水平潜流人工湿地(horizontal subsurface flow constructed wetlands, HSSFCWs), 已被广泛用于工业、农业、生活污水以及城市地表径流的处理中^[1~3].前人利用数值模拟方法结合实验研究结果表明, 基质结构对人工湿地(constructed wetlands, CWs)水力性能及净化效率影响显著, 由上到下填料渗透系数逐渐增加的分层填充方式能有效避免短流及死区的发生, 提高系统水力效率, 从而提高净化效果^{[4, 5]}.值得注意的是, 基质结构的差异在提升系统性能的同时, 势必会引起床体中微生物种群及结构的差异, 而目前国内外对于这方面的研究还鲜有报道.鉴于此, 本课题组以连续运行的分层结构及单层结构人工湿地系统为研究对象, 研究不同基质结构人工湿地系统净化性能的差异及微生物群落结构分布差异, 并利用PCA分析其与床体微生物种群结构分布的相关性.

构建3个尺寸相同的人工湿地实验装置(CW1、CW3及CW6), 长、宽、高分别为2、1及0.6 m(图 1), 种植植物为美人蕉.床体分为3部分, 左右两端分别为0.2 m的布水区和集水区, 主体填料区长度为1.6 m, 填充不同粒径的石英砂.其中：① CW1为单层人工湿地, 由颗粒尺寸≤6 mm的混合石英砂组成, 其水力传导率K为65 m ·d^-1; ② CW3为3层结构的人工湿地, 每层厚度相等, 均为0.2 m, 石英砂粒径从表层到底层分别为≤0.6、0.4~0.6和1.0~3.0 mm, 相应的K值分别为26、36和64 m ·d^-1; ③ CW6为六层结构的人工湿地, 每层厚度为0.1 m, 从表面到底部, 石英砂粒径分别为≤0.6、0.4~0.6、0.6~0.9、0.9~2.0、2.0~4.0和4.0~6.0 mm, 对应的K值分别为26、36、43、55、75和176 m ·d^-1. 3个人工湿地在相同条件下运行处理校园生活污水, 水力停留时间(HRT)均为1.5 d, 进水中水质参数如表 1所示.

图 1

Fig. 1

图 1 人工湿地实验装置示意 Fig. 1 Constructed wetlands experimental setup

表 1 (Table 1)

表 1 3个人工湿地进水的物理参数 Table 1 Physicochemical parameters of the influent for three constructed wetlands 参数 水温 /℃ pH DO /mg·L-1 ORP /mV COD /mg·L-1 NH4+-N /mg·L-1 NO3--N /mg·L-1 TN /mg·L-1 最小值 16 7.0 0.1 -168 130 18 0.8 26 最大值 28 7.6 0.6 -144 183 28 1.2 41 平均值 21 7.3 0.3 -158 156 23 0.9 35

表 1 3个人工湿地进水的物理参数 Table 1 Physicochemical parameters of the influent for three constructed wetlands

实验装置建于2012年, 连续运行至今.本实验时间为2015年3~8月, 运行期间每周测定3个人工湿地进出水水质(国标法).于2015年7月分别从3个CWs距离进水口40 cm和160 cm处的A和B不同深度(10, 30和50 cm)采集填料样品(图 1), 每个采样点取3个样品, 除去样品中植物根或碎屑, 储存在聚乙烯袋中, 然后立即转移至实验室中进行后续分析.

