20世纪90年代, 荷兰Mulder等发现了一种新型脱氮微生物：ANAMMOX菌^[1](anaerobic ammonium oxidation), 这类细菌可以在厌氧环境下以亚硝酸盐为电子受体把氨氧化为氮气, 同时生成部分硝酸盐.近年来, ANAMMOX菌的代谢途径多样性也颇受关注.据文献报道, ANAMMOX菌不仅可以利用NO₂^-为电子受体, 也可以利用Fe^3+[2]、NO^-[3]₃、N₂O^[4]等氧化NH₄⁺.另外, ANAMMOX菌还可以利用单质铁^[5]、小分子有机酸^[6]等将NO₂^-或NO₃^-还原为NH₄⁺. 2001年, Fdz-Polanco等^[7]在利用颗粒活性炭为载体的厌氧流化床反应器处理糖蜜酒精废水时发现NH₄⁺与SO₄^2-发生了同步转化(simultaneous removal of ammonium and sulfate, SRAS), 推断该反应器中发生了以SO₄^2-为电子受体的ANAMMOX反应, 在该过程中NH₄⁺与SO₄^2-首先生成中间产物S^2-、NO₂^-; 随后NO₂^-分别与S^2-和NH₄⁺进行硫自养反硝化和常规ANAMMOX, 反应终产物为N₂和S⁰[式(1)]：

(1)

随后几年, 又有十多位研究者分别在有机^[8~14]和无机^[15~28]培养条件下观察到了SRAS现象, 并认为存在硫酸盐还原氨氧化这一生物反应.如果可以证实硫酸盐还原氨氧化的存在, 那么将会丰富人们对地球氮硫循环的认识, 同时也为一种新型脱氮除硫技术提供了理论依据.

(2)

(3)

自硫酸盐还原氨氧化提出以来, 大多数研究者都沿用了Fdz-Polanco等^[7]推测的总反应方程式[式(1)], 但是对SO₄^2-还原的中间产物尚存分歧. 2008年, Liu等^[15]首次以(NH₄⁺)₂SO₄为唯一基质, 通过接种ANAMMOX菌研究SO₄^2-与NH₄⁺的转化机制, 他认为SO₄^2-还原的中间产物是S⁰, 而不是Fdz-Polanco等^[7]所推测的S^2-[式(2)].文献[25~27]在无机条件下的研究中发现：出水NO₃^-浓度显著高于常规ANAMMOX反应的NO₃^-理论产生量, 并据此推测存在由NH₄⁺和SO₄^2-直接反应生成NO₃^-的可能[式(3)].除此之外, 多数研究者^[17~23]实验过程中都观察到氨氮过量转化的现象, 导致氮硫摩尔转化比[n(NH₄⁺)/n(SO₄²)]明显大于理论推测值2.部分研究者^{[17, 19, 22]}的实验结果表明：在实验过程中SO₄^2-并未发生明显转化或者NH₄⁺与SO₄^2-的转化不完全同步.不仅如此, 多位研究者^{[19, 21, 27, 28]}在连续流实验后期SO₄^2-停止转化, 但NH₄⁺的转化量并未减少.

所以, 为了对NH₄⁺与SO₄^2-的转化机制做出更合理的阐述，针对以上实验现象与推测机制之间不相符的问题, 本文在厌氧环境下对NH₄⁺与SO₄^2-能否发生同步转化以及所观察到的NH₄⁺与SO₄^2-同步转化是否为两者之间发生的反应做了进一步探究.

1 材料与方法 1.1 实验装置

实验分为CFSTR(continuous flow stirred tank reactor)、Batch 1(batch experiment)、Batch 2. CFSTR与Batch 2采用发酵罐(No. Labfors 5 Bacteria, Switzerland), 总体积3.6 L, 反应器设有机械搅拌装置、水浴夹套、pH及ORP在线监测探头. CFSTR中以含铁丝骨架的无纺布为填料[图 1(a)]. Batch 1采用碘量瓶料[图 1(b)], 总体积0.63 L, 瓶口用橡胶塞加水封保持密闭, 磁力搅拌, 通过水浴加热保持瓶内温度.所有反应器外部用遮光布遮盖, 避免光照对ANAMMOX菌活性的抑制.

