2017, Vol. 38
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 湖北大学资源环境学院, 武汉 430062;
4. 湖南农业大学资源环境学院, 长沙 410128
, TANG Zhen-zhu1,3 , ZHU Zhen-ke1
, CAI Guan1,4 , GE Ti-da1 , WANG Jiu-rong1 , WU Jin-shui1
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. College of Resources and Environment, Hubei University, Wuhan 430062, China;
4. College of Resources and Environment, Hunan agricultural University, Changsha 410128, China
土壤胞外酶在生态系统中扮演着重要角色, 其活性高低反映土壤微生物新陈代谢状况[1], 及土壤进行特定生化反应的潜力, 对于保持土壤肥力和植物生产力极其重要[2].大多数胞外酶通过微生物响应环境条件的变化而被表达、释放到土壤中, 另一些则是通过微生物细胞破裂或根细胞脱落后释放进入土壤[3].土壤-微生物-作物根系互作系统组成根际微环境, 土壤胞外酶是其关键的中间介质[4, 5].根际土壤微环境养分通过根际或与菌根真菌结合转移到根表面, 显著影响作物养分获取和健康[6].研究表明, 水稻不同生育期的根系分泌物存在差异[7], 高浓度的根系分泌物和快速生长的植物会刺激根际微生物的活性[8], 导致根际土壤酶活性显著高于非根际土壤[9].另有报道水稻生长处于高峰期时, 水稻根系与根际土壤微生物进行营养竞争, 导致根际土壤微生物活性下降[10]; Muarry等[11]认为根系分泌物中酚酸物质能够减少微生物对其生长介质的利用, 进而降低土壤酶活性.随着分子生物技术在土壤研究领域的应用, 土壤酶和土壤微生物的研究成果较多, 但稻田氮肥施用对非根际土壤胞外酶活性的研究相对根际土壤较少, 且水稻根际微环境对土壤胞外酶活性的影响尚无统一认识[12].
碳是植物生长的能量元素, 氮则是植物生长的首要营养元素[13].土壤中氮的输入水平与可利用性对土壤碳循环起着关键的调控过程, 土壤碳周转取决于氮对微生物的影响[14, 15].土壤氮素输入改变着作物和植被的生物量, 扰动分泌酶的微生物, 进而影响酶的活性[16].土壤β-1, 4-葡萄糖苷酶(β-1, 4-glucosidase, BG)和β-1, 4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-1, 4-N-acetyl-glucosaminidase, NAG)在有机质分解中起重要作用[17, 18], 大量研究表明施氮对酶活性的影响在不同区域存在明显差异, 施氮能够显著增加土壤BG酶活性[19~21]、对BG酶活性无影响[22]或降低BG酶活性[23].同时, 施氮对NAG酶活性亦有促进或抑制作用[19, 21, 24].以往研究发现, 酶活性受到多种因素影响, 如土壤物理性质、土壤养分、土壤微生物、人为因素以及植物根系等[1].氮肥作为活性氮输入到土壤对胞外酶活性的影响在空间上有限, 但其在短期内剧烈扰动土壤微生物生物量, 长期施肥可以改变微生物的群落组成[23].因此, 为提高作物产量及氮肥利用效率, 系统开展氮素对稻田土壤根际与非根际胞外酶活性的研究显得尤为重要和迫切.
本文选取多年种植水稻的典型红壤, 采用盆栽实验, 利用根际袋法区分水稻根际和非根际土壤, 将水稻不同生育期根际与非根际土壤中BG酶和NAG酶作为研究对象, 从施氮、根际效应和水稻生育期等影响因素出发, 探讨其如何影响土壤微生物驱动的胞外酶活性变化过程, 试图寻找水稻生育期内根际和非根际土壤酶活性对氮肥施用的响应程度, 以期为稻田土壤氮肥利用提供必要的理论依据.
1 材料与方法 1.1 供试土壤概况供试土壤为多年种植水稻的典型红壤, 供试水稻为籼性常规水稻中早39.土壤样品采自中国科学院长沙农业环境观测研究站(113°19′52″E, 28°33′04″N, 亚热带典型湿润气候, 年平均温度17.5℃, 降雨量1 300 mm, 日照1 663 h). 2013年4月, 采集耕作层(0~20 cm)土壤, 湿润条件(含水率, 14.8%)下过4 mm尼龙筛除去植物残体, 一部分于4℃保存备用, 少部分风干用于测定基本理化性质, 所有指标测定方法均参照文献[25].用Mettler-toledo320 pH计按水土比1:2.5测定土壤pH; 阳离子交换量采用乙酸铵交换法测定; 土壤有机碳和全氮采用碳氮元素分析仪(VARIO MAX C/N, 德国)测定(干烧法); 土壤全磷采用氧化钠熔融法-紫外分光光度计(UV-2450, 日本)测定; 土壤机械组成采用比重计法测定.供试土壤基本理化性质如下：pH为5.56, 阳离子交换量(CEC)为7.76 cmol·kg-1, 土壤有机碳(SOC)13.48 g·kg-1, 全氮(TN)0.83 g·kg-1, 全磷(TP)为1.62 g·kg-1, 碳氮比(C/N)为16:24.1, 黏粒、粉粒和砂粒分别占68.36%、24.13%和7.51%.
