2017, Vol. 38
砷(As)和锑(Sb)在元素周期表中同属于第五主族, 分属于第四和第五周期, 具有相似的化学性质、毒理学性质以及地球化学行为, 同时具有金属性和非金属性[1], 分别被美国环保署和欧盟列为优先控制污染物[2].微生物在As的生物地球化学循环过程中起着至关重要的作用, 它们可以直接或者间接调控As的赋存形态及价态, 进而影响其迁移转化[3, 4].微生物砷还原包括两种机制：一种是arsC基因作用下的砷解毒机制, 相应的微生物被称为好氧砷还原菌; 另一种是arrA基因作用下的砷呼吸机制, 相应的微生物被称为厌氧砷还原菌[5].
微生物在锑的地球物质循环中也起着重要的作用, 自然界中的一些微生物、原生动物、藻类以及植物能够在高锑浓度下生长, 甚至可以利用这种元素作为能源物质[6, 7].微生物对Sb具有外排、氧化、代谢以及甲基化作用[8~10].然而, 人们对微生物还原Sb的机制还不够了解, 尤其是微生物还原Sb的分子机制仍然未知[11], 目前为止, 只在菌株Lershamania内鉴别到一种Sb还原蛋白LmACR2[12].携带arsC基因的微生物对Sb的迁移转化作用的研究很少, 有研究表明, arsC可能具有抵抗Sb(Ⅲ)的功能, 但是arsC基因是否参与细胞内Sb的还原目前还尚不清楚[11].
非活性细胞表面不受土壤中有毒物质的限制, 不要求营养物质, 具有吸附速度快、可逆的特点, 而活细胞包含了表面吸附和主动运输两个阶段, 具有吸附速度较慢且不可逆的特点[13, 14], 因此, 微生物的生理状态直接影响了其对金属物质的氧化还原过程[15].目前对微生物作用下的As、Sb同时迁移转化的过程鲜有报道[16, 17], 因此, 本文以实验室分离的菌株IMH作为研究对象, 探究了IMH在不同生理状态下对砷、锑共存土壤中As、Sb迁移转化的过程, 以期为土壤中As、Sb迁移转化提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 实验药品蛋白胨、酵母、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、戊二醛、锇酸、乙醇、乙酸异戊酯, 均由国药集团化学试剂(北京)有限公司生产, 纯度为分析纯.
1.2 实验样品本研究的土壤样品采自于湖南省冷水江市(27°42′N; 111°25′E)和湖南省常德市石门县(29°58′N; 111°38′E), 用土壤采集器收集深度为0~20 cm处的土壤, 然后各自放入灭菌的自封袋中, 4℃保存备用.将采回的土壤样品在室内风干, 并挑出动植物残体和石块等, 用玛瑙研钵磨细过80目的筛子, 将两地的土壤混合以备用, 混合后土壤样品的pH为7.98.为了确定土壤样品中各个金属的含量, 样品冷冻干燥后, 进行了微波消解(MARS, 美国CEM公司).
本研究选用的菌种为本实验室分离的菌株IMH, 能在好氧的条件下有效地将As(Ⅴ)还原为As(Ⅲ)[18], 对其全基因组测序后, 分析发现IMH含有arsoperon(arsHCBR), 是一株典型的arsC介导的砷还原菌, 并具有较强抗砷能力, 对As(Ⅴ)的抵抗力高达150 mmol·L-1, As(Ⅲ)的抵抗力达20 mmol·L-1[19].
1.3 培养基及菌体的制备菌株生长培养基为LB(Luria-Bertani)培养基(1 L液体培养基中含有10 g蛋白胨, 5 g酵母, 10 g氯化钠, pH 7.5), 固体生长培养基为液体LB培养基中加入1.5%的琼脂制备而成.
将菌株IMH接种到LB培养基中, 在160 r·min-1、30℃摇床中振荡培养至对数稳定期, 用0.9%的氯化钠溶液清洗3次, 5 000 r·min-1(Eppendorf5424, Hamburg, Germany)离心3 min后, 其中一组菌体细胞进行120℃灭菌处理, 收集死菌体.另一组菌体细胞直接5 000 r·min-1离心3 min, 收集活菌体.
