2017, Vol. 38
目前，由于水资源缺乏导致的水环境问题日益突出，加上人们环保意识的不断提高，污水处理质量标准日趋严格，传统的污水处理技术需要突破自我不断提高.许多研究者在不断寻找强化污水处理效果的新方法，其中将磁场与污水处理技术相结合的方法受到越来越多关注.磁技术与其他水处理技术相结合，可强化并提高生物处理系统的污染物去除能力和效率[1~3].关于磁场对污水处理影响的研究主要有：磁场对水体物理化学过程的强化作用[4]，应用磁场的物化效应或电化学效应，对磁性颗粒和非磁性颗粒进行力学分离[5, 6]；磁场对各种污染物去除机制[7]；磁场对微生物生长和对微生物酶活性的影响[8, 9].到目前为止，已有大量关于SBR与其它技术联合提高污水处理效果及活性污泥微生物群落多样性的研究[10~14]，然而，关于运用高通量测序技术研究磁场对活性污泥微生物群落结构和功能的影响尚鲜见报道.活性污泥中微生物群落结构的稳定性与活性污泥的污水处理效果有着密切的关系，在污水处理系统中维持细菌群落的多样性和群落结构的稳定性对于达到较好的污水生物处理效果是十分重要的[15, 16].
本研究利用自制SBR反应器，采用Illumina的MiSeq测序平台研究活性污泥系统中细菌群落结构及多样性变化，并结合主要污染物去除率及活性污泥的变化情况进行分析，从磁场对活性污泥细菌群落结构的作用效果上深入分析磁场对活性污泥系统的影响，避免了DEEG、FISH等传统分子生物学方法弊端[17, 18]，以期为进一步将磁场应用于活性污泥技术的规模化应用提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 污水及污泥来源所用污水为人工配制的模拟城市生活污水，污水水质：COD 510~525 mg·L-1，氨氮26~26.5 mg·L-1，总氮29.5~30.5 mg·L-1，总磷4.4~4.7 mg·L-1，SS 8~9 mg·L-1.接种污泥取自山东省泰安市某污水处理厂的回流污泥，接种污泥浓度MLSS为3 460 mg·L-1，MLVSS为2 780 mg·L-1，SV30为31%.
1.2 实验装置所用SBR反应器为自制玻璃反应器，尺寸16 cm×16 cm×50 cm.各反应器上装有进水浮球开关，排水电磁阀等.小型曝气泵充氧曝气，曝气量大小由曝气管上的阀门控制. SBR污水处理各工序由时间控制器自动控制运行，反应周期8 h，每周期进水1 h，曝气4 h，沉淀2 h，排水0.5 h，闲置0.5 h，每天3个周期.共设7组SBR反应器，每组反应器外增加一对平行磁铁产生磁场，实验装置简图见图 1.磁铁选用铁磁性材料(15 cm×10 cm×2.5 cm).磁场位型选择相吸磁场，通过调整平行磁铁之间的距离来调整磁感应强度.磁感应强度的测定选用HT-20型高斯计.
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图 1 实验装置示意 Fig. 1 Schematic diagram of the experimental apparatus |
整个实验的运行，主要包括3个阶段，一是污泥驯化阶段，接种污泥在实验室条件下培养驯化至稳定；二是添加磁场，A组为空白对照不加磁场，B、C、D、E、F、G组分别添加磁感应强度3×10-2 T、5×10-2 T、7×10-2 T、9×10-2 T、12×10-2 T、15×10-2 T；三是稳定运行阶段，此时活性污泥适应了不同强度磁场且系统出水水质稳定.接种污泥经充分混合后分至各反应器，且后期培养驯化条件相同，保证了7组样品初始生物群落结构的一致性.加磁场稳定运行一段时间后，取各反应器中污泥混合液用Illumina MiSeq高通量测序技术对污泥的微生物群落多样性进行分析.实验过程中，严格控制实验条件，使SBR反应器溶解氧的含量控制在2.5 mg·L-1左右，温度保持在20~26℃，pH保持在7.0~8.0，污泥浓度控制在3 000 mg·L-1左右.每天定时监测各反应器进出水水质及各类污泥指标.
