2017, Vol. 38
富营养化水体中过多的氮素对水体生态系统产生诸多危害, 在各种形态的氮之中, 氨氮对水中的生物毒害相对较大[1].水生植物吸收大量营养元素, 去除水体中多余的氮和磷, 因此用于富营养化水体的修复上[2~4].水生植物对氮元素去除的影响因素包括颗粒沉降过程、微生物硝化作用和反硝化作用以及物理化学反应[5].然而, 最近研究表明在水生植物修复水体系统中, 氮转化微生物起着重要的作用.事实上, 虽然水生植物吸收是氮去除的主要途径[6], 但通过微生物硝化作用和反硝化作用所去除的氮素总量可能高于水生植物本身吸收去除的氮素总量[7~9].
凤眼莲(Eichhornia crassipes)对水体中铵态氮和硝态氮均有较强的去除能力[10~12], 并大规模地应用于生态系统修复中[12, 13].并且凤眼莲能够通过直接和间接的影响提高微生物对氮的去除作用.例如, 凤眼莲能够为微生物的附着提供良好的环境[14], 并且能够通过根系分泌物为微生物的代谢提供氧气和有机化合物[15].此外, 凤眼莲发达的叶片对水面的覆盖度较高, 导致对水体中光线的遮挡, 进而对微生物产生影响[16, 17], 改变浮游植物微生物群落结构从自养型到混合营养型和异养型[18].调节硝化和反硝化作用的重要因素中相关细菌群落的结构和丰度最为重要[19].鉴于凤眼莲在调节微生物硝化和反硝化作用中的复杂作用[20~22], 凤眼莲对氮的去除机制以及相关微生物群落活性研究涉及较少.但是, 凤眼莲对硝化细菌和反硝化细菌多样性及丰度的影响是修复富营养化水体的关键[16, 17].
定量聚合酶链式反应(qPCRs)和末段限制性片段长度多样性(T-RFLPs)被用于评估水生生态系统中的硝化细菌[氨氧化古菌(AOA)-amoA、氨氧化细菌(AOB)-amoA][23].但基于DNA的功能基因分析并不能代表基因表达和基因活性[24].因此, 本研究为了评估凤眼莲根系及分根系对氨氧化和反硝化微生物的影响, 比较水生植物和微生物对氮元素的去除能力, 在实验室建立凤眼莲存在的模拟富营养化水体环境, 考察：① 氮素循环的微生物的变化; ② 基于DNA和RNA的细菌群落结构变化; ③ 参与氮素转化的相关基因丰度变化(amoA、nirS/K).
1 材料与方法 1.1 体系构建凤眼莲幼苗和水样均采自太湖(N 30°55′40″~31°32′58″, E119°52′32″~120°36′10″), 实验之前, 对凤眼莲在实验室进行预培养. 7 d后称取自然淋干水后大小基本一致的新鲜凤眼莲植株.植株平均株高(28.7±2) cm, 平均根长为(30.2±3) cm, 平均湿重为80~90 g.投放于装有360 L上述湖水的实验装置中(长0.6 m×宽0.6 m×高1.2 m).设置3组处理：① 凤眼莲存在的水体处理T1：该处理中凤眼莲盖度为95%, 模拟凤眼莲在水体中大面积定植; ② 水面遮光处理T2：将95%的水面进行遮光处理, 模拟凤眼莲叶面对水体光线的遮挡, 同时, 在与T1根际深度相同的位置放置长约30 cm的若干弹性立体填料和软性填料, 模拟凤眼莲根系; ③ 未遮光处理T3：在与T1和T2相同的位置放置与凤眼莲根系等长的若干弹性立体填料和软性填料, 无凤眼莲, 无遮光.实验在恒温室进行, 温度设定为25℃, 光照强度为250 μmol·(m2·s)-1，光照/黑暗周期为12 h/12 h.实验于第0 d开始取样并进行不同处理, 每次采样时间均为09:00左右.在第0、1、4、7、10、15、21、28、42、49、70 d采集样品用于分析理化指标、功能基因丰度和微生物群落结构.
1.2 理化指标的测定总氮(TN)、氨氮(NH4+-N)、硝态氮(NO3--N)、亚硝态氮(NO2--N)的测定均采用文献[25]中的方法.