1.4 实验方法将2 g已灭过菌的土壤加入到40 mL无菌水中, 将上述收集的菌体分别接种到里面, 对照组不接入任何菌体, 所有处理包括对照组都进行3个重复, 160 r·min-1、30℃下培养48 h.在加入菌体0、6、12、21、25、36、48 h时采集混悬液测定液相中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Sb(Ⅴ)、Sb(Ⅲ), 并采用平板计数法计数溶液中的细菌数目.培养结束后, 将溶液离心, 倒掉上清液, 收集沉淀物, 部分用于扫描电子显微镜(SEM, Hitachi, 日本)观察和能谱分析(EDX), 另一部分沉淀物用冷冻干燥机(LGJ冷冻干燥机, 北京松源华兴科技发展有限公司)干燥后保存, 用于X射线衍射(XRD, 德国Bruker公司)分析.使用Nano Measurer 1.2对电镜图进行粒径分析.
1.5 样品的分析与测定将定期采集的混悬液用0.22 μm的滤膜过滤后, 采用高效液相色谱-原子荧光光谱仪(AFS-8130, 北京吉天仪器有限公司)测定溶液中的As、Sb形态和含量. HPLC-AFS对As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、Sb(Ⅴ)、Sb(Ⅲ)的检出限分别为0.7、1.7、1.2、0.6 μg·L-1.
1.6 实验表征 1.6.1 SEM表征采用戊二醛-锇酸双固定法, 首先将样品在2.5%戊二醛中固定4 h(或者过夜), 然后用0.1 mol·L-1磷酸缓冲液清洗3次, 每次15~30 min, 再用1%锇酸固定2~4 h, 最后用0.1 mol·L-1磷酸缓冲液清洗3次, 每次15 min.以上步骤固定完成后, 用不同浓度梯度的乙醇进行脱水处理(30%乙醇15~20 min; 50%乙醇15~20 min; 70%乙醇15~20 min; 80%乙醇15~20 min; 90%乙醇15~20 min; 95%乙醇15~20 min; 100%乙醇两次, 每次15~20 min)后, 用乙酸异戊酯置换2次, 每次15 min(或过夜).然后将样品临界点干燥后进行扫描电子显微镜观察. SEM表征使用Hitachi公司S-4800, 冷场发射枪, 加速电压：0.5~30 kV, 分辨率：1.5 nm (15 kV), 5 nm(1 kV), 能谱可鉴定的元素成分：Be-U, 分辨率：137 eV.
1.6.2 X射线衍射分析(XRD)固体样品XRD表征使用德国Bruker公司D8 Focus型多晶X射线衍射仪, 采用Cu靶陶瓷X光管.样品置于单晶硅片上铺平, 厚度约为0.5 mm, 扫描范围为2θ从10°~90°.数据分析使用MDI Jade 5软件, 利用粉末衍射联合会国际数据中心(JCPDS-ICDD)提供的各种物质标准粉末衍射资料(PDF)进行对照分析.
1.7 数据分析本研究数据分析采用软件SPSS Statistics(version 20.0, IBM)和OriginPro 8进行, 独立样品t检验用于判定处理与对照之间是否存在显著差异.当P＜0.05时, 认为是显著相关.
2 结果与讨论 2.1 土壤成分对土壤样品消解结果如表 1所示, 土壤样品中的砷主要以As(Ⅴ)存在, 锑主要以Sb(Ⅴ)存在, 其含量分别为0.6 mg·g-1、0.4 mg·g-1.我国的《土壤环境质量标准》中规定：农业用地中pH大于7.5时水田和菜地总砷含量为0.020 mg·g-1, 旱地总砷含量为0.025 mg·g-1, 总锑含量是0.010 mg·g-1.本实验用的土壤样品中砷含量是标准砷含量的40~50倍, 锑含量是标准锑含量的40倍, 表明该土壤样品已被严重污染.因此, 本文选择将其作为研究对象.
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表 1 土壤样品金属含量 Table 1 Metal content of the soil |
此外, 土壤中Fe和Al含量较高, 因为土壤中可能存在大量的铁铝氧化物, 包括晶质、非晶质的铁铝氧化物、氢氧化物和偏氢氧化物, 具有较高的零电荷点, 在环境介质中表面带正电荷, 而土壤中的As和Sb通常以中性分子或含氧阴离子的形态存在于土壤中, 推测原土壤中的As和Sb主要是吸附在铁氧化物和铝氧化物上[17].因此, 铁铝氧化物表面是吸附As、Sb在土壤中固定的重要作用机制之一[20].
进一步采用XRD的手段检测土壤中主要物质成分(图 1), XRD结果发现土壤中含有晶型结构较好的SiO2和CaCO3, 4个体系中并没有显著性差别, 说明IMH对土壤中的SiO2和CaCO3没有任何影响.然而, 原土壤中Fe和Al的含量较高(表 1), 远远超过了Si和Ca, 但是原土壤XRD图谱中未发现铝化合物和铁化合物的衍射峰, 说明绝大多数Fe和Al是以无定形化合物形式存在, 这可能是由于土壤中的微生物与铁、铝氧化物的黏附力远远强于对硅酸盐化合物的黏附力, 在微生物的作用下, 铁、铝氧化物形成了无定形铁、铝水合氧化物[21, 22].