1.2 接种污泥及配水

接种污泥为本课题组培养的成熟的亚硝酸盐型ANAMMOX培养物, 原反应器有效体积60 L, 脱氮速率为2.3 kg ·(m³ ·d)^-1, 粒径1.1~1.6 mm.进水采用人工配水, NH₄⁺以NH₄Cl形式提供, SO₄^2-以Na₂SO₄形式提供, 另外添加NaHCO₃、KHCO₃各500 mg ·L^-1维持合适的pH值.基本培养液成分KH₂PO₄为27 mg ·L^-1, CaCl₂为138 mg ·L^-1, MgCl₂ ·6H₂O为200 mg ·L^-1, 微量元素Ⅰ为1.0 mL ·L^-1, 微量元素Ⅱ为1.25 mL ·L^-1.微量元素Ⅰ组成：EDTA 5000 mg ·L^-1, MgCl₂ ·6H₂O 5000 mg ·L^-1.微量元素Ⅱ的组成如表 1所示.

1.3 条件控制

运行过程部分参数控制如表 2. CFSTR、Batch 2接种污泥初始浓度MLSS为1.65 g ·L^-1, MLVSS为1.04 g ·L^-1; Batch 1接种污泥初始浓度MLSS为2.84 g ·L^-1, MLVSS为1.79 g ·L^-1, MLVSS/MLSS为0.63.进水pH为7.80~8.20. CFSTR实验进水除氧, 反应器密封, Batch实验进水后采用惰性气体氩气吹脱20 min除氧.

1.4 分析监测指标及数据处理方法

NH₄⁺-N采用纳氏试剂分光光度法, 硫化物采用亚甲基蓝分光光度法, MLSS和MLVSS采用重量法, 以上所有方法参照文献[29]. NO₂^--N、NO₃^--N、SO₄^2--S均采用离子色谱法(Dionex IonPac^TM AS22, USA).反应器内收集到的黄色固体、出水含有的黑色固体以及出水形成的白色胶体经022 μm纤维膜过滤后采用场发射扫描电镜(Hitachi S-570, Japan)进行元素分析; 出水白色胶体成分经过022 μm纤维膜过滤后得到的固体在三氯化碳有机溶剂中超声溶解后采用气相色谱-质谱联用仪(HP/AGILENT6890/5973NMS, USA)进行物质的定性分析.

氨氮过量转化量AEAC(The amount of excess ammonium conversion)为NH₄⁺-N实际转化量与理论转化量之差(以NO₂^--N转化量为基点计算), 其计算见公式(4); n(NH₄⁺)/n(SO₄^2-)为NH₄⁺-N与SO₄^2--S的摩尔转化比, 其计算见公式(5).

(4)

(5)

2 结果与分析 2.1 NH₄⁺与SO₄^2-的同步转化

CFSTR在主要基质为NH₄⁺、SO₄^2-的无机环境下, 通过模拟前期研究者^[24~28]的实验条件对NH₄⁺与SO₄^2-同步转化过程中反应特性进行研究.实验过程不曝气, 反应器密封.运行过程中ORP在线监测值为-25 mV±5 mV, 进水pH为7.80~8.20, 出水pH为7.50~7.70.在1~18 d, NH₄⁺-N转化量逐渐增加, 随后稳定在39 mg ·L^-1左右, 而此阶段SO₄^2-没有明显转化, 这与很多数研究者^[17~20]实验启动过程的现象是一致的; 在19~23 d阶段SO₄^2--S出水浓度略大于进水, 而NH₄⁺的转化量没有变化, 这种NH₄⁺独立转化的现象在相关报道中曾多次出现^{[15, 19, 21, 25, 28, 30]};实验后期出现NH₄⁺与SO₄^2-浓度同时降低的现象, 在24~30 d阶段SO₄^2--S平均转化量约4.5 mg ·L^-1, NH₄⁺-N平均转化50.8 mg ·L^-1, 出水NO₂^--N平均浓度约20 mg ·L^-1.同时填料表面附着有黄色固体(图 2), 这与前期研究者所观察到的实验现象相同^[24~28], 并且相关研究者据此推测NH₄⁺与SO₄^2-之间发生了反应[式(1)].