1.3 DNA、RNA的提取水样经0.22 μm滤膜过滤后, 总DNA按照Kurmayer等[26]的方法进行提取.提取RNA的样品经0.22 μm滤膜过滤后立即放到液氮中冷冻, 使用RNAiso kit (Takara)进行提取.使用RNeasy mini kit试剂盒对RNA进行纯化.使用PrimeScript® RT Master Mix (Takara)进行反转录. cDNA存放在-80℃冰箱中以备使用.
1.4 定量PCR定量PCR采用20 μL反应体系[10 μL SYBR®Premix Ex TaqTM (Takara), 100 nmol·L-1引物, 和1.5 μL模板DNA].细菌和古菌的amoA基因分别采用amoA1F/amoA2R-TC[27]和Arch-amoAF/Arch-amoAR[28], 扩增条件为：94℃, 2 min后进行40个循环扩增(94℃, 20 s; 57℃ (AOB), 30 s或者55℃ (AOA), 30s, 72℃, 30 s).反硝化基因nirK和nirS分别用引物为1F/5R[29]和cd3af/r3cd[30]. nirK扩增条件为：94℃, 2 min后进行40个循环扩增(94℃, 15 s; 60℃, 60 s), nirS扩增条件为：94℃, 2 min后40个循环(94℃, 30 s; 57℃, 45 s; 72℃, 45 s). PCR产物在65℃至99℃进行熔解曲线中的荧光测定, 数据用Rotor-Gene 6000(version 1.7) 进行分析.标准曲线的制备参照Chen等的方法[31].本试验AOB amoA扩增效率为91%~101% (R2为0.995~0.999); AOA amoA扩增效率为103%~109% (R2为0.994~0.999); nirK扩增效率为101%~109% (R2为0.992~0.995); nirS扩增效率为103%~108% (R2为0.993~0.999).
1.5 T-RFLP分析DNA和反转录所得cDNA进行16S rDNA和amoA片段的PCR扩增, 所用引物分别为27F/1492R和amoA1F/amoA2R-TC.在正向引物的5′端标记荧光物质(CY-5).每个样品做三管重复, 然后将PCR产物合并, 经纯化后分别使用HaeⅢ、TaqⅠ两种限制性内切酶进行消化37℃, 4 h.使用Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analysis System进行T-RFLP分析.取荧光强度100 cd为检测限, 并用CEQ 8000 Genetic Analysis Software 9.0计算大于检测限的峰高、峰面积以及出峰处末端限制性片段(T-RF)的长度, 若相邻两个峰相差在1 cd·m-2之内, 将其合并为一个峰.
1.6 统计分析水体理化指标和定量PCR数据用SPSS 13.0软件进行One-Way ANOVA(先采用Z score将数据标准化, 去除偏差较大值).平均数的比较采用Fisher's LSD检测.
2 结果与分析 2.1 理化指标的变化在实验的开始和结束时检测总氮含量, 以表明凤眼莲和相关微生物在氮素去除过程中的作用.上部区域(U; 根际T1或模拟根际T2) 总氮去除率T2U明显高于包含凤眼莲的T1U(P＜0.05), 同时T1U和T3U没有显著区别.然而, 在T1中, 由于凤眼莲的存在导致总氮去除率达到75.58%.在实验结束时, 上部区域的NH4+-N去除率高于底部(B)区域, 但在3个处理组之间没有显著差异.唯一的例外是实验组2B, 其中NH4+-N去除率(85.86%)显著低于其他两个处理组(分别为95.71%和93.24%).对于NO3--N, 3U的去除率(91.48%)明显高于T1U(77.29%)和T2U(76.38%).
氮元素随时间的变化曲线如图 1所示.总体而言, 所有处理中TN浓度均逐渐降低(图 1).在前7 d, 1U中的TN水平从8.52 mg·L-1降至4.56 mg·L-1, 对应的去除率为46.40%.在前15 d, T1U和T1B)的TN低于T2和T3(P＜0.05).然而, 在第15 d和第21 d之间, T1U的TN去除率下降到0.02%, 而在T2U和T3U中, TN去除率分别增加到46.24%和46.05%.从第48 d直到实验结束(第70 d), T2U和T3U中的TN浓度＜0.8 mg·L-1, 而在1U中, TN浓度较高, 在第70 d测量的浓度为1.05 mg·L-1.