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图 1 土壤样品的XRD谱图 Fig. 1 XRD spectra of soil samples |
为了进一步研究IMH对固相土壤的影响, 通过SEM及EDX(图 2)分析结果发现, 原土壤中主要的元素有C、O、K、Fe、Si、Al、Mg, 与表 1相符. Au是因为在做能谱图之前喷在土壤上面的一层薄薄的金膜导致的. EDX图上没有检测到土壤中的As、Sb、Mn、Ca, 可能As、Sb、Mn这3种元素的含量少, 超出了仪器的检测范围.与对照组相比, 加入IMH活菌体和死菌体的体系中, 土壤颗粒的粒径均变小了, 并且加入死菌样品的粒径小于加入活菌样品的粒径, 可能是菌体在迁徙转移的过程中对土壤具有分散和在土壤中矿物表面物理渗透的作用, 而在加入死细菌的体系中土壤的粒径更小, 可能菌体在经过高压灭菌后, 部分细胞破裂, 释放出的有机物与土壤中的As、Sb、Mn、Ca、Fe、Si、Al、Mg有高度的亲和力, 并形成螯合物等导致土壤的粒径减小[22].
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图中红色方框部分是做EDX的部分, (a)活菌体系土壤样品；(b)死菌体系土壤样品；(c)原土壤样品；(d)菌株IMH原始形貌图 图 2 菌株IMH处理下土壤样品及原始菌株的SEM图及EDX分析结果 Fig. 2 SEM images and EDX of the residue incubated with the strain IMH and the original IMH |
As的形态及浓度变化如图 3所示, 在加入活菌体的体系中, 用平板计数法计数细菌数目, 在21 h时细菌数目达到了最大值, 此时, As(Ⅲ)的量也达到了最大值即104.1 μg·L-1.然而, 21 h之后As(Ⅲ)逐渐减少, As(Ⅴ)相应增加[图 3(a)].有两种可能, 一是在菌体死亡后, 部分As(Ⅲ)在好氧条件下又氧化成As(Ⅴ); 二是土壤再次吸附As(Ⅲ), 导致As(Ⅲ)减少.但由于溶解态总砷含量并未变化[图 3(d)], 所以推测为部分As(Ⅲ)氧化为As(Ⅴ).然而, 死菌体系中总砷的释放量达到506.8 μg·L-1, 大概是活菌体系中释放量的3.3倍[图 3(d)].这可能是高温灭菌使得细菌裂解, 细菌裂解后的一些基团, 如多糖、蛋白质、磷酸根、羧基、巯基、胺基等官能团及胞内的化学基团, 具有阴离子的特性, 而土壤中的As(Ⅴ)是阳离子, 因而As(Ⅴ)与死细胞之间具有亲和力, 因此死细菌能将土壤中的As(Ⅴ)吸附, 而当吸附量达到饱和后, 会将As(Ⅴ)释放到溶液中, 从而使得死菌体系中As释放量远远超出活菌体系和对照组[23].
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(a)活菌体体系中As(Ⅴ)、As(Ⅲ)以及细菌数目随时间的变化; (b)死菌体体系中As(Ⅴ)、As(Ⅲ)随时间的变化; (c)对照组中As(Ⅴ)随时间的变化; (d)3个体系中总砷随时间的变化; (e)3个体系中砷释放的百分比随时间的变化; (f)3个体系中砷释放的速度随时间的变化 图 3 菌株IMH处理下土壤中As浓度及形态的变化 Fig. 3 Change in concentrations and forms of As as a function of incubation time in the soil residue mediated by IMH |
此外, 菌体引起的颗粒粒径的减小, 也可能是导致As大量释放的原因, 对照组中土壤的粒径最大, 活菌体系中粒径次之, 死菌体系中土壤的粒径最小(图 2).可能是菌体在迁徙转移的过程中对土壤具有分散和在土壤中矿物表面物理渗透的作用.菌体释放出的有机物与土壤中的砷有高度的亲和力, 与土壤中的砷形成螯合物, 并与土壤中的砷结合, 导致土壤释放出As[23].