2.2 严格厌氧环境下NH₄⁺与SO₄^2-的转化

从CFSTR的实验结果判断, 与多数研究者一样, 氨氮出现明显的过量转化.所以, 无法断定所观察到的NH₄⁺与SO₄^2-同步转化是两者之间进行的反应.对黄色固体采用前期研究者相同的方法进行定性分析, 其结果与前者一致(黄色固体溶于酒精而不溶于水).为了进一步检验前期的推测, 对上述黄色固体进一步做元素分析发现(表 3)：黄色固体主要成分是Fe元素, 结果并不符合Fdz-Polanco等^[7]与Liu等^[15]所推论的反应机制[式(1)].另外, 在填料中不含铁丝的对比实验中没有观察到有黄色固体的产生, 据此推测前期研究者^[24~28]所观察到的黄色固体很可能不是单质硫, 而是含铁的化合物, 该化合物很可能是由于无纺布填料中的铁丝骨架在水中被腐蚀而产生以及进水微量元素铁的积累, 说明NH₄⁺与SO₄^2-的同步转化可能并不是两者之间的反应.

为了排除外界因素对实验结果造成的影响, 本研究的Batch 1实验采用进水除氧、反应器充满的方式以提供更为严格的厌氧条件.结果如图 3(a)所示, 在为期63 d的实验过程中, SO₄^2--S出水浓度先由146.4 mg ·L^-1降至112.9 mg ·L^-1, 但随后逐渐上升至145.5 mg ·L^-1, 平均转化量约24.6 mg ·L^-1, 然而在整个实验过程中NH₄⁺浓度始终没有明显变化.这说明在严格厌氧环境下, NH₄⁺不会发生转化, 只有SO₄^2-发生转化, 两者并非同步转化.受此启发, 在Batch 2实验中依旧采用发酵罐, 与CFSTR不同的是：将反应器完全充满, 以形成严格厌氧的反应环境.以此方式运行的几个周期中, ORP在线监测值会从实验开始后经过6 h左右从-25 mV±5 mV降低到-490 mV±5 mV, 并在随后的过程中稳定在这一数值.结果如图 3(b)：NH₄⁺同样没有发生转化, SO₄^2-发生了明显的转化, SO₄^2--S平均转化量约11.4 mg ·L^-1.并且实验过程中还发现Batch 1与Batch 2在第一个周期内污泥颜色均由红棕色变为黑色, 说明在严格厌氧环境下NH₄⁺并未与SO₄^2-反应生成NO₂^-, 导致ANAMMOX菌因基质不足而逐渐衰亡.另外, 从Batch 1与Batch 2中各自SO₄^2-转化量及所接种污泥量来看, 较高的污泥浓度有助于促进SO₄^2-的转化.

为进一步探究SO₄^2-的转化产物, 对Batch 1、Batch 2的出水进行检测, 其中有明显的S^2-生成, 其浓度随水样放置时间的延长而降低, 过程中伴随着白色胶体的产生(图 4). Prachakittikul等^[21]在研究中同样观察到含有硫元素(高温氧化红外线吸收检测)的白色胶体产生, 并据此推测白色胶体是通过NH₄⁺与SO₄^2-反应产生的单质硫.本实验中对收集到的白色胶体进行元素分析和气质检测, 结果表明, 白色胶体中含有大量的硫元素(表 3) 及多种含硫有机物(表 4);定性分析发现, 该白色胶体可以被氧化、加入NaOH会形成白色絮状体, 但是不溶于大多数有机溶剂(图 4), 说明SO₄^2-的还原产物是S^2-, 且本实验及Prachakittikul等^[21]对固相中所检测到的硫元素可能并不是单质态硫.

2.3 NH₄⁺与SO₄^2-转化机制

CFSTR与Batch 2在同一反应器不同方式运行条件下ORP出现明显差别.在充满状态下的Batch 2内ORP值为-450 mV, 远远低于CFSTR的ORP值(-25 mV).再对比Batch 1与Batch 2, 两者分别在碘量瓶和发酵罐中进行, 通过水封和使溶液完全充满反应器的方式保证了严格厌氧的条件, 结果表明：整个实验过程中NH₄⁺不会转化, 但SO₄^2-发生明显转化(转化率高达30%), 二者不能发生同步转化.