采用Mo Bio公司的Power Soil DNA分离试剂盒提取18个样品中的DNA.采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的细菌总DNA.对16S rRNA基因的V3~V4高变区片段进行PCR扩增, 引物序列为515F (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和909R (CCCCGYCAATTCMTTTRAGT).扩增条件为：95℃预变性2 min, 接着进行25个循环, 包括95℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s; 循环结束后72℃最终延伸5 min.每个样本3个重复, 将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测, 全部样品使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物, Tris_HCl洗脱; 2%琼脂糖电泳检测.随后在生工生物工程(上海)股份有限公司的Illumina MiSeq平台上进行高通量测序分析, 得到原始图像数据文件经CASAVA碱基识别分析转化为原始测序序列, 结果以FASTQ文件格式储存.利用Mothur对原始序列进行校正, 去除序列中的嵌合体, 得到优化序列; 在97%的相似性水平上将序列划分可操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs); 采用RDP Classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OUT代表序列进行分类分析, 并在各个分类水平上统计每个样品的群落组成; 利用主成分分析(PCA)分析各床体微生物种群结构分布的相关性.

实验数据统计分析采用软件Excel 2010和SPSS 20.0进行水质分析和主成分分析.

CW1、CW3及CW6对COD、TN、NO₃^--N及NH₄⁺-N的去除效果如图 2所示, 从中可见, 3个系统对有机物、和含氮污染物都有明显的降解梯度.其中CW6去除效率最高, 其出水中以上4种污染物的平均浓度分别为39、11、0.35及4.0 mg ·L^-1, 相应的去除率为75%、67%、61%及83%.三者之中, CW1的去除性能最差, 4种污染物的平均去除率分别为39%、39%、34%及49%. CW3的净化性能介于二者之间, 4种污染物的平均去除率分别为60%、55%、50%、72%.

图 2

Fig. 2

图 2 3个人工湿地中COD、TN、NO3--N及NH4+-N进出水浓度分析 Fig. 2 Influent and effluent concentration analysis of COD, TN, NO3--N, and NH4+-N in three constructed wetlands

由此可见, CW3和CW6系统中从床体表层到底层渗透系数逐渐升高的分层结构可强化人工湿地对COD和含氮污染物的去除能力.其原因在于床体表层的填料渗透系数较小, 能够有效阻止越流、短流区的形成, 而床体底层的填料粒径较大, 渗透系数较高, 能够促进水流的通过, 从而避免该区域死区的形成.在此情况下, 整个床体流场分布趋于均匀, 提高的水力性能有利于充分发挥填料及其上附着的微生物与污染物的接触时间, 提高传质效率, 并促进微生物的功能分区, 提高净化性能^{[6, 7]}, 其结果与Bai等的^[8]研究结果一致.

高通量测序方法分析的18个样品中共得到945 864条高质量序列和20 823个OTUs(按97%的相似度划分), 涵盖15门、50纲、115目、230科及910属. 图 3为微生物在门类水平上的OTUs分布.从中看出, 3个人工湿地中, 变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰度相对较高; 其次分别为绿弯菌门(Chloroflexi)、疣微菌门(Verrucomicrobial)、厚壁菌门(Firmicutes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)和衣原体菌门(Chlamydiae), 它们分别占CW1总数的1%~10%之间; 绿菌门(Chlorobi)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、螺旋体菌门(Spirochaetae)、放线菌门(Actinobacteria)、Synergistetes以及芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)丰度极低( < 1%).比较而言, CW6和CW3的OTUs数量略低于CW1, 考虑原因主要是由于在现有污染物浓度下, 多层结构湿地系统对污染物有较好的净化效果, 使得污染物浓度沿水流方向呈现出从高到低的梯度代谢规律, 床体各处污染物种类相对简单, 从而有利于不同功能微生物的分区富集, 使其种类趋于集中^{[9, 10]}.有研究表明, 在水平潜流人工湿地中, 微生物群落数量随深度和排污口距离的增加而减少^[11].因而, 从床体中OUTs的分布上来看, 一般而言, 进水中较高的营养物质浓度及床体表层中丰富的溶解氧容易造成OTUs在数量上进水端高于出水端, 床体表层高于底层的趋势, 如图 3(b)、3(c)所示, 这与Button等^[12]的研究结果相似.但对比分析发现CW1在分布上[图 3(a)], 出水端OTUs数量高于进水, 表明该系统对污染物净化性能有限, 较多的污染物到达出水端, 造成出水端的OTUs数量较高.

