环境科学  2017, Vol. 38 Issue (9): 3816-3822   PDF    
引用本文
孟婷, 杨宏. 高效反硝化细菌的快速培养及群落结构多样性分析[J]. 环境科学, 2017, 38(9): 3816-3822.
MENG Ting, YANG Hong. Rapid Culture, Microbial Community Structure, and Diversity of High-Efficiency Denitrifying Bacteria[J]. Environmental Science, 2017, 38(9): 3816-3822.
高效反硝化细菌的快速培养及群落结构多样性分析
孟婷 , 杨宏     
北京工业大学建筑工程学院, 北京市水质科学与水环境恢复工程重点实验室, 北京 100124
收稿日期: 2017-01-18; 修订日期: 2017-03-25
作者简介: 孟婷(1992-), 女, 硕士研究生, 主要研究方向为微生物水处理技术, E-mail:mengting2@yeah.net
通信作者: 杨宏, E-mail:yhong@bjut.edu.cn
摘要: 培养高效的反硝化细菌可提高污水处理效率.本实验为序批式实验，以Ⅰ号、Ⅱ号发酵液为碳源，采用梯度提高硝氮的方式，培养高效的反硝化细菌，从中选择培养更加快速的发酵液.并采用高通量测序技术分析反硝化细菌的生物群落结构和多样性的变化.结果表明，Ⅱ号发酵液能够在第11 d便实现高效反硝化细菌[300 mg·（L·h）-1]的快速培养，比Ⅰ号发酵液提前了17 d，同时，高效反硝化细菌系统对氨氮和总磷有一定的去除效果，最大去除速率分别为34.43 mg·（L·h）-1和2.98 mg·（L·h）-1.高通量测序分析结果表明，污泥经过驯化培养，物种丰度和多样性降低，但发挥反硝化作用的优势菌群的类别和比例得到增大；细菌的组成及数量发生了较大的改变，最终发挥高效反硝化作用的核心菌属为Thauera和Pseudomonas.另外，反硝化聚磷菌科（Rhodocyclaceae和Pseudomonadaceae）和异养硝化菌属（Pseudomonas、Alcaligenes、Bacillus和Comamonas）的存在，验证了系统对氨氮和总磷的去除能力.
关键词: 快速培养      高效反硝化细菌      发酵液      生物群落结构      生物多样性     
Rapid Culture, Microbial Community Structure, and Diversity of High-Efficiency Denitrifying Bacteria
MENG Ting , YANG Hong     
Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environmental Recovery Engineering, College of Architectural Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China
Abstract: High-efficiency denitrifying bacteria can improve wastewater treatment efficiency. In order to rapidly culture high-efficiency denitrifying bacteria, batch trials were conducted at different carbon sources (No. 1 and No. 2 fermented liquid) and NO3--N concentration gradients (30 mg·L-1-150 mg·L-1-300 mg·L-1). The results showed that No. 2 fermented liquid could finish high-efficiency denitrifying bacteria[300 mg·(L·h)-1] cultivation in 11 d, which is 17 d before No.1 fermented liquid could. At the same time, high-efficiency denitrifying bacteria could effectively remove ammonia-nitrogen and total phosphorus, and maximum removal rates were 34.43 mg·(L·h)-1 and 2.98 mg·(L·h)-1, respectively. Furthermore, high-throughput sequencing was employed to characterize and compare the community structure and diversity. The species abundance and diversity were reduced but the category and proportion of denitrifying bacteria were increased. In addition, bacteria composition and quantity changed after cultivation and Thauera and Pseudomonas were the dominant contributors to the effective removal of nitrate in the SBR(sequencing batch reactor). Denitrifying phosphorus accumulating bacteria (Rhodocyclaceae and Pseudomonadaceae) and heterotrophic nitrifying bacteria (Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus, and Comamonas) proved the capacity of the system to remove ammonia-nitrogen and total phosphorus.
Key words: rapid culture      high-efficiency denitrifying bacteria      fermented liquid      microbial community structure      biological diversity     

目前, 随着排入污水厂的污水中污染物浓度的升高, 污水处理难度也越来越高[1].污水厂的反硝化处理能力虽然基本满足要求, 但处理效率仍存在着较大的提升空间, 而较低的处理效率无法从根本上达到节能降耗的目的, 造成较高的污水处理设施的运行成本[2].