由上述实验结果推测：一方面, 反应器运行方式所造成的微氧环境是导致CFSTR中NH₄⁺转化的原因, 并非是以SO₄^2-为电子受体进行的ANAMMOX反应, 这也是为何多数研究中会观察到NH₄⁺独立转化的现象.因此当反应器运行方式改变, 以提供严格厌氧的条件时, Batch 1和Batch 2中NH₄⁺完全不转化; 另一方面, SO₄^2-转化所需要的电子供体极有可能是接种微生物因衰亡所释放的有机物, 进而导致SO₄^2-异养还原.从表 5中部分活性污泥模型动力学参数可以得知, 微生物衰亡率(衰亡率：微生物衰亡释放的有机物与微生物内源呼吸消耗的有机物总和占总的生物量的比例)一般在0.03~0.3 d^-1.通过计算得出, 在Batch 1实验中微生物衰亡释放的有机物完全可以满足SO₄^2-转化的需要[图 3(a)].换言之, 在SRAS过程中NH₄⁺与SO₄^2-是各自独立发生的转化, 而不是两者之间直接反应.

3 讨论 3.1 NH₄⁺与SO₄^2-转化的相关性

根据Fdz-Polanco等^[7]与Liu等^[15]所推测的总方程式可以看出, 基质是按照n(NH₄⁺)/n(SO₄²)为2的计量比进行的同步转化, 但是大多数研究者的实验结果并不符合这一条件, 张蕾等^[22]在其整个实验过程中SO₄^2-基本没有转化, 但NH₄⁺却有一个稳定且明显的转化量, 这种现象在其他研究者^{[17, 19]}的实验中普遍存在. Prachakittikul等^[21]对批试实验中NH₄⁺与SO₄^2-浓度的变化过程研究表明, 在6~16 h期间低价态硫被氧化为SO₄^2-, 同时NH₄⁺也有少量转化, 而这两个过程都需要电子受体.这种不同步的现象在Liu^[15]的批试实验中也同样出现过：虽然从其整个周期来看n(NH₄⁺)/n(SO₄^2-)接近2, 但是在这个过程中NH₄⁺与SO₄^2-并不是完全同步转化, 在8~9 d, SO₄^2-几乎不转化的情况下NH₄⁺-N依然转化了近40 mg ·L^-1.另外, 多位研究者^{[19, 21, 27, 28]}在长期的连续流实验中都出现了实验后期SO₄^2-停止转化, 但NH₄⁺转化量并未减少的实验现象.

从表 6可以看出, 多数研究中在SRAS阶段, n(NH₄⁺)/n(SO₄^2-)远大于理论推测值2, 即NH₄⁺-N过量转化的现象普遍发生.其实氨氮的过量转化不仅发生在SRAS过程, 除了文献[21, 24]接种污泥后直接采用NH₄⁺、SO₄^2-为唯一基质进行研究之外, 还有部分研究者在启动过程中经过了以NO₂^-为电子受体的常规ANAMMOX阶段.从表 7中可以看出, 常规的ANAMMOX阶段同样发生了氨氮过量转化, 并伴随着过量的NO₃^-产生.多数研究者在常规ANAMMOX阶段过量转化的NH₄⁺的量与SRAS阶段所转化的NH₄⁺的量并没有明显差别.

从以上分析得知, 在SRAS相关研究中NH₄⁺的转化与SO₄^2-的转化并无必然的联系, 因为在常规的ANAMMOX阶段NH₄⁺本身就有一定的过量转化, 并且其过量转化量与SRAS阶段所转化的NH₄⁺的量并无明显差别.结合多数相关研究者的实验过程中普遍发生NH₄⁺独立转化的现象, 说明本实验及相关文献中SRAS过程NH₄⁺的转化与SO₄^2-的转化并无直接关系, 这也是为何不同研究者所得到的n(NH₄⁺)/n(SO₄^2-)差别很大, 且多数明显大于推测值2.