在12 h之前, 死菌体系中As释放的速度远远大于活菌体系中As的释放速度, 随着时间的推移, 在12 h后活菌体系和死菌体系中As的释放速度差不多[图 3(f)].但是在死菌体系中几乎没有As(Ⅲ)的存在, 说明死菌体可以较强地促进砷的释放却不能改变砷的赋存形态.
2.3 锑的释放Sb形态含量变化如图 4所示, 在3个体系中均没有检测到Sb(Ⅲ), 说明菌株IMH不能还原Sb.之前有学者认为As和Sb的还原机制是类似的[24], 而本研究结果表明, 单纯的arsC所介导的砷解毒还原机制不能将Sb(Ⅴ)还原为Sb(Ⅲ). Sb的还原机制可能还需要其它基因的协同作用.
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(a)活菌体体系中Sb(Ⅴ)、Sb(Ⅲ)随时间的变化; (b)死菌体体系中Sb(Ⅴ)、Sb(Ⅲ)随时间的变化; (c)对照组中Sb(Ⅴ)随时间的变化; (d)3个体系中总Sb随时间的变化; (e)3个体系中Sb释放的百分比随时间的变化; (f)3个体系中Sb释放的速度随时间变化 图 4 菌株IMH处理下土壤中Sb浓度及形态的变化 Fig. 4 Change in concentrations and forms of Sb as a function of incubation time in the soil residue mediated by IMH |
与As释放结果相同, 死菌体系中锑的释放量大概是活菌体2.5倍.在3种体系中, Sb的释放速度逐渐减小, 直到12 h时速度达到最小, 12 h后, Sb的释放速度几乎保持不变[图 4(f)].在加入死菌的体系中, Sb的释放量很大, 是土壤中锑含量的4.1%, 在加入活菌的体系中, Sb的释放量占土壤中锑含量的1.8%.对照组中Sb的释放量最少.这个结果与总砷的释放趋势类似, 死菌体系中Sb的大量释放, 可能也是菌体官能团和载体粒径减小的共同作用, 使得吸附态的Sb脱附到溶液中.
同时, 菌体引起的颗粒粒径的减小, 也可能是导致Sb大量释放的原因, 对照组中土壤的粒径最大, 活菌体系中粒径次之, 死菌体系中土壤的粒径最小(图 2).可能是菌体在迁徙转移的过程中对土壤具有分散和在土壤中矿物表面物理渗透的作用.菌体释放出的有机物与土壤中的锑离子有高度的亲和力, 与Sb离子形成螯合物, 并与土壤中的Sb结合, 导致土壤释放出Sb.
2.4 As、Sb释放的关系为了验证As、Sb释放是否存在一定的相关性, 笔者对As、Sb释放量进行了相关性分析, 结果如图 5所示.笔者发现, 在3个体系中, As释放量与Sb释放量均有显著的线性关系, 这也证明了以前学者的研究结果, 这是因为As和Sb属于同一主族, 它们具有相似的化学性质, 在沉积物中As和Sb常常与铁的氧化物共存, 而有研究发现As的还原伴随着铁矿物的还原溶解[25~27].
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图 5 土壤中菌株IMH贡献的砷与锑释放量的相关关系 Fig. 5 Correlation analysis between total released As and Sb in residue mediated by IMH |
(1) 本文研究了土壤中As和Sb共存的情况下, 菌株IMH的死活菌体对砷、锑共存土壤中As、Sb迁移转化的影响.研究发现, IMH可以还原As(Ⅴ)但不能还原Sb(Ⅴ), As和Sb的还原机制不同, 同时发现As和Sb的释放显著相关, 因为在沉积物中As和Sb常常与铁的氧化物共存, 而As的释放伴随着铁矿物的溶解还原, 因此As和Sb的释放显著相关, 这也与之前学者的发现一致.
(2) 死菌体系中As和Sb的释放量远远大于活菌体系和非生物对照组, 因为细菌裂解后的一些基团, 如多糖、蛋白质、磷酸根、羧基、巯基、胺基等官能团及胞内的化学基团, 可以将土壤中的As和Sb萃取下来, 将As和Sb释放到溶液中, 从而使得死菌体系中As释放量远远超出活菌体系和对照组.
(3) 菌体引起的颗粒粒径的减小, 也是导致As和Sb大量释放的原因, 对照组中土壤的粒径最大, 活菌体系中粒径次之, 死菌体系中土壤的粒径最小, 因为菌体在迁徙转移的过程中对土壤具有分散土壤和在土壤中矿物表面物理渗透的作用.菌体释放出的有机物与土壤中的As和Sb有高度的亲和力, 与As和Sb形成螯合物, 并与土壤中的As和Sb结合, 导致土壤释放出As和Sb.
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