现有的污水厂大多使用活性污泥法处理污水, 反应池中使用的活性污泥特异性差, 无法更好地发挥出单一类菌群的处理能力, 制约了污水处理能力的提升.由此, 驯化培养出高效的特定功能脱氮菌群(如：AOB、DNB、NOB等), 并将其定向投入到相应功能池中, 可大大提高污水处理能力.高效脱氮菌群的使用虽有节省外加碳源、简化工艺流程、减少投资运行费用等优势[3], 但高效脱氮菌群的培养仍然是一个亟待解决的问题.因此培养高效脱氮菌群成为研究的难点.

在反硝化过程中, 微生物在缺氧环境中利用有机碳作为电子供体, 将NO3--N转化为N2.以污泥发酵液为碳源培养反硝化细菌, 是近期的研究中反硝化效果相对较好的[4~6]; 另外, 污泥水解产酸过程中, 既能提供可作为碳源的挥发性脂肪酸(VFAs), 还能实现污泥的减量化, 解决污水处理厂存在的另一大难题, 有良好的发展前景[7].

微生物群落结构和组成随环境的不同而不同, 主要受到氮营养元素的影响, 特别是NO3--N含量是影响细菌类群的重要因素[8].如, 在北极水域中6个最大的河流中NO3--N含量也是调节细菌群落组成变化的关键因素[9].此外, 微生物群落结构和组成也受到其他因素的影响, 如Liao等[10]研究表明, 当处理含高亚硝酸盐水时, γ-Proteobacteria最大丰度可达84.39%; Yoshie等[11]研究表明, 在含盐污水的高效脱氮中γ-Proteobacteria具有重要作用; β-Proteobacteria是淡水细菌群落中一个典型的优势类群, 在河流和湖泊等水生态环境中起着非常重要的作用[9, 12~14].

本实验以污泥发酵液作为反硝化碳源, 采用梯度提高硝氮浓度的序批式实验, 验证两种不同制备方法制得的发酵液对快速培养高效反硝化细菌的影响; 另外, 采用高通量测序技术分析高效反硝化细菌的生物群落结构和多样性.培养高效的反硝化细菌, 可节省外加碳源、简化工艺流程、减少投资运行费用等; 观察微生物群落结构, 可直接了解到主要发挥高效反硝化作用的细菌菌群种类, 从而向污水厂投加该类高效菌群, 实现对含NO3--N废水的更好处理.

1 材料与方法 1.1 实验分组

实验所用碳源是利用污水厂浓缩池污泥制成的发酵液, 发酵液制作方法采用两种, 区别在于是否在发酵过程中调节pH, 如图 1所示, 得到Ⅰ号和Ⅱ号发酵液.依据细菌培养中加入的碳源的不同, 将实验分为两组, 见表 1.

图 1 污泥发酵液制备方法 Fig. 1 Methods of preparation of the fermented liquid

表 1 实验分组 Table 1 Experimental group list

1.2 实验方法 1.2.1 快速培养高效反硝化细菌

实验采用污水厂回流污泥为菌源, 利用2只1 L锥形瓶作为反应器, 实验用水采用人工配水, 即在自来水中加入一定量的硝酸钾, 以及在①、② 组中分别加入Ⅰ号发酵液、Ⅱ号发酵液, 水质特征为：COD/NO3--N=10, pH为7.3~7.5, t=29℃±1℃, 其中, 利用恒温培养箱控制反应温度, 调节培养箱中摇床振荡速度为60 r·min-1, 以确保物料均匀.

实验采用间歇式方法运行, 反应周期为1 h, 利用梯度提高NO3--N浓度的方式快速培养高效反硝化细菌, 即当前一个NO3--N浓度条件下的出水中NO3--N和NO2--N浓度均为零时, 立刻提高到下一个NO3--N浓度, 当反应器中细菌的反硝化速率达到300 mg·(L·h)-1时, 即可将其称为高效反硝化细菌. NO3--N质量浓度梯度为：30 mg·L-1 150 mg·L-1 300 mg·L-1.通过对比①、② 组的反硝化速率变化情况, 选择出较优的发酵液制备方法, 确定快速培养高效反硝化细菌的方法.