1.4 指标分析方法 1.4.1 水质及污泥指标分析方法本实验所测水质指标主要有COD、氨氮、总氮、总磷等，污泥指标主要有脱氢酶活性、SV、MLSS等.水质指标采用国标法进行测定，脱氢酶活性的测定选用TTC-还原法.
1.4.2 微生物多样性测序分析方法DNA提取：取混合均匀的活性污泥，采用OMEGA Soil DNA kit试剂盒，按照说明书的要求提取DNA.
PCR扩增：选用扩增片段长度420bp的细菌16S rRNA基因高度可变的V4-V5区来测序. PCR扩增引物：515F(5′-barcode+ GTGCCAGCMGCC GCGGTAA-3′)；907R(5′-CCGTCAATTCMTTTR AGTTT-3′).扩增结果进行2%琼脂糖凝胶电泳，切取目的片段用Axygen凝胶回收试剂盒回收.利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit对PCR产物在Microplate reader上进行定量，混样.
文库构建及MiSeq测序：以扩增产物为模板进行测序文库制备，Illumina MiSeq系统测序V4-V5区.对合格的文库，在MiSeq机器上利用MiSeq Reagent Kit V3(600cycles)进行2×300bp双端测序.
序列及生物多样性分析：使用QIIME软件，调用UCLUST序列比对工具[19]，对获得的高质量序列按97%的序列相似度进行归并和OTU划分.将OTU代表序列与对应数据库的模板序列相比对，获取每个OTU所对应的分类学信息，计算每个样本Chao1、ACE、Simpson、Shannon这4种多样性指数.根据OTU划分和分类地位鉴定结果，在多个层级上全面分析活性污泥细菌群落的构成及微生物数量. Beta多样性主要反映不同样本间的差异性，本研究主要通过主成分分析(principal component analysis，PCA)、聚类分析等方法，观测样本之间的差异.
1.5 数据处理采用SPSS 20.0数据统计软件对实验数据进行单因素方差分析，差异显著性水平P＜0.05，采用Excel作图.微生物学数据处理及热图、PCA图的绘制采用统计学R软件.
2 结果与讨论 2.1 磁场对SBR反应器运行性能的影响稳定运行阶段，分析不同外加磁感应强度条件下SBR系统中污染物去除率、脱氢酶活性等指标变化情况.由图 2可见，与未加磁场相比，不同外加磁感应强度下SBR反应系统各污染物去除效率明显存在不同程度的升高，差异显著(P＜0.05).磁感应强度由0增加到7×10-2T，COD、氨氮、总氮、总磷去除率均升高最终达到最高值，分别为94.23%、88.93%、85.98%、95.82%；磁感应强度继续增大时，处理效率不断下降，但仍高于对照组.说明外加磁感应强度变化对SBR反应系统去除效率等指标会产生一定影响，磁场的加入都会不同程度提高系统的运行性能，各污染物去除率变化趋势大致相同.外加磁感应强度为7×10-2T时SBR系统运行性能提高效果最明显，COD、氨氮、总氮、总磷去除率相比于未加磁场分别提高6.29%、8.89%、20.29%、4.61%，其中总氮去除率提高最多，说明7×10-2T外加磁场对SBR反应系统中总氮去除效果影响最显著，且总氮去除率在不同磁感应强度下均存在显著差异(P＜0.05).
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图 2 外加磁场条件下SBR系统中污染物去除率变化 Fig. 2 Changes in pollutant removal rate in an SBR system under an external magnetic field |
污泥脱氢酶活性(图 3)在外加磁感应强度3×10-2T时下降5%，磁感应强度继续增大，脱氢酶活性不断升高，达到12×10-2T时升高幅度减小，趋于相对稳定.由此可知，中高强度外加磁场均会促进污泥活性提高，磁感应强度升高达到一定程度时促进作用减小.脱氢酶活性指标能够准确反映污泥活性，外加磁场提高了脱氢酶活性，因此对COD、氨氮、总氮、总磷的去除效率均有一定的促进作用.
