.
对电泳图谱中的优势条带进行测序, 结果显示沉积物中最初的优势菌种为弓形菌(Arcobacter spp., 11-3).活菌组加入6:2 FTOH后的一周内, 弓形菌的丰度下降, 其它菌如Clostridium sticklandii spp.(10-1)、食藻多贺氏菌(Simiduia agarivorans spp., 10-2)、脱氮居水菌(Glaciecola nitratireducens spp., 4-1)、产黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha spp., 10-6)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida spp., 6-1)、硝化弓形菌(Arcobacter nitrofigilis spp., 6-2)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri spp., 5-1) 和脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans spp., 5-2) 的丰度上升, 其中恶臭假单胞菌是优势菌, 而原有的芽孢杆菌(Bacillus spp., 11-1)、罗伊赫海源菌(Idiomarina loihiensis spp., 11-2) 和硫微螺菌(Thiomicrospira crunogena spp., 11-4) 的丰度下降.至第14 d, 水生拉恩菌(Rahnella aquatilis HX2 spp., 8-1) 和Sulfurovum spp.(8-2) 的丰度上升, 而脱氮居水菌(4-1)、恶臭假单胞菌(6-1)、硝化弓形菌(6-2)、施氏假单胞菌(5-1) 和脱氮假单胞菌(5-2) 的丰度下降.至第28 d时, 拟杆菌(Bacteroidetes spp., 10-3)、极地杆菌(Polaribacter spp., 10-4)、硫自养菌(Sulfurimonas autotrophica spp., 10-5)、Lacinutrix spp.(10-9) 和栖海面菌(Aequorivita sublithincola spp., 10-10) 的丰度上升, 而硝化弓形菌(6-2) 和绿浓杆菌(Pseudomonas aeruginosa spp., 10-7) 的丰度下降.
实验设计中, 最后一次采样时间点距离前面几次采样时间点较长, 因此未能一起进行DGGE分析.考虑到分析成本, 仅对第0 d(D0) 和第100 d(D100) 活菌组沉积物样品进行基因的高通量测序. D0样品获得12 294个序列数, D100样品获得13328个序列数, 测序深度指数均为0.989, 表明测序结果代表了样本中微生物的真实情况. D0样品的OTU数为361, D100样品的OTU数为336, 根据OTU计算的α多样性指数列于表 3.与D0样品相比, D100样品的群落丰富度减小, 但多样性增大. D0和D100样品中共有的OTU为181个, D0特有的OTU为180个, D100特有的OTU为155个.实验后, 沉积物中细菌的群落结构发生了明显变化, 群落中物种数减少, 但物种的分布更均匀了.
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表 3 实验开始和结束时沉积物中细菌群落的α多样性指数比较 Table 3 Comparison of α diversity indices for bacterial community in the sediment at the beginning and end of the experiment |
从门的分类水平看, D0和D100样品中共检出27个细菌门, 其中两个样品中共有的门为18个, D0特有的门为5个, D100天特有的门为4个.与D0样品相比, D100样品中有15个门的丰度上升, 12个门的丰度下降, 其中变化幅度较大的门是：绿弯菌门(Chloroflexi, 上升24.8%)、变形菌门(Proteobacteria, 下降17.8%)和厚壁菌门(Firmicutes, 下降15.9%). 图 3显示D0和D100样品中门分类水平上的群落结构.
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图 3 活菌组D0和D100样品中门分类水平上的细菌群落结构 Fig. 3 Bacterial community structures in D0 and D100 samples of active groups at Phylum level |
从纲的分类水平看, D0和D100样品中共检出54个细菌纲, 其中两个样品共有的纲为36个, D0特有的纲为6个, D100特有的纲为12个.与D0样品相比, D100样品中有32个纲的丰度上升, 22个纲的丰度下降, 其中变化幅度较大的纲是：厌氧绳菌纲(Anaerolineae, 上升19.6%)、δ-变形菌纲(δ-Proteobacteria, 上升4.3%), OD1(上升2.3%)、JG30-KF-CM66(上升2.1%)、酸杆菌纲(Acidobacteria, 上升2.0%)、ε-变形菌纲(ε-Proteobacteria, 下降20.0%)、梭菌纲(Clostridia, 下降10.1%)、芽孢杆菌纲(Bacilli, 下降5.8%)、γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria, 下降4.2%). 图 4显示D0和D100样品中纲分类水平上的群落结构.
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图 4 活菌组D0和D100样品中纲分类水平上的细菌群落结构 Fig. 4 Bacterial community structure in D0 and D100 samples of active groups at the Class level |
从属的分类水平看, D0和D100样品中共检出263个细菌属, 其中两个样品中共有的属为126个, D0特有的属为79个, D100特有的属为58个.与D0样品相比, D100样品中有119个细菌属的丰度上升, 144个细菌属的丰度下降, 其中变化较大的属是：Anaerolineaceae_uncultured(上升19.1%)、硫碱球菌属(Thioalkalispira spp., 上升13.3%)、Candidate_division_OD1_norank(上升2.3%)、JG30-KF-CM66_norank(上升2.1%)、γ-Proteobacteria_unclassified(上升2.0%)、弧菌属(Vibrio spp., 下降14.1%)、硫单胞菌属(Sulfurimonas spp., 下降13.2%)、芽孢杆菌属(Bacillus spp., 下降5.1%)、Sulfurovum spp.(下降4.2%)、Fusibacter spp.(下降4.1%)、弓形杆菌属(Arcobacter spp., 下降2.7%)、希瓦氏菌(Shewanella spp., 下降2.3%)和温暖杆菌属(Tepidibacter spp., 下降2.0%). 图 5显示D0和D100样品中属分类水平上的群落结构热图(仅显示D0和D100样品中相对丰度变化较大的前49个属).