1.2.2 高通量测序技术分析生物群落结构和多样性的变化

本实验中样本MT1和MT2分别取自：培养前和培养后.利用土壤DNA快速提取试剂盒(Bio101, Vista, CA)从200~500 mg样本中提取DNA.采用NanoDrop 2000分光光度计测量DNA浓度.采用Sensoquest LabCycler PCR仪进行PCR扩增. 16S rRNA基因扩增采用引物340F-805R检测全部细菌.反应体系及升温程序见文献[15].

针对细菌16S rRNA的V4区扩增及测序的引物为F端：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctac acgacgctcttccgatct; R端：测序引物+barcode+测序引物：caagcagaagacggcatacgagatXXXXXXgtgactggagtt cagacgtgtgctcttccgatct.采用Illumina HiSeq 2500 PE250进行高通量测序.针对测序数据使用MEGAN软件进行环境微生物的16S分析, 将得到的序列按照一定的阈值进行归类, 得到多个序列聚类操作分类单元(OTUs), 根据OTUs结果进行多样性的计算分析, 最后对分析结果进行可视化, 使信息更容易解释.

1.3 分析方法

根据标准分析方法测定pH、NH4+-N、NO3--N、NO2--N、COD、总磷(TP)、VFAs、温度(t), 并且每个样品均一式三份. NH4+-N、NO3--N、NO2--N、COD和TP分别采用纳氏试剂分光光度法(HJ 535-2009)、紫外分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法(GB/T 13807-1992)、连华科技COD快速测定法和钼酸铵分光光度法测定, VFAs采用安捷伦6890n气相色谱仪测定(气相色谱测定法), pH采用上海三信PHS-3C型pH计测定, 温度使用温控器探头测定.

2 结果与讨论 2.1 高效反硝化细菌的快速培养 2.1.1 两种发酵液对高效反硝化细菌快速培养的影响

两种发酵液的成分含量, 如表 2所示. ①、② 组反应器中细菌的反硝化速率变化如图 2所示.在培养前期(进水NO3--N质量浓度为30 mg·L-1), ①、② 组反应器中细菌的反硝化效率均存在一个缓慢提升的过程, 特别是① 组, 如图 2(a)所示, 经过13 d后出水中的NO3--N和NO2--N质量浓度才均为零, 而在② 组中, 仅用6 d出水中的NO3--N和NO2--N质量浓度均已为零, 如图 2(b)所示.说明使用Ⅱ号发酵液可在前期培养过程中更加快速地提高反硝化速率.

表 2 两种发酵液的成分 Table 2 Constituents from two types of fermented liquid

图 2 进出水硝氮和亚硝氮的质量浓度以及反硝化速率曲线 Fig. 2 Denitrification rate and NO3--N and NO2--N concentrations of the influent and effluent

当进水NO3--N质量浓度提高到150 mg·L-1时, ①、② 组反应器中反硝化效率提升所需的时间与前一过程相比均有所减少, 特别是② 组反应器, ①、② 组的反硝化性能提升所耗时间分别为9 d和3 d, 达到了NO3--N浓度进一步提升的条件, 从中可以看出Ⅱ号发酵液快速培养高效反硝化细菌的优势更加明显.

最后, 当进水NO3--N质量浓度提高到300 mg·L-1后, ①、② 组反应器均能实现出水NO3--N和NO2--N质量浓度为零, 反硝化速率均达到300 mg·(L·h)-1以上(发酵液中存在部分NO3--N和NO2--N), 即均可成功培养得到高效反硝化细菌; 但是, 在① 组反应器中培养高效反硝化细菌的全过程需要28 d, 如图 2(a)所示, 而② 组反应器仅需11 d, 较① 组提前了17 d.由上述分析明显可见, Ⅱ号发酵液可实现更加快速的培养高效反硝化细菌的目的.由于只有VFAs是易于反硝化细菌利用的碳源, 由此分析其原因可能为Ⅱ号发酵液中挥发性脂肪酸(VFAs)所占的比例(53.51%)高于Ⅰ号发酵液(46.03%), 如表 2所示, 也就是说, Ⅱ号发酵液中可供反硝化作用利用的有效碳源较多.

如图 3所示, 由于VFAs的溶出过程缓慢, 在发酵初期快速增大, 随后缓慢增大, 在第7 d达到最大, 而发酵后期由于微生物消耗和生成甲烷[16], 导致发酵后期VFAs逐渐下降.综合经济因素分析第3 d和第7 d的VFAs浓度, 以及考虑到实验中发酵液的及时供应问题, 最终本实验的发酵期定为3 d.