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图 3 外加磁场条件下污泥脱氢酶活性变化 Fig. 3 Change of the sludge dehydrogenase activity under a external magnetic field |
外加磁场可通过强化水体物理化学过程，提高污泥絮凝效果，促进污泥微生物生长、微生物酶活性，改变微生物群落结构及多样性等影响污水处理系统的运行性能.本研究主要对活性污泥细菌群落结构及多样性的变化进行探索.
2.2 磁场对活性污泥中细菌群落多样性的影响在活性污泥法污水处理中微生物是作用主体，微生物群落丰度及多样性的变化对污水处理效果有着重要的影响.不同指数对于衡量群落多样性的侧重点各不相同. Chao1指数和ACE指数侧重于体现群落丰富度，Shannon指数和Simpson指数体现群落多样性. Coverage指数用来表示获得的数据相对于整体样品数据的覆盖程度，数值越高，表明样本获得的数据相对于整体样本数据的覆盖程度越高[20].
由表 1可知，所测样品的Coverage指数均在97%以上，说明测序结果足够反映样品中微生物的真实情况.各反应系统OUT数相差不大，在20 319~22 535之间波动.与未加磁场相比，外加磁感应强度为3×10-2 T、5×10-2 T、7×10-2 T时，Chao1指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数均存在显著差异(P＜0.05). 12×10-2 T与15×10-2 T磁感应强度下各多样性指标差异不显著(P＜0.05).不同磁感应强度下的污泥样品的微生物多样性各不相同，在3×10-2 T和5×10-2 T的低磁感应强度条件下，微生物多样性出现下降趋势.外加磁感应强度为7×10-2 T时，Chao1指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数均最高，由未加磁场时的580、766、0.899、5.127分别增加到643、839、0.937、5.717，说明在7×10-2 T磁感应强度作用下活性污泥微生物群落变化最明显.结合图 2、3分析可知，外加磁感应强度为7×10-2 T时，活性污泥微生物群落多样性及污染物去除效率均最高，说明污染物去除率与活性污泥中微生物群落多样性变化情况具有一定相关性.
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表 1 生物多样性指数1) Table 1 Biodiversity indices |
2.3 磁场对活性污泥中细菌群落组成的影响 2.3.1 活性污泥细菌门类丰度变化
实验SBR反应器中的细菌域共鉴定出14个门，如图 4所示，主要以变形菌门Proteobacteria(25.3%~61.5%)、拟杆菌门Bacteroidetes(18.6%~46.2%)、放线菌门Actinobacteria(5.3%~47.2%)、酸杆菌门Acidobacteria(0.4%~4.0%)为主.
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图 4 细菌域门水平分布 Fig. 4 Distribution of bacterial phyla |
活性污泥微生物门水平组成随外加磁感应强度的变化各不相同. Proteobacteria是对照组活性污泥细菌域中丰度最高的门(52.2%)，其广泛存在于活性污泥系统[21~23].与未加磁场相比，Proteobacteria丰度在3×10-2T时升高(61.5%)，在5×10-2T、7×10-2T、9×10-2T、12×10-2T、15×10-2T降低(29.3%、44.5%、32.2%、25.3%、44.1%)，即低磁感应强度能够促进Proteobacteria丰度提高，磁感应强度继续增大则对其起不同程度的抑制作用.如图 5，检测到的变形菌门主要包括α-Proteobacteria(1.0%~5.4%)、β-Proteobacteria(11.2%~32.9%)、δ-Proteobacteria(0.2%~0.7%)和γ-Proteobacteria(7.4%~39.8%)这4个纲.相关研究表明，将氨氧化成亚硝酸的氨氧化菌(Ammonia-oxidizing bacteria, AOB)主要属于β-Proteobacteria及极少数的γ-Proteobacteria[24].而将亚硝酸盐氧化成硝酸盐的亚硝酸盐氧化菌(Nitrite-oxidizing bacteria，NOB)主要属于α-Proteobacteria及部分δ-Proteobacteria和γ-Proteobacteria[25].与未加磁场相比，7×10-2 T磁场下污泥样品β-Proteobacteria丰度增长最多(32.9%).