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U和B分别表示每个实验的上部和底部区域，下同 图 1 T1、T2和T3处理组培养期间TN、NH4+-N、NO2--N和NO3--N的变化曲线 Fig. 1 Variation in profiles of TN, NH4+-N, NO2--N, and NO3--N during cultivation in T1, T2, and T3 microcosms |
在实验第1 d, 仅1U[图 1(b)]中NH4+-N的浓度减少(6.46~2.62 mg·L-1), 而NO2--N和NO3--N[图 1(c)和1(d)]没有相应增长, 表明在实验前24 h内没有发生明显的硝化作用.在第4~7 d, 所有处理中均出现NH4+-N减少, NO2--N和NO3--N增加的情况, 证明氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌(NOB)利用了水中的溶解氧(图 1).在最初7 d内, 1U的NH4+-N去除率最高, 即凤眼莲的根际(从第0 d的6.46 mg·L-1到第7 d的1.57 mg·L-1, 75.70%), 其次是T3U(49.30%), T1B(34.30%)和T2U(22.90%).在第10 d, T1U和T3U中的NH4+-N浓度分别降低至0.12 mg·L-1和0.18 mg·L-1, 之后保持恒定.相比之下, 在T2U中, NH4+-N水平降低至0.33 mg·L-1需要28 d.在第2 d和第28 d之间的NO2--N水平在T3U中最高, 从第7 d起, 在T2B中最低[图 1(c)].与NO2--N相似, NO3--N浓度在第2 d和第28 d之间在T3U中最高, 随后为T1U[图 1(d)].到实验结束时, 在每个处理的上部区域中的NO2--N和NO3--N浓度高于在底部区域中的NO2--N和NO3--N浓度.
2.2 氨氧化和亚硝酸还原酶的基因丰度逆转录-qPCR显示AOA-amoA和AOB-amoA的丰度在T1中高于其他处理组(图 2).此外, 在T1中, AOB-amoA的丰度显著增加, 在42 d的时间(从第0 d的9.7×105 copies·L-1)增加了10~160倍.明显高于T2U和T3U中的0.25~6.35倍和0.4~4.13倍.相比之下, 在所有处理组中AOA-amoA的相对丰度几乎没有增加; 事实上, 除了T1U, 15 d后所有位点的该基因的拷贝数都减少了.
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中文(a)实验体系上部AOA-amoA基因; (b)实验体系上部AOB-amoA基因; (c)实验体系底部AOA-amoA基因; (d)实验体系底部AOB-amoA基因注解 图 2 实验体系上部和底部的AOA-amoA和AOB-amoA基因增加倍数 Fig. 2 Fold increase in AOA-amoA and AOB-amoA genes in the upper zone and the bottom zone, respectively |
与amoA不同, T2和T3中的nirK和nirS丰度的增加均高于T1(图 3).这个现象表明凤眼莲抑制携带这些基因的细菌的增殖.此外, 在所有3种处理中它们的拷贝数和增长率在底部区域比上部区域高.对于nirS基因, 在所有处理组和时间点从3.56×105 copies·L-1变化到1.67×106 copies·L-1, 与nirK的拷贝数相比均表现出10~100倍的差异.
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(a)实验体系上部nirK基因、(b)实验体系上部nirS基因; (c)实验体系底部nirK基因; (d)实验体系底部nirS基因 图 3 实验体系上部和底部的nirK和nirS基因增加倍数 Fig. 3 Fold increase in the nirK and nirS genes in the upper zone and the bottom zone, respectively |
AOB-amoA基因的T-RFLP分析显示不论在DNA还是RNA水平上, 亚硝化单胞菌都是优势种群.对于每个样品, 在DNA和RNA水平上AOB-amoA的主要T-RF均不相同.代表亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)的T-RF 219, 在所有样品(图 4)的DNA和RNA中占优势, 然后是代表亚硝化单胞菌属的T-RF 80, 但仅在样品的RNA部分.代表Nitrosomonas oligotropha的T-RF 354在许多DNA样品中占优势, 但在任何相应RNA中未检测到.因此, 凤眼莲的存在似乎刺激了由T-RF 219表示的AOB-amoA的丰度, 特别是在RNA水平.