图 3 两种发酵液中VFAs随时间的变化曲线 Fig. 3 Change in VFAs in two types of fermented liquids with time

2.1.2 氨氮和总磷的去除效果

由于发酵液中含有NH4+-N和正磷酸盐(见表 2), 若将发酵液作为碳源加入到反硝化系统中, 会额外带入NH4+-N和TP, 因此, 在实际工程应用发酵液作为脱氮碳源时, 建议将氮磷进行预处理后使用, 在现有的研究中有成熟、简单的预处理方法[17~19].

值得注意的是, ② 组的实验培养的高效反硝化细菌体系对NH4+-N和TP均有一定的处理能力, 如图 4和图 5所示.随着NO3--N浓度梯度的提高, 发酵液投加量随之增大, 因而NH4+-N和TP浓度随之增加, 其中, NH4+-N质量浓度从13.5 mg·L-1左右上升到105 mg·L-1左右, TP质量浓度从3.4 mg·L-1左右上升到25.3 mg·L-1左右.与此同时, 培养的高效反硝化细菌对NH4+-N和TP的去除速率也随进水NH4+-N和TP质量浓度的增大而愈发明显, 分别从0.69 mg·(L·h)-1、1.04 mg·(L·h)-1上升到34.43 mg·(L·h)-1、2.98 mg·(L·h)-1, 推测水体中不仅存在大量的反硝化脱氮菌, 还存在部分异养硝化菌和反硝化聚磷菌, 研究表明一些异养硝化细菌同时也是好氧反硝化细菌[20].此外, NH4+-N的去除率随进水NH4+-N质量浓度的增大, 也从5.12%增长到32.56%, 一方面可能是环境适宜使得具有除NH4+-N功能的细菌得以生长繁殖, 另一方面可能是NH4+-N质量浓度越高, NH4+-N去除率越大[21]; 而TP的去除率随进水TP质量浓度的增大, 从30.73%下降到11.13%, 这是因为TP质量浓度的增大幅度远大于TP去除速率的增长幅度, 说明TP质量浓度的升高对具有除TP功能的细菌的除磷能力影响较小, 证明在实际培养除磷功能菌群实验中, 利用高磷浓度提高除磷速率是不太可行的.另外, 研究表明氨氮质量浓度对反硝化作用存在明显抑制作用[22, 23], 但本实验中并不存在明显的抑制现象, 说明培养的高效反硝化细菌对高氨氮质量浓度具有较高的耐受性.

图 4 氨氮去除效果曲线 Fig. 4 Effect on ammonia nitrogen removal rate

图 5 总磷去除效果曲线 Fig. 5 Effect on TP removal rate

2.2 微生物群落丰富度和多样性的影响

利用高通量测序研究不同条件下反硝化种群的变化, 结果表明(表 3), 有110 528条有效序列(MT1:55319, MT2: 55209), 以及被分为4420 OTUs(序列聚类操作分类单元).

表 3 样本多样性统计 Table 3 Diversity statistics for each sample at the confidence cutoff level of 0.8

每个样本的α多样性估计函数见表 3.所有样本覆盖值都超过99%, 表明测序深度已经基本覆盖到样本中所有的物种.原始污泥经过驯化后, OTUs从2672降低到1750.样本中原始污泥的OUT数量较大.原始污泥的Chao1(估计群落中含OTU数目的指数)和ACE指数(菌群丰富度指数, 用来估计群落中含有OTU数目的指数)较大, 表明原始污泥样本具有较大的丰富度.而且, Shannon多样性指数和Simpson多样性指数(反映样本中微生物多样性的指数)具有同样的变化趋势, 随着污泥驯化培养的进行, Shannon多样性指数和Simpson多样性指数分别从8.56、0.984降低到6.03、0.931, 表明原始污泥具有较大的细菌多样性.

2.3 细菌群落变化

相对丰度的改变表明了微生物种群的不同, 图 6中, 两个样本的有效序列被定义为4个不同的能级分布(门、纲、科和属).在门的分类水平上[图 6(a)], 原始污泥MT1的显著性类群是：Proteobacteria(63.26%)、Bacteroidetes(19.84%)和Actinobacteria(4.35%); MT2的显著性类群是：Proteobacteria(65.83%)、Bacteroidetes(19.51%), Firmicutes(13.04%), 由此可知, 经过污泥的驯化培养, Proteobacteria仍是优势菌门, 这与Liao等[10]的研究结果一致; Bacteroidetes仍是第二优势菌门, 这与Newton等[24]的研究结果一致; 但在利用发酵液培养高效反硝化细菌的过程中, 细菌的组成及数量都发生了改变.