1.2 实验设计土壤样品除去可见植物残体, 喷施NaH2PO4(按P含量计算30 mg·kg-1)和KCl(按K含量计算160 mg·kg-1)混合溶液作为基肥, 混匀后分装于盆钵(直径17.2 cm, 高16.7 cm)中, 每盆装入量相当于烘干重1.60 kg土壤, 根际袋(直径3.5 cm, 高15 cm; 孔径为30 μm)中装入相当于烘干重0.32 kg土壤.水稻种植实验设置2个处理：施氮肥(NH4)2SO4(按N含量计算100 mg·kg-1)和不施氮处理, 施氮处理中, 土壤装入盆之前, 氮肥一次性加入土壤并混合均匀, 为减少氮的损失, 每盆施入25 mg·kg-1硝化抑制剂DCD, 每个处理设3个重复.
1.3 测定方法在水稻移栽后的40 d和80 d(对应水稻拔节期和成熟期), 分别采集水稻根际和非根际土壤测定土壤含水量, 碳氮含量、微生物量和土壤酶活性等指标.土壤微生物生物量碳氮(MBC、MBN, mg·kg-1)含量采用氯仿熏蒸提取-碳自动分析法测定[26, 27], 同时, 测未熏蒸土壤对照, 得到土壤溶解性有机碳(DOC, mg·kg-1)含量.以熏蒸与未熏蒸土样提取的有机碳差值乘以转换系数KC(0.45) 得到土壤MBC含量.土壤NH4+-N采用0.5 mol·L-1 K2SO4溶液浸提, 流动注射仪(Fiastar 5000, 瑞典福斯)测定.土壤胞外酶活性测定采用96微孔酶标板荧光分析法[19], 多功能酶标仪(Scientific Fluoroskan Ascent FL, Thermo)在激发波长365 nm、发射波长450 nm的条件下测定, 最终用米氏方程拟合得到土壤酶的最大活性潜势(Vmax)、土壤酶亲和力(Km)和催化效率(Ka).
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JS：拔节期(jointing stage); MS：成熟期(maturity stage); BS：非根际土壤(bulk soil); RS：根际土壤(rhizosphere soil), 下同 图 1 水稻不同生育期根际与非根际土壤DOC、MBC、MBN和NH4+-N含量 Fig. 1 Contents of soil DOC, MBC, MBN, and NH4+-N in rice of various ages with rhizosphere and bulk soil |
采用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0进行数据处理和统计分析(P＜0.05), 不同处理显著性用One-way ANOVA(单因素方差分析)进行检验, 采用Duncan多重比较分析组间差异, RDA(冗余分析)和方差分解通过Canoco 5实现, Sigma plot 12.5作图, 图表中数据均为平均值±标准误.
2 结果与分析 2.1 水稻不同生育期根际与非根际土壤DOC、MBC、MBN、NH4+-N含量水稻土中可利用态N主要以NH4+-N形式存在.外源N肥的添加, 显著增加了水稻生长前期(拔节期)土壤中NH4+-N的含量, 随着水稻的生长NH4+-N逐渐被消耗, 且根际土中NH4+-N的含量显著低于非根际土; 非根际土中NH4+-N的含量逐渐由24.7 mg·kg-1降低至9.1 mg·kg-1, 根际土中NH4+-N的含量逐渐由9.9 mg·kg-1降低至5.5 mg·kg-1(图 1).施氮在增加土壤中可利用态N含量的同时, 降低了土壤MBN的量; 施氮处理, 水稻拔节期根际和非根际土壤MBN含量分别为14.0 mg·kg-1和17.4 mg·kg-1, 在成熟期随着土壤NH4+-N的含量的降低, 土壤MBN含量增加至约30 mg·kg-1.
水稻生长过程中, 土壤DOC含量显著增加, 根际土壤中DOC含量显著高于非根际土壤, 施氮处理中根际土壤DOC含量是非根际土壤DOC的1.6~3.1倍.水稻拔节期到成熟期, 土壤MBC显著降低, 且根际土壤中MBC显著高于非根际土MBC.