图 3

Fig. 3

A1、A2、A3分别代表样点A处深度为10、30、50 cm的样品; B1、B2、B3分别代表样点B处10、30、60 cm深的样品; CW1、CW3、CW6分别代表 3个人工湿地; 下同 图 3 3个人工湿地中微生物OTUs分布 Fig. 3 Distribution of microbial OTUs in three constructed wetlands

从微生物数量及所占比例上来看(图 4和图 5), CW1、CW3及CW6中样品的平均序列数分别为318 125、315 769及302 462.变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)作为3个人工湿地系统中的主要菌门, 其在CW1中所占比例分别为61.54%及19.56%, 在CW3中分别占66.76%和13.27%, CW6中分别占66.06%和12.86%.变形菌门(Proteobacteria)作为3个CWs中最为丰富的菌门, 其多为专性或兼性厌氧代谢^[13].之前的相关研究表明, 变形菌门(Proteobacteria)中包含许多与有机物和无机物代谢(如：碳循环, 氮和硫循环)有关的菌属, 并且在人工湿地中广泛分布^[14~16].因而推测CW3和CW6对含氮污染物的去除率高于CW1可能与该系统中较丰富的变形菌门(Proteobacteria)有关.

图 4

Fig. 4

图 4 3个人工湿地中18个样点的序列数量及微生物群落分布 Fig. 4 Sequence number and microbial community distribution of 18 samples in three constructed wetlands

图 5

Fig. 5

图 5 3个人工湿地中每个菌门所占比例 Fig. 5 Proportion of every phylum in three constructed wetlands

人工湿地中含氮污染物的去除机理主要有硝化作用、反硝化作用以及氨氧化作用等^[17].与之相关的微生物主要有氨氧化真菌/细菌、硝化细菌(Nitrifying bacteria)和反硝化细菌(Denitrifying bacteria)^[18].通过分析发现, 变形菌门(Proteobacteria)中包含硝化菌属和绝大多数的反硝化菌属^{[19, 20]}, 硝化菌属有Nitrosococcus和Nitrosomonas, 硝化菌属序列数在3个系统(CW1、CW3和CW6) 中所占比例分别为0.25%、0.26%和0.51%(图 6); 而反硝化菌属主要包括Denitratisoma、Pseudomonas、Thauera、Comamonas、Azoarcus、Acidovorax、Rhizobium、Rhodobacter、Hydrogenophaga、Arcobacter、Thiobacillus、Sulfurimonas和Paracoccus, 3个系统中反硝化菌属序列数所占比例分别为12.5%、14.7%及19.1%(图 6), 它们对3个系统中含氮污染物的降解起决定性作用.如图 6所示, CW6中硝化细菌的丰度比例远远高于CW1和CW3, 这可能是CW6中氨氮去除率(83%)高于CW1(49%)和CW3(72%)的主要原因.此外, 3个系统中反硝化菌属丰度均高于硝化菌属说明硝化作用可能是制约该系统除氮效率的关键因素, 这可能是由于水平潜流人工湿地中的缺氧或厌氧环境更适合反硝化细菌生存所致, 此结果与Vymazal^[21]的研究结果一致.

图 6

Fig. 6

图 6 3个人工湿地中属水平的菌属丰度 Fig. 6 Relative abundance of the genus in three constructed wetlands