3.2 NH₄⁺与SO₄^2-转化的电子受体/电子供体来源

如果在ANAMMOX反应系统中有少量氧气的参与, 一部分NH₄⁺就可以通过短程硝化反应生成NO₂^-, 继而与剩余的NH₄⁺通过ANAMMOX反应实现脱氮(CANON工艺中NH₄⁺转化途径).这会导致观察到的n(NO₂^-)/n(NH₄⁺)小于1.32, 即NH₄⁺过量转化(表 7).另外, 对比CFSTR与Batch 2的实验结果可知, 在排除氧可能对实验的影响之后, 两者的ORP出现明显的差别, 在严格厌氧条件下(Batch 2), ORP达到-490 mV±5 mV, 同时NH₄⁺不再发生转化, 而CFSTR中的ORP为-25 mV±5 mV.可以推测在n(NO₂^-)/n(NH₄⁺)小于1.32的常规ANAMMOX反应中过量转化的NH₄⁺及SRAS过程转化的NH₄⁺所需要的电子受体是来源于氧.另外, Prachakittikul等^[21]对SRAS的AnSBR系统中的菌种检测发现其中有明显的AOB(Nitrosomonas sp.)存在, 说明在AnSBR系统中含有AOB所需要的基质O₂.实验过程中不同的操作方式和实验装置, 就有可能提供微氧环境, 比如：机械搅拌装置与反应器之间密闭性不好致使搅拌过程中氧气渗入, 而且机械搅拌会使得反应器处于一个微小的晃动状态, 加剧对密封装置的破坏; UASB回流过程会把上部含溶解氧的出水重新回流到反应器底部, 同时回流过程会造成反应器上部空间变化引起内外气压差, 使得外部空气更容易进入到反应器等.

笔者对各研究者实验中NH₄⁺-N的转化量与所需要的空气体积之间的关系采用CANON工艺中NH₄⁺-N转化途径的方式进行计算.从表 8可以看出, 在绝大多数的研究中仅需要比反应器体积还少的空气即可观察到实验中NH₄⁺-N的转化量.另外, 按照式(6)(CH_1.8O_0.5N_0.2：微生物组分的分子式)来计算SO₄^2-异养还原反应过程所需要的生物量, 通过表 8可以看出大多数研究者在SRAS阶段SO₄^2-转化所需要的生物量占接种生物量的比例(理论需要衰亡率)与活性污泥模型中自养菌的内源代谢呼吸速率以及衰减常数都很接近, 说明在相关文献以及本实验中所发生的SO₄^2-转化是来源于微生物衰亡释放的有机物提供的电子供体进行的异养还原, 并且Prachakittikul等^[21]在SRAS系统中检测到有硫酸盐还原菌(Desulfacinum subterraneum)存在.这也是为何很多研究在实验后期SO₄^2-不再发生转化的原因, 因为随着微生物的衰亡及内源呼吸, 系统中的生物量会越来越少, 以致于到后期系统中不再有电子供体还原SO₄^2-, 进而导致SO₄^2-不再发生转化.

(6)

3.3 NH₄⁺与SO₄^2-的生物反应存在可能性分析

Liu等^[22]认为SRAS过程中的功能菌为Anammoxoglobus sulfate和Planctomycetales, 其中Anammoxoglobus sulfate催化NH₄⁺、SO₄^2-反应产生S⁰、NO₂^-[式(2)], Planctomycetales利用生成的NO₂^-进行常规的ANAMMOX, 但是Anammoxoglobus sulfate所催化的式(2) 是一个Δ_rG为正(Δ_rG=317.4 kJ ·mol^-1)的反应, 这与热力学定律相悖. 2010年, 蔡靖等^[34]在以NH₄⁺、SO₄^2-为基质, 接种消化污泥的反应器^[29]中, 经反复分离纯化获得了1株硫酸盐型厌氧氨氧化菌, 并对其功能特征及最适生长条件做了相应研究, 他认为该菌可以在无氧条件下同时去除氨氮和硫酸盐, 具有硫酸盐型厌氧氨氧化活性.文献[34]是目前唯一一篇关于单一菌种实现SRAS过程的研究, 所以, 无法排除自然界中可能会有某些微生物可以进行以SO₄^2-为电子受体氧化NH₄⁺的生物反应, 不过从本课题组的实验结果及相关研究中的实验现象来看, 大多数学者所观察到的SRAS过程并不是两者直接反应的结果.

4 结论

(1) 在接种ANAMMOX培养物、充满并采取水封的Batch实验中NH₄⁺不发生转化, SO₄^2-会有明显转化, 转化量与接种生物量有关, 在此过程中污泥逐渐变黑, 出水含有SO₄^2-的还原产物S^2-.表明在严格厌氧环境下NH₄⁺与SO₄^2-之间不会发生反应.

(2) 通过分析推断在本研究以及相关文献中观察到的NH₄⁺与SO₄^2-同步转化是各自独立发生的转化, 而不是NH₄⁺与SO₄^2-之间发生的反应.反应器运行和操作过程造成的微氧环境是导致NH₄⁺转化的原因; 微生物内源呼吸以及胁迫环境下衰亡释放的有机物为SO₄^2-异养还原提供电子.