2.2 水稻不同生育期根际与非根际土壤酶活性对施氮的响应氮肥添加以及水稻生长期都能影响根际和非根际土壤中碳氮转化相关酶活性的变化, 根据米氏方程拟合得到的土壤酶的最大活性潜势(Vmax)及其土壤酶亲和力(Km)(图 2和表 1).氮肥添加使拔节期土壤BG酶活性相对于不施氮处理降低了7.4~13.5 nmol·(g·h)-1, 而使成熟期BG酶活性增大了7.0~31.4 nmol·(g·h)-1, 同时根际与非根际土壤中BG酶活性, 也随水稻的生育期而发生相应的变化.相对于不施氮处理, 施氮使水稻成熟期非根际土壤NAG酶活性增加了1.1倍, 根际土壤降低了0.3倍.水稻不同生育期的催化效率(Ka)对施氮有不同程度响应, 施氮土壤成熟期BG酶催化效率显著高于拔节期, 成熟期施氮处理非根际土壤的BG酶催化效率显著高于根际土壤(P＜0.05).施氮处理水稻成熟期非根际土壤NAG酶催化效率显著高于根际土壤(P＜0.05).
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图 2 水稻根际与非根际土壤胞外酶活性动力学 Fig. 2 Enzyme kinetics of the BG and NAG enzymes in the rhizosphere and bulk soil |
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表 1 水稻不同生育期土壤酶活性动力学参数 Table 1 Kinetic parameters (Vmax, Km, and Ka) of the soil extracellular enzymes in the rhizosphere and bulk soil |
2.3 水稻生育期和根际效应对土壤胞外酶活性的影响
对影响土壤酶活的三因素(施氮、根际效应、生育期)进行多重比较(表 2)发现, 施氮和生育期的交互作用对BG酶活性影响显著, 水稻生育期极显著地影响了土壤BG酶活性; 施氮、根际和生育期及其交互作用均对NAG酶活性有极显著影响.为进一步分析施氮、根际效应、生育期对水稻土壤酶活性的影响效果, 进行了方差分解(图 3), 得到根际因素对酶活性的解释率为19.3%, 水稻生育期对酶活性的变异解释率为5.7%.
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表 2 施氮、根际效应和不同生育期对土壤胞外酶活的多重比较 Table 2 Effects of nitrogen application, rhizosphere effect, and different growth stages on the activities of two kinds of extracellular enzymes in soil |
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图 3 三组解释变量(水稻生育期、施肥处理、根际效应)对水稻土壤酶活性变化贡献的韦恩图分析 Fig. 3 Venn diagrams describing the partitioning of the variation of relative soil enzyme activities among three sets of explanatory variables |
水稻-土壤系统中土壤酶活性的变化是多因素共同影响的结果.对拔节期和成熟期根际土壤基本指标和酶活性进行Pearson相关分析发现(表 3), NH4+-N与土壤溶解性有机碳(DOC)表现出极显著的负相关性(R=-0.664, P＜0.01), 土壤微生物生物量碳(MBC)与土壤微生物量氮(MBN)表现出极显著的负相关性(R=-0.648, P＜0.01);同时非根际土壤MBC与NAG酶活性呈显著正相关, 而和BG酶活性无显著相关关系.对影响水稻根际和非根际土壤胞外酶活性的主要因子进行RDA分析(图 4), 发现土壤MBC和DOC含量主要影响水稻根际土壤胞外酶活性; 而非根际土壤中酶活性的变化主要受MBN和NH4+-N的影响.
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表 3 水稻生育期根际土壤酶活和土壤基本指标的Pearson相关分析 Table 3 Pearson correlation analysis of rhizosphere soil enzyme activity and basic index across rice growth stage |
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图 4 影响酶活性因素的RDA分析 Fig. 4 RDA of influencing factors on enzyme activities |
氮素是作物生长和微生物繁殖必须的养分元素, 水稻-土壤系统中水稻与微生物对氮素具有竞争关系, 同时微生物也能够通过分泌碳氮转化相关的胞外酶来分解土壤有机质中的氮素, 从而实现对氮素的反调控, 达到土壤微生态物质平衡, 满足水稻、微生物生长的计量学需求[14, 28].本研究中相对于不施氮处理, 氮肥添加增加了成熟期BG酶活性, 而使水稻成熟期根际土壤NAG酶活性降低了0.3倍.这表明, 氮肥添加后土壤中易利用态的N素含量增加(图 1), 促进了微生物对土壤碳的利用, 因而增加了碳转化酶活性(BG), 而土壤外源矿质态N素的供应, 降低了微生物对土壤有机质中N的依赖, 从而降低了氮转化酶活性(NAG)[29]. Pearson相关分析结果表明, 土壤NH4+-N与DOC表现出极显著的相关性, 这说明外源氮素是调控土壤碳源供给和微生物活性的关键因子.与本研究一致, 梁国鹏等[21]发现施氮能显著促进夏玉米生育期内根际土壤BG酶活性.但汪华等[10]发现施氮在水稻生长旺盛期会降低土壤酶活性.氮肥的施加尽管对微生物量影响显著, 但是方差分解结果(图 3)表明, 施氮效应对酶活性的解释率仅为0.2%, 这一方面可能是土壤酶来源于微生物分泌物, 氮肥施用改变土壤的养分状况, 改善作物生长的营养条件, 进而影响酶活性[21, 30]; 另一方面, 土壤中酶活性受多种生物和非生物因素的影响, 水稻生长不同生育期内对养分的需求不同而导致土壤中养分重分配[1, 31], 因此, 氮素对土壤酶活性的影响并不是唯一因素, 可能还有其他因素共同影响着土壤酶活性.