图 6 MT1和MT2的微生物群落结构 Fig. 6 Microbial community structure of MT1 and MT2

如图 6(b)所示, 在纲的分类水平上, MT1的显著性类群是：γ-Proteobacteria(24.86%)、β-Proteobacteria(20.21%)和α-Proteobacteria(13.67%), 均从属于Proteobacteria; MT2的显著性类群是：β-Proteobacteria(33.28%)、γ-Proteobacteria(30.53%)、Bacteroidia(17.27%)和Clostridia(12.20%), 分别从属于Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes, 由此可知, 经过污泥的驯化培养, 优势菌群的类别得到了拓宽、所占比例得到提高(从58.74%~93.28%), 这在一定程度上保证了反硝化作用的高效性; 另外, β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria仍是最主要的显著性类群, 但β-Proteobacteria(33.28%)代替γ-Proteobacteria(30.53%)成为第一优势菌门, 这与孙[25]的研究结果一致; α-Proteobacteria丰度从13.67%减小到0.47%, 虽然α-Proteobacteria广泛分布于全球范围内的河流和湖泊中[8, 12, 24], 但是它们更偏好于盐水环境[26], 由此可知, 随着污泥的驯化培养, 反应体系中的生长环境逐渐趋于淡水环境.

如图 6(c)所示, 在科的分类水平上, MT2的显著性类群是：Rhodocyclaceae(31.04%)、Pseudomonadaceae(30.08%)、Porphyromonadaceae(13.48%)、Rikenellaceae(1.78%)和Draconibacteriaceae(1.43%). Rhodocyclaceae部分为反硝化聚磷功能菌群[27~29], Pseudomonadaceae亦有部分为已证明的反硝化聚磷菌群[30], 验证了系统中具有一定的除磷效果.

如图 6(d)所示, 在属的分类水平上, MT2的最显著性类群是：Thauera(30.89%)和Pseudomonas(30.08%), 同属于Proteobacteria, 只是处在不同的进化分支上.已知的Thauera细菌都是反硝化菌[31], Pseudomonas属是已被正式描述硝化细菌(包括异养、自养)的菌属的其中之一[21].值得一提的是, 数量较少的菌属[在图 6(d)的others中], 包括Alcaligenes(0.92%)和Bacillus(0.03%)也是已被正式描述为硝化细菌的菌属, 而Comamonas(0.30%)可能是新型的异养硝化菌[21], 验证了系统中具有一定的除氨氮效果.

3 结论

(1) 在Ⅱ号发酵液制备过程中, 每隔12 h将发酵液pH调节为10, 这区别于Ⅰ号发酵液的制备方法, 使得Ⅱ号发酵液中挥发性脂肪酸(VFAs)所占的比例(53.51%)高于Ⅰ号发酵液(46.03%), 因此利用Ⅱ号发酵液, 可实现更加快速培养高效反硝化细菌的目的, 培养时间仅需11 d, 反硝化速率即可达300mg·(L·h)-1以上.

(2) 经过污泥的驯化培养, Proteobacteria和Bacteroidetes仍是优势菌门, 但细菌的组成及数量都发生了改变, 其中, β-Proteobacteria代替γ-Proteobacteria成为第一优势变形菌门, 而γ-Proteobacteria的数量在MT2条件下仍占有较大比例; α-Proteobacteria不再是优势菌群, 取而代之的是Bacteroidia和Clostridia.

(3) 培养前, 优势菌群均从属于Proteobacteria; 培养后优势菌群分别从属于Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes, 优势菌群类别的拓宽、所占比例的提高, 在一定程度上保证了反硝化作用的高效性.

(4) 高效反硝化细菌对总磷存在一定的处理能力, 最高可达2.98 mg·(L·h)-1, 而反硝化聚磷菌Rhodocyclaceae和Pseudomonadaceae的存在, 验证了系统中的除磷效果.已被正式描述硝化细菌(包括异养、自养)的菌属：Pseudomonas、Alcaligenes和Bacillus的存在, 以及Comamonas(可能为新型的异养硝化菌属)的存在, 验证了系统中的除氨氮效果.

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