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图 5 细菌域纲水平分布 Fig. 5 Distribution of bacterial class |
3×10-2T、7×10-2 T、9×10-2 T磁场下Acidobacteria丰度较未加磁场时下降，7×10-2 T磁场条件下丰度最低(0.4%)，相应的其它磁感应强度下Acidobacteria丰度均有提高. Actinobacteria在3×10-2 T、5×10-2 T低磁感应强度下丰度降低，但在其它中、高磁感应强度条件下均有提高，5×10-2 T最低(5.3%)，12×10-2 T时最高(47.2%).装甲菌门Armatimonadetes在3×10-2T降低，12×10-2 T提高.拟杆菌门Bacteroidetes在3×10-2 T、7×10-2 T、12×10-2 T降低，在5×10-2 T、9×10-2 T、15×10-2 T提高.厚壁菌门Firmicutes在5×10-2 T、12×10-2 T增多.在研究中还发现了少量浮霉菌门Planctomycetes，有研究表明执行厌氧氨氧化过程的细菌均属于浮霉菌门，该类细菌能够在缺氧条件下以硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体，将氨氧化，直接转化成氮气.厌氧氨氧化被证实为微生物参与的全球氮循环的重要过程[26].在7×10-2 T磁感应强度作用下，浮霉菌门丰度相较于对照组增长了4倍，这为利用厌氧氨氧化途径提高污水处理效果提供了新的思路. TM7和疣微菌门Verrucomicrobia在D组7×10-2 T磁感应强度条件下丰度最高，其它条件下差别不大，但这两类门在活性污泥中丰度普遍都很低. Verrucomicrobia的细菌绝大多数属于未培养的微生物，其功能还鲜为人知[27].
2.3.2 活性污泥细菌属类丰度变化活性污泥细菌域共检测到182个属，如图 6及图 7.从中可见，在7种不同磁感应强度下的污泥样品中，仅有热单胞菌属Thermomonas及Piscicoccus的丰度均超过1%，是7种活性污泥共有的优势属. Thermomonas属于变形菌门γ-Proteobacteria的黄色单胞菌目Xanthomonadales，其含量在3×10-2 T下最高(30.20%)，是对照组(16.85%)的1.8倍，而磁感应强度继续增大时该菌属丰度均低于对照组，且在5×10-2T(1.90%)和12×10-2T(1.06%)时下降幅度最大. Piscicoccus属于放线菌门Actinobacteria中放线菌纲的Actinomycetales目.未加磁场时活性污泥中Piscicoccus含量为3.56%，在低磁感应强度下逐渐降低(3×10-2T：2.96%；5×10-2T：1.48%)，在中高等磁感应强度下含量高于对照组且逐渐上升至12×10-2T的17.89%时又出现下降的趋势.
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图 6 细菌域属水平分布 Fig. 6 Distribution of bacterial genus |
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图 7 活性污泥细菌优势属含量分布 Fig. 7 Distribution of the most abundant genera in activated sludge |
检测到的活性污泥细菌域中有8种属在至少1个样品中含量超过1%，为部分样品的共有优势属. 6种属于变形菌门Proteobacteria，其中红芽生菌属Rhodoblastus属于α-Proteobacteria，Alicycliphilus、从毛单孢菌属Comamonas、嗜异性嗜血杆菌Xenophilus为β-Proteobacteria的伯克氏菌目Burkholderiales，动胶菌属Zoogloea为β-Proteobacteria的红环菌目Rhodocyclales.溶杆菌属Lysobacter属于γ-Proteobacteria的黄色单胞菌目Xanthomonadales.