3.2 根际效应对水稻不同生育期土壤酶活性的影响根际微环境是土壤微生物活跃区域, 也是土壤酶活性的敏感区域, 酶活性对土壤环境变化的响应明显[4].本研究中, 相对于不施氮处理, 施氮处理的水稻成熟期非根际土壤的BG和NAG酶催化效率显著高于根际土壤, 这表明根际区域较高的有效态碳氮含量降低了微生物碳氮水解酶的分泌[32].同时, 水稻生长至成熟期时, 根际分泌物持续扩散到非根际区域, 作为易降解的碳氮化合物(能够诱导蛋白酶合成的氨基酸和短肽)的来源, 增加了非根际土壤NAG酶活性[19], 并加快土壤酶对土壤有机质中碳氮的分解作用.在土壤-微生物-根系互作系统中, 为保证作物正常的养分需求, 微生物加强对非根际土壤中几丁质和肽聚糖的分解, 再通过菌根真菌供作物吸收利用[6, 33], 从而使成熟期非根际土壤中有较高的NAG酶活性.
本研究发现根际因素对土壤酶活的解释率为19.3%, 是造成酶活性差异的主要因素.土壤酶活性是指示土壤微生物活性的指标之一, 土壤酶活性不仅与微生物数量、功能基因表达等微生物本身性质密切相关, 还与土壤环境因子变量紧密联系, 如土壤水分含量、pH、Eh、金属离子含量等, 所以土壤根际效应、生育期和施氮等指标不能100%解释土壤酶活性的变异, 这3个变量对于土壤酶活性的变化的总的贡献率(或是解释率)只有23.9%. Pearson相关分析(表 3)发现根际土壤BG酶活性与MBC含量呈显著正相关, 而非根际土壤BG酶活性与MBC含量无显著相关, 这表明水稻生育期内非根际土壤BG酶活性可能受根际理化因素影响较大, 掩盖了非根际土壤BG酶活性与MBC的关系.根际和非根际土壤NAG酶活性均分别与DOC含量呈显著负相关, 而且根际土壤NH4+-N含量低于非根际土壤, 这表明水稻根际沉积能够刺激微生物生长, 水稻与土壤微生物对养分的竞争作用减少矿质养分在根际区域的可利用态含量[34]; 根际区域内根系分泌物不同程度的分解转化过程, 对微生物生长有不同程度的刺激作用, 也影响着土壤微生物胞外酶的分泌及其活性[35, 36].
3.3 生育期对水稻土壤酶活性的影响本研究中从水稻拔节期到成熟期施氮处理中, 土壤BG酶和NAG酶活性均逐渐降低; 多重比较(表 2)结果显示水稻生育期对BG酶活性的影响极显著, 施氮和生育期的交互作用对BG酶活性也有显著性影响; 同时, 水稻生育期、施氮和根际效应均极显著的影响了NAG酶活性.这与曾路生等[7]的研究结果一致, 水稻在不同生育期内对养分的需求不同, 其生长过程是土壤-微生物-水稻相互作用的结果[7, 29].施氮处理中, 随着水稻的生长土壤NH4+-N含量显著降低, 而土壤MBN显著增加, 这表明水稻生长旺盛期由于根际分泌能力较强, 微生物生长繁殖也加强, 同时水稻植株对于养分的竞争吸收, 使土壤微生物增强胞外酶的分解, 水解土壤有机质为水稻和微生物提供更多的养分与能量[37]; 水稻成熟期根际的分泌作用下降, 同时竞争吸收养分元素的能力也在减弱, 所以微生物胞外酶活性随之下降.
4 结论(1) 施氮、根际效应和水稻生育期均对土壤β-1, 4-葡萄糖苷酶(BG)和β-1, 4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性有不同程度的影响, 但根际效应是其主要影响因素, 施氮和水稻不同生育期对土壤胞外酶活性的影响尽管较弱但不可忽略.
(2) 水稻生育期、施氮和根际效应及其交互作用均对NAG酶活性有极显著影响, 而施氮和生育期则显著影响了土壤BG酶活性.
(3) 土壤MBC和DOC含量主要影响水稻根际土壤胞外酶活性; 而非根际土壤中酶活性的变化主要受MBN和NH4+-N的影响.
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