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0D、1D、10D、70D分别表示第0、1、10、70 d的样品; 1U, 2U, 3U分别表示凤眼莲的根际区、遮光处理的模拟根际区和不遮光处理的模拟根际区, 下同 图 4 各处理AOB-amoA的DNA和RNA T-RFLP分析中各类T-RFs所占百分比 Fig. 4 Relative abundances of the major T-RFs of AOB-amoA targeted DNA and RNA in the three microcosms during the 70-day cultivation |
使用T-RFLP和计算机分析细菌16S rDNA和16S rRNA(图 5), 在本实验中检测到的T-RF可以分为α-变形菌(α-Proteobacteria)、β-变形菌(β-Proteobacteria)、γ-变形菌(γ-Proteobacteria)、δ-变形菌(δ-Proteobacteria)、拟杆菌(Bacteroidetes)、酸杆菌(Acidobacteria)、疣微菌(Verrucomicrobiae)、浮霉菌(Planctomycetacia)、厚壁菌(Firmicutes)、放线菌(Actinobacteria)和硝化螺菌(Nitrospira).在上层样品获得的DNA中, 放线菌、α-变形菌、β-葡萄球菌和γ-变形菌是优势的, 并且这些门的丰度在实验过程中保持相对稳定.在70d的培养期间, 所有未分类部分样品的T-RF在门级水平上增加, 特别是在没有凤眼莲的微生态系统中.例外是疣微菌纲, 其丰度在T2和T3下降. α-变形菌、β-变形菌和γ-变形菌在样品RNA部分仍是优势门.浮霉菌和酸杆菌的RNA丰度明显高于其DNA丰度, 特别是在有凤眼莲根际的组.硝化螺菌的DNA和RNA丰度在T1U中最高, 并且在整个实验的其他处理中仍然很高.
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(a)DNA和(b)RNA 图 5 各处理组16S rDNA和16S rRNA的T-RFLP分析中各类T-RFs所占百分比 Fig. 5 Relative abundances of the major T-RFs of 16S rDNA and 16S rRNA in the three microcosms during the 70-day cultivation |
种植凤眼莲处理根际区的氨氮去除率要明显高于其他处理组[图 1(b)].在研究初期24 h内, 种植凤眼莲实验组通过生物质吸收从而使氨氮去除率达到59.4%.这种去除氨氮的机制对于含有游离氨毒性效应的水生生态系统的修复具有重要意义[32, 33].此外, 结果表明凤眼莲根际能够提高AOB amoA基因丰度(高达160倍), 这种现象在未种植凤眼莲的实验组中没有出现(图 2). T1中前24 h, AOB amoA基因丰度的提高可能促进氨氮的快速去除.
凤眼莲根际分泌物中化感物质的释放可能促进了AOB amoA基因丰度的提高以及因此提高的硝化作用.先前有研究表明Littorella uniflora根际对amoA基因相对丰度有显著提高作用[34].种植植物的土壤和稻田中氨氧化菌活性也较强[31].氧气是氨氧化过程中的必要条件, 同时为AOA amoA基因和AOB amoA基因提供能量.这也解释了凤眼莲能够提高硝化作用、为好氧氨氧化菌提供能量物质.此外, 凤眼莲的有机根际分泌物包含生物碱和邻苯二甲酸酯衍生物[15].这些化感物质抑制藻类的生长[15], 而藻类同氨氧化菌之间可能存在着对铵态氮和氧气的竞争关系.在根际处由根和微生物的呼吸作用产生的二氧化碳水平的升高为化能自养型微生物提供碳源.
此外, 还研究了光照作用对硝化细菌群落结构和活性的影响.先前研究表明, 光照强度在300 μmol·(m2·s)-1时几乎完全抑制硝化作用[35], 在75 μmol·(m2·s)-1时, AOB和NOB的生长也受到抑制[36].光照可能对氨氧化微生物产生抑制作用[16, 17], 因此有利于硝化作用的产生.然而, T2U(水面覆盖率95%)中amoA的丰度和T3U相比相差不大, 表明在本研究系统中, 凤眼莲对水体中氨氧化菌丰度的影响并非通过改变水体中光强来实现的.