Rhodoblastus为未加磁场活性污泥中的优势属，一定磁场的加入会抑制Rhodoblastus生长，导致其丰度降低，在7×10-2T时降到最低值0.12%，但是在高磁感应强度15×10-2T条件下迅速升高达到4.36%，为对照组的3.5倍，由此可知，高强度磁场可以促进活性污泥Rhodoblastus的生长. Alicycliphilus属于异养反硝化菌[28]，为0、7×10-2T、9×10-2T磁感应强度下活性污泥中的优势属，且在7×10-2T时丰度最高，为未加磁场的1.34倍，其它磁感应强度下活性污泥中Alicycliphilus含量均低于对照组，由此可知，除7×10-2T以外的磁场都会抑制活性污泥Alicycliphilus的生长. Comamonas属于反硝化细菌，同时也有去除水中COD的能力，它是除12×10-2T外其它6个污泥样品的优势属(含量>1%). Comamonas丰度在3×10-2T时较对照组出现轻微的下降趋势，随外加磁感应强度升高至5×10-2T后又出现下降，在中等强度(5~10×10-2T)磁场条件下丰度最高，可知中等磁感应强度会促进Comamonas的生长. Xenophilus为除15×10-2T外6种不同磁感应强度活性污泥的共有优势属，在7×10-2T时丰度最高(7.03%)，为未加磁场的5倍，15×10-2T磁感应强度对Xenophilus的抑制作用明显，含量降为0.83%. Zoogloea中的部分菌种含有的菌胶团能够促进活性污泥絮凝作用，7组污泥样品中，7×10-2T时Zoogloea丰度最高(2.73%)为对照组(0.64%)的4倍，而在15×10-2T最高磁感应强度下动胶菌属丰度最低(0.44%).结合实验观察结果分析可知，适宜的磁感应强度[(5~7)×10-2T]能够有效促进活性污泥的絮凝沉降性能. Lysobacter丰度在9×10-2T时最高(5.76%)，其它磁场条件下丰度均低于对照组(5.45%)，有研究表明其能高效防治线虫引起的病害[29].
Geothrix属于Acidobacteria中的全噬菌纲，其在3×10-2T和7×10-2T磁感应强度条件下含量均小于1%，而在5×10-2T和15×10-2T下对其生长促进效果明显，在活性污泥中的含量分别为对照组的1.45倍和1.77倍.产丙酸单孢菌属Propionicimonas属于Actinobacteria中放线菌纲的放线菌目，类诺卡式菌科，具有除磷作用[30].除5×10-2T下活性污泥外，Propionicimonas是其它6种活性污泥的共有优势属，且在7×10-2T时丰度最高(26.42%)，是对照组(6.92%)的3.8倍.
在除优势属外的其它属中，不动杆菌属Acinetobacter属于聚磷菌(polyphosphate accumulating organisms，PAOs)，其在中等磁感应强度5~9×10-2T下活性污泥中含量最高(0.05%~0.09%).假单胞菌属Pseudomonas也属于PAOs且分解蛋白质和酯酶能力很强，是自然界中碳、氮循环的重要一环[31]，其在中等磁感应强度下含量最高(0.01%).四球虫属Tetrasphaera为除磷菌[32]，其在低磁感应强度条件下含量(0.29%~0.61%)高于对照组(0.21%)，其它磁场条件下含量均较低(＜0.1%).食酸菌属Acidovorax、Dechloromonas、陶厄氏菌属Thauera均为反硝化菌[33]，在外加磁场条件下变化趋势相同，即在7×10-2T磁感应强度活性污泥中含量均为最高(0.04%、0.99%、0.06%)，为对照组的2倍以上.副球菌属Paracoccus、红杆菌属Rhodobacter、生丝微菌属Hyphomicrobium也能够参与反硝化作用[34]，检测到的含量较低(0.01%~0.03%)，变化不明显.