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图 5 活菌组D0和D100样品中属分类水平上的细菌群落结构热图 Fig. 5 Heatmap of bacterial community structure in D0 and D100 samples of active groups at the Genera level |
变形菌门是细菌中最大的一门, 在全球化学循环中起重要作用, 在好氧和厌氧环境中均可生活, 它分为5个纲, 即α-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌纲、δ-变形菌纲和ε-变形菌纲[22], 这5个纲在所研究样品中均被检测到, 其中占优势的是γ-变形菌纲.已有研究显示, γ-变形菌纲假单胞菌属中的食油假单胞菌(Pseudomonas oleovoran)、食丁烷假单胞菌(Pseudomonas butanovora)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)可以将6:2 FTOH降解为5:2 sFTOH和5:2 FT Ketone[23, 24].假单胞菌属在所研究样品中也被检测到, 且丰度在D100中(5.1%)大于D0(4.1%).绿弯菌门是D100样品中丰度增加最大的一门, 它分为6个纲, 即厌氧绳菌纲(Anaerolineae)、暖绳菌纲(Caldilineae)、绿弯菌纲(Chloroflexi)、热微菌纲(Thermomicrobia)、脱卤菌纲(Dehalococcoidetes)和Ktedobacteria, 本研究样品中检测到前4个纲, 其中占优势的是厌氧绳菌纲.厌氧绳菌科中的一个尚未培养出的细菌属在属分类水平上占优势.根据已有的报道, 厌氧绳菌科的细菌是厌氧菌, 能够降解长链正烷类物质(C15~C20)[25, 26]. 6:2 FTOH及其中间降解产物为带有氟取代基的长链正烷类物质, 很可能被厌氧绳菌科的细菌利用.在本次研究中, 培养物为河水和沉积物的混合物, 尽管培养瓶盖上插有注射器(连接固相萃取管), 但下部沉积物内仍有可能处于厌氧状态, 从而有利于厌氧绳菌科细菌的生长.此外, 有研究报道绿弯菌门中的细菌可以氯乙烯类、氯苯类、氯苯酚类、多氯联苯类等卤代有机物为电子受体呼吸[27, 28]. δ-变形菌纲硫碱球菌属的细菌也可能参与6:2 FTOH的生物降解.硫碱球菌属嗜卤碱, 可在微氧和厌氧条件下将硫代硫酸盐、硫化物和元素硫等氧化为硫酸盐[29].某些细菌(如弧菌属、硫单胞菌属、芽孢杆菌属、Sulfurovum、Fusibacter等)经培养后丰度下降, 表明其可能受到6:2 FTOH及其降解产物的抑制.
Sun等[18]研究了受全氟烷基羧酸污染的沉积物中细菌的群落结构, 发现高浓度的全氟辛酸(PFOA, 约450 ng·g-1, 以干重计, 下同)可导致沉积物中ε-变形菌纲的丰度(23.4%)远高于同一河流其它沉积物(PFOA＜250 ng·g-1)中丰度(0.6%~1.7%), 其中硫单胞菌属的丰度(21.1%)远高于同一河流其它沉积物中丰度(0.3%~1.0%).此外, 高浓度PFOA沉积物中β-变形菌纲硫杆菌属的丰度(22.9%)也远高于同一河流其它沉积物中丰度(1.5%~6.8%).本研究中, 尽管沉积物经过100 d的实验后ε-变形菌纲的丰度下降(由38.2%变为18.1%)、硫单胞菌属的丰度下降(由18.2%变为5.0%), 但它们在各自水平上仍为优势菌; 沉积物经过100 d的实验后β-变形菌纲硫杆菌属的丰度上升(由0.2%变为0.9%).由于沉积物来源和研究对象不同, 所观察到的细菌群落结构变化的规律不完全相同, 但有相似之处.
3 结论(1) 6:2 FTOH在沉积物微生物的作用下可发生降解, 生成6:2 FTCA、6:2 FTUCA等中间产物和5:2 FT Ketone、5:2 sFTOH、PFHxA、PFPeA、PFBA、5:3 Acid等稳定产物.
(2) 6:2 FTOH生物降解对沉积物细菌群落结构产生明显影响, 引起群落丰富度和多样性的变化.在6:2 FTOH降解的不同阶段, 优势菌群略有不同.实验期间, 6:2 FTOH生物降解引起丰度上升较大的有Anaerolineaceae_uncultured(+19.1%)和硫碱球菌属(+13.3%), 引起丰度下降较大的有弧菌属(-14.1%)、硫单胞菌属(-13.2%)、芽孢杆菌属(-5.1%)、Sulfurovum spp.(-4.2%)和Fusibacter spp.(-4.1%).
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