3.2 凤眼莲对总氮去除率的影响在水生生态系统中, 根际相关的氮素循环和去除是一个核心过程[37].根际区反硝化率较高[38, 39], 在一定程度上能够反映大型水生植物对反硝化微生物的直接作用[40, 41].本研究中, 3个实验组得到的总氮去除率相差不大(表 1和图 1).事实上, 未种植凤眼莲实验组T2U的总氮去除率高于种植凤眼莲实验组T1U.
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表 1 各处理组的氮去除率1)/% Table 1 Nitrogen removal/% |
Yi等[42]发现氮元素的损失在只有凤眼莲根部(除去大部分茎和叶)水样中要比包含整个凤眼莲植物水样中的多.在本研究体系中, 水体中总氮去除的主要途径可能是脱氮微生物的反硝化作用, 而不是主要由于凤眼莲的存在.不同水域的凤眼莲根系微生物组成可能有所不同.
微生态系统中总氮去除率与nir基因丰度有关, 特别是nirS(P＜0.05);因此nir基因丰度能够作为评价系统中脱氮能力的参数.在T1U中, nirS/K基因丰度显著降低(图 3)表明了凤眼莲的存在抑制nirK/S包括反硝化微生物活性.这种抑制作用能够促进氧气传递到凤眼莲根部[43, 44], 导致不利于反硝化微生物生存的好氧环境[45].相比之下, 在本研究中使用的非生物弹性填料, 包括凤眼莲根部(去除大部分的茎和叶)为反硝化微生物提供一个低氧环境. T1B中nirK/S较高丰度进一步证实凤眼莲的根部抑制反硝化微生物活性, 水体中存在反硝化作用.此外, 相对于T1实验组, T2和T3中较高的反硝化速率可能是由于弹性填料在水体中比凤眼莲的根部能够提供更大的表面积.较大的表面积能够加速硝酸盐在水体中与微生物的接触, 为细菌的定殖提供更大的表面, T2和T3中细菌反硝化作用的基因丰度要比T1中的高.
3.3 凤眼莲对水体中细菌群落结构的影响对水体中细菌16S rDNA和16S rRNA的T-RFLP分析可知, 环境中DNA丰度占优势的微生物种群未必是代谢活跃的种群.例如, 酸杆菌门(Acidobacteria)的片段在RNA分析中相对丰度较高, 但是在DNA的分析中则非常低.表明酸杆菌门的细菌活性普遍较高, 但在本研究的生境中存在的相对丰度则较低.种植凤眼莲处理(T1) 根际水体第70d时Nitrospira 16S rRNA相对丰度和16S rDNA相对丰度较其他各水体高, 表明凤眼莲长期存在有助于水体中Nitrospira的活性表达和代谢水平的提高.凤眼莲对水体中的氨氧化作用有促进作用, 为硝化作用提供更多底物, 因而对执行硝化功能的Nitrospira的活性表达和代谢均有促进作用.
在先前的研究中, 研究者们普遍用氨氧化菌的amoA基因拷贝数作为微生物群落大小和活性的表征[4].然而, 随着对微生物的代谢情况和功能活性的比较研究越来越深入, 研究者们逐渐发现某种功能基因的丰度与其表达活性并非完全一致.功能基因的存在或者高丰度并不意味着该基因功能的执行, 而可能仅仅在某种环境条件下表达[24].在本研究中, 对同一样品DNA水平和RNA水平的T-RFLP结果比较可知, 只有Nitrosomonas europaea在环境中的丰度和功能活性都较高(图 5), 且凤眼莲的存在对Nitrosomonas europaea amoA基因的数量和转录均有促进作用; 而Nitrosomonas communis和Nitrosomonas oligotropha虽然在环境中丰度较高, 但其氨氧化活性并不强.这些均证明了氨氧化细菌的数量和功能之间并不一定存在对等关系, 即在环境中amoA基因数量占优势的AOB并不一定有较高的氨氧化活性, 反之亦然.
4 结论凤眼莲对富营养化湖泊水体中总氮去除率的影响不大, 硝化作用和反硝化作用的微生物对总氮的去除起到较大的影响.本研究的实验系统中, 凤眼莲阻碍反硝化作用.但是通过AOB相对丰度和活性的增加, 凤眼莲促进了氨氮和总氮的去除率, 为水生植物修复生态系统奠定良好基础
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