由以上分析可知，活性污泥细菌群落各分类水平的丰度在不同磁感应强度作用下会发生一定程度的变化，最终出现与对照组存在明显差异的菌群结构.整体上看，活性污泥中重要的脱氮细菌，如变形菌门中α-Proteobacteria的红芽生菌属Rhodoblastus、副球菌属Paracoccus，β-Proteobacteria的Alicycliphilus、丛毛单胞菌属Comamonas、嗜异性嗜血杆菌Xenophilus、食酸菌属Acidovorax、Dechloromonas、陶厄氏菌属Thauera，δ-Proteobacteria的脱硫弧菌属Desulfovibrio，浮霉菌门Planctomycetes等，在中等磁感应强度尤其是7×10-2T时，丰度最高. 7×10-2T时活性污泥中脱氮细菌含量与其它磁场条件下含量存在显著差异(P＜0.05) 且丰度最高(图 8).在各反应系统出水水质中，7×10-2T时脱氮效果最明显，此时脱氮率从无磁场的65.69%提高到85.98%，影响显著.不动杆菌属Acinetobacter、假单胞菌属Pseudomonas、产丙酸单孢菌属Propionicimonas等典型的PAOs，丰度随外加磁场不同会有轻微的变化，且在中等磁感应强度条件下含量较高，该强度下反应系统中，COD、总磷去除率也有轻微提高(6.29%、4.61%).由此可知，活性污泥中细菌群落的结构变化与污水处理效率存在一定相关性，外加磁场通过改变微生物群落结构影响污水处理效果.
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图 8 不同外加磁感应强度下脱氮菌含量变化 Fig. 8 Changes in the denitrifying bacteria content under different external magnetic induction |
图 9为结合聚类分析的属水平(丰度前50) 群落组成热图，红色代表在对应样本中丰度较高的属，绿色代表丰度较低的属.样本先按照彼此之间属水平物种丰度分布的相似度进行聚类，根据聚类结果横向依次排列，结果说明在丰度前50的属水平物种聚类中A和E组即9×10-2T与未加磁场下微生物最相似. 图 10为活性污泥微生物群落主成分分析，不同的点代表不同样本，两点之间距离越近表明两个样本之间的微生物群落结构相似度越高，差异越小.主成分1(PC1) 与主成分2(PC2) 是造成7组样品的两个最大差异特征，其贡献率分别为49.25%和30.44%.由图 10分析可知，7×10-2T和12×10-2T与其它各组差异最显著，15×10-2T与对照组差别最小，即7×10-2T和12×10-2T磁感应强度下，活性污泥微生物群落结构变化最显著.
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图 9 结合聚类分析的属水平群落组成热图 Fig. 9 Heat-map of the classified genus |
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图 10 活性污泥微生物群落主成分分析 Fig. 10 Principal components analysis on activated sludge microbial communities in a SBR system |
(1) 磁场的加入都会在一定程度上提高SBR系统的运行性能，且当磁感应强度为7×10-2T时系统运行性能提高效果最明显，COD、氨氮、总氮、总磷去除率相比于未加磁场提高量分别为6.29%、8.89%、20.29%、4.61%，其对总氮去除效果影响最显著.通过对污泥脱氢酶活性的研究发现，中高强度磁场会促进污泥脱氢酶活性提高，因而会对各种污染物的去除产生积极作用.
(2) 在7×10-2T磁感应强度作用下活性污泥微生物群落丰度及多样性最高，相较于未加磁场变化最明显.微生物多样性与污染物去除率变化趋势一致，即微生物群落多样性最高时去除效果最好，说明污染物去除率与活性污泥中微生物群落多样性具有一定的相关性.
(3) 运用高通量测序技术，鉴定出的不同磁感应强度下活性污泥中细菌主要以Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Acidobacteria为主.重要的脱氮细菌、典型的PAOs等，丰度随外加磁场变化而不同，且在中等磁场条件下含量最高，其中7×10-2T时脱氮细菌含量变化最明显.活性污泥中细菌群落结构变化与污水处理效率存在一定相关性，外加磁场通过改变微生物群落结构影响污水处理效果.实际应用中可根据所要处理的水质状况选择合适的磁感应强度，找到利于污水处理的最佳菌群结构，提高污水处理效果.
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