鉴于3个系统中变形菌门(Proteobacteria)的含量较高, 存在差异, 并且它与污染物的去除密切相关, 因而对其主要菌属群进行主成分分析.如图 7所示, 为3个人工湿地中变形菌门(Proteobacteria)的属水平PCA分析. PC1和PC2分别占变异总数的34.52%和17.93%, 占PC1比重大的前3种主成分分别为Zoogloea(90.5%, 正相关)、Thiobacillus(89.2%, 正相关)以及Aquabacterium(86.9%, 正相关), PC2的前3种菌属分别为Bdellovibrio(87.6%, 正相关)、Thauera(77.3%, 正相关)以及Azospira(59.4%, 正相关).其结果显示, 3个系统在变形菌门(Proteobacteria)属水平上的微生物群落分布无显著差异, 而就各湿地进出水端而言, CW3的进水端(A)和出水端(B)及CW6的进水端(A)和出水端(B)的群落结构分别在PC1水平上均呈现显著差异.样点A受Azospira以及Denitratisoma影响较大, 而样点B则更多地被Zoogloea及Thiobacillus影响. Zoogloea是一种有机物代谢菌属, Thiobacillus则是参与硫代谢的自养型反硝化菌属^[22], 而Azospira和Denitratisoma则是2种与氮代谢相关的异养反硝化菌属^{[23, 24]}, 它们的存在依赖于有机物和硝酸盐的浓度大小^[25]. CW3和CW6中进出水端较为明显的微生物群落代谢差异显示出含氮污染物(如NO₃^--N及NH₄⁺-N)和有机物在该系统不同床体区域存在一定降解梯度, 从而导致微生物功能的分区富集.比较而言, CW1的样品点主要集中在原点附近, 各样点间的微生物群落结构无显著性差异, 因而出现3个系统间的净化差异.这与多层结构对含氮污染物的净化效率高于单层结果一致.

图 7

Fig. 7

图 7 3个人工湿地中变形菌门(Proteobacteria)中属水平的主成分分析 Fig. 7 Principal component analysis of Proteobacteria at the genus level in three constructed wetlands

应用Bray-Curtis距离算法和Complete聚类法, 将3个系统中属水平上主要菌群中的高丰度和低丰度的物种分块聚集, 通过颜色梯度及相似程度来反映多个样本在各分类水平上群落组成的相似性和差异性.如图 8所示, 蓝色相似度最差, 红色相似度最高.结果表明, 最高相似度为18.78%, 整体相似度较低. Denitratisoma、Azospira、Pedosphaera和Thiobacillus均是反硝化菌属, 其中Denitratisoma、Azospira、Pedosphaera属于异养型, Thiobacillus是自养型, 它们的生存代谢依赖有机物浓度和硝酸盐浓度.从图 8中可以看出, 就整体而言, CW3和CW6中Denitratisoma、Azospira和Thiobacillus等反硝化菌属的丰度高于CW1, 这有助于提高CW3和CW6系统中硝态氮的去除.而对于单个系统, 3种菌属的丰度差异分别体现在CW3和CW6的进水端采样点(A)和出水端采样点(B), 其原因可能是由于进水中含有丰富的有机物和硝态氮使得异养反硝化菌属(Denitratisoma和Azospira)富集在CW3和CW6进水端, 相比之下, 由于CW3和CW6对有机物的高效降解使得其出水端以自养型反硝化菌属(Thiobacillus)为主.此外, CW1的6个采样点基本处于同一个丰度水平, 其结果与主成分分析结果一致.

图 8

Fig. 8

图 8 3个人工湿地中属水平微生物群落聚类Heatmap Fig. 8 Heatmap of microbial clusters in the genus in three constructed wetlands

(1) 从床体表层到底层渗透系数逐渐升高的多层结构潜流人工湿地对COD、TN、NO₃^--N及NH₄⁺-N的去除效果相较单层结构有显著提高.

(2) 多层结构人工湿地床体中微生物种群相对集中, 其OTUs数量略低于单层结构系统, 而变形菌门(Proteobacteria)作为优势菌门, 所占比例显著高于单层结构, 且其属水平上的硝化细菌与反硝化细菌在数量上均高于单层结构湿地.

(3) 主成分分析和丰度热图分析结果显示, 单层结构与多层结构人工湿地的微生物的种群结构在属水平上无显著差异, 但多层结构系统(CW3、CW6) 进出水间差异显著, 主要体现在变形菌门(Proteobacteria)的属水平上, 从而实现多层结构系统中污染